全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2016, 52 (2): 216–224　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0496216
收稿 2015-09-15　　修定 2015-12-23
资助 国家自然科学基金(31372050)和山东省现代农业产业技术体
系水果产业创新团队−栽培与设施装备(SDAIT-03-022-05)。
* 共同第一作者。
** 共同通讯作者(E-mail: lilingsdau@163.com; dsgao@sdau.
edu.cn)。
油桃花芽休眠解除过程中MAPK家族基因表达分析
杜培勇*, 王东岭*, 谭秋平, 刘利, 付喜玲, 陈修德, 肖伟, 李冬梅, 朱翠英, 李玲**, 高东升**
山东农业大学园艺科学与工程学院, 作物生物学国家重点实验室, 山东果蔬优质高效生产协同创新中心, 山东泰安271018
摘要: 促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)在脱落酸(abscisic acid, ABA)诱导活性氧(reactive
oxygen species, ROS)产生中起重要作用, 然而MAPK家族相关基因在花芽休眠解除过程中的表达变化尚不清楚。本研究以
六年生‘中油四号’油桃花芽为材料, 利用NCBI找出桃树上的MAPK同源基因, 测定了MAPK家族相关基因的组织表达特性
及休眠解除过程中在花芽中的基因表达水平。结果表明: 桃中有15个MAPKs, 通过系统进化分析分为A、B、C、D四个组;
15个MAPKs基因在花芽、根、枝、叶、花、果实、种子中均有表达, 其中PpMPK2在种子中表达量最高, 其次是花芽, 在
其他组织中表达量较低, PpMPK11在花中表达量较高, 在其他组织中均较低; MAPKs基因中6个MAPKs在花芽休眠解除过
程中呈显著的表达下调, 与休眠解除的进程一致。我们推测有MAPKs基因可能参与花芽休眠解除的调控。
关键词: MAPK; 油桃花芽; 休眠解除; 组织表达; 基因表达
芽休眠是一种复杂的生命现象, 是植物经过
长期演化而获得的一种对环境及季节性变化的生
物学适应性, 植物一经被诱导进入休眠则必须满
足一定的需冷量以解除休眠, 才可正常生长发育,
否则会引起下一阶段生长发育障碍, 花器官畸形
或严重败育, 从而影响果实的产量和品质。植物
就在生长和休眠中周期性交替, 这种生物学特性
对物种的生存繁衍具有特殊的生物学和生态学意
义(高东升等2001)。休眠性状的表达是一系列基
因表达的综合体现, 涉及到一系列复杂的生理生
化反应和信号转导过程。目前落叶果树芽休眠的
研究主要涉及植物激素(Nagar和Sood 2006)、钙信
号(王海波等2008)及碳水化合物代谢(王慧等2011)
等生理生化变化和环境响应(Cooke等2012)、激素
响应 (Zheng等2015)、活性氧 (强妮花和惠伟
2011)、DAM (Zhu等2015; Saito等2015)等相关基
因的表达调控。众所周知, 多年生落叶果树的激
素水平及其平衡变化对于休眠的进程起着至关重
要的作用(高东升等2001)。脱落酸(abscisic acid,
ABA)作为一种重要的植物激素, 调控种子休眠、
芽休眠, 其在花芽组织内的含量变化决定着休眠
的进程(段成国等2004)。在桦树、葡萄和土豆中
的研究表明芽休眠解除之前总是随着内源ABA水
平的下降(Koussa等1994; Li等2004; Destefano-Bel-
trán等2006); ABA可以诱导包括H2O2在内的活性氧
(reactive oxygen species, ROS)的产生, 并且ROS在
ABA的信号转导中是重要的中间组件(Jiang和
Zhang 2002)。另外, 高东升等(2002)研究发现休眠
期芽内H2O2含量基本呈稳步上升后急剧下降的趋
势, 且H2O2的下降与自然休眠解除的时间相吻合,
并指出芽内H2O2含量的提高对于植物休眠的解除
有促进作用。ROS作为抗氧化系统信号转导过程
中重要的第二信使, 能够激活促分裂原活化蛋白
激酶级联途径(mitogen-activated protein kinases
cascades, MAPK) (Gechev等2006; Baxter等2014;
吕伟增等2015)。MAPK级联途径是一种广泛存在
于真核生物中高度保守的信号转导途径 , 包括
MAPKKK、MAPKK和MAPK 3种蛋白激酶。其
中MAPK位于整个信号模块的最下游, 是一类Ser/
Thr蛋白激酶, 其磷酸化底物种类繁多, 包括蛋白激
酶、转录因子、细胞骨架结合蛋白等 (MAPK
Group 2002)。MAPK级联途径是一种植物体内普
遍存在的适应外界环境变化的调节机制, 参与调
控植物生长发育、胁迫响应和程序性死亡等过程,
从而将外界刺激信号传递到细胞的内部而引发细
胞响应(Gechev等2006; Baxter等2014)。
在拟南芥与豌豆中的研究发现, ABA与H2O2
可以激活一些相同的MAPKs基因(Desikan等2004);
通过在玉米叶片的研究, 证实MAPK涉及到ABA
诱导活性氧(ROS)产生的下游组件, 并且H2O2的产
生与MAPK的激活存在关系并在ABA、的信号转
导中扮演重要角色(Zhang等2006)。尽管ABA、
杜培勇等: 油桃花芽休眠解除过程中MAPK家族基因表达分析 217
MAPK、H2O2三者的关系还未完全理清, 但大量研
究结果说明ABA和H2O2很有可能汇集在MAPK信
号通路上来调节一系列的生物功能(Desikan等
2004; 张茂迎等2010)。
目前对MAPKs基因的研究主要涉及干旱、低
温和高盐胁迫信号传递(孔祥培和李德全2009)、
各种植物激素的信号转导(Blanco等2006; Wang等
2010)、活性氧(吕伟增等2015)等方面, 在休眠方
面的相关研究尚未见报道。为了进一步揭示在转
录水平上MAPKs基因与休眠的关系, 我们检测了
桃树花芽休眠期间MAPKs基因在转录水平上的表
达变化, 以期为芽休眠的研究筛选出更多的候选
基因, 进而从分子水平为休眠机制的研究提供理
论依据。
材料与方法
1 材料
试验于2013年10月至2014年2月进行。试验
材料为六年生‘中油四号’油桃(Prunus persica var.
nectarina Maxim cv. ‘Zhongyousihao’), 种植于山东
省山东农业大学园艺试验站, 树体健壮, 生长势一
致, 实验期间正常管理。
2013年10月15日、10月30日、11月15日、12
月1日、12月15日、12月31日, 次年1月15日、2月
1日分别采集树冠外围生长发育良好、芽体饱满
的一年生枝条45枝。水培其中15枝用于统计第1
棵芽萌发时间; 另外30枝分为3组, 取下发育良好
的花芽, 迅速置于液氮中速冻, 存于–70°C冰箱中
保存, 用于内源ABA、H2O2含量的测定及荧光定
量分析。
分别采集成熟的根、枝、叶、花、果实、种
子与2013年10月30日的花芽, 置于液氮中速冻,
–70°C冰箱中保存, 用于组织特异性表达分析。
2 方法
2.1 休眠进程的确定
参照Jian等(1997)的方法以花芽第1棵芽萌发
所需的时间判断休眠进程。从每次采集的15枝枝
条中随机选取5枝枝条为1组, 重复3次。将枝条基
部剪齐, 放瓶中水培, 以淹没枝条基部2~3 cm为准,
在人工气候室中培养。培养条件为: 气温25°C, 光
照强度40 μmol·m-2·s-1, 昼/夜12 h/12 h, 每2 d换1次
水, 每次剪掉2~3 mm, 露出新茬。
测定第1棵芽萌发所需的时间(d), 表示休眠状
态。当10 d≤第1棵芽萌发所需时间≤6周时, 表明
芽体已进入自然休眠诱导状态。若连续6周未萌
发, 则表明芽体已进入休眠期。随着休眠的进行,
需冷量不断满足, 萌芽所需的时间变短, 当再次出
现10 d≤第1棵芽萌发所需时间≤6周时, 表明芽体
进入休眠解除期。
2.2 花芽中内源ABA、H2O2含量的测定
采用美国agilent公司的Aglient1290高效液相
色谱仪与美国AB公司的SCIEX-6500Qtrap (MSMS)
对花芽内源ABA含量进行测定(程鹏等2013)。采
用酶联免疫法(ELISA)进行花芽H2O2含量的测
定。每个样品重复测定3次。
2.3 目的基因的获取
将拟南芥MAPK家族20个MAPK的蛋白序列,
利用NCBI数据库中的BLAST (http://blast.ncbi.nlm.
nih.gov/)逐一同源比对桃树基因组, 选取E-value值
小于1e-10的基因作为桃树MAPK的候选基因, 然
后整合, 删除MAPK冗余序列, 将候选基因蛋白序
列输入Pfam保守结构域预测网站, 最后整合具有
MAPK保守结构域的基因作为最后桃树基因组的
MAPK的候选基因, 并用系统命名法进行命名。
2.4 总RNA的提取和cDNA的合成
取油桃花芽, 采用北京艾德莱RNA快速提取
试剂盒(EASYspin Plant RNA Kit)提取总RNA, 并
添加 DNase I去除残留的基因组DNA。
通过大连TaKaRa公司的M-MLV RTase cDNA
合成试剂盒将提取的总RNA反转录合成单链
cDNA。
2.5 荧光定量PCR
利用Beacon Designer软件按照标准实时定量
PCR引物设计原则设计MAPKs基因荧光定量引物
(表1)。采用Bio-Rad iCycler iQ荧光定量PCR仪,使
用SYBR Premix Ex Taq试剂盒(TaKaRa, 中国大连),
按照说明进行实时定量PCR。荧光定量的反应体
系为: 总体积25 μL, 包括1 μL cDNA, 上游、下游
引物各1 μL, 12.5 μL SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa,
中国大连), 9.5 μL ddH2O。PCR程序为95°C 30 s;
95°C 5 s, 60°C 30 s, 40个循环; 反应结束后分析荧
光值变化曲线和融解曲线。每个样品重复3次, 取
平均值, 采用Comparative CT (−2ΔΔCt)的方法计算实
验结果, 采用Excel软件作图。
植物生理学报218
结果与讨论
1 ‘中油四号’油桃休眠进程的确定
2013年10月15日至次年2月1日采集的‘中油
四号’油桃新梢进行离体清水培养。统计第一棵
芽萌发时间结果如图1所示。10月15至12月1日第
1棵芽的萌发时间均大于6周, 认为其进入到深休
眠期; 而在12月15日, 新梢第1棵芽的萌发时间为
23 d, 低于6周, 说明芽体在12月15日已进入休眠
解除期。休眠解除期的开始应该在12月1日至12
月15日之间。自1月15日开始新梢第1棵花芽萌发
均低于10 d, 培养25 d花芽均陆续萌发, 说明休眠
解除。
表1 RT-PCR所用引物
Table 1 Primers used for quantitative RT-PCR analysis
基因 正向序列(5′→3′) 反向序列(5′→3′)
PpMPK1 (ppa005596m) GGAGATTGTGAAGGCGTTGAAGG CAGTACCATTGACCAGATCCACCT
PpMPK2 (ppa003297m) TTCGCTGGTTTGAAGGTCTCTCT CCGATGATGGTGGCTGTTGAAC
PpMPK3 (ppa004489m) ATCTCAGTCCCGAGCATTACCAAT CGAGCAAGCCCAAAGTCACAA
PpMPK4 (ppa006129m) ATCTCAGTCCCGAGCATTACCAAT CGAGCAAGCCCAAAGTCACAA
PpMPK5 (ppa007332m) TCCTCCTCTGCTGTGACAACTATG GGCTGCCAAGGATGTTGATAATGA
PpMPK6 (ppa007306m) ACGGTGGACGCTATGTTCAGT CTCAGCATTCACAGCAGCACAA
PpMPK7 (ppa002953m) TCTGATGCTGCTCGTATTCTTCGT GATAGTGCTCTCGTGTCAGGTCAT
PpMPK8 (ppa003651m) AGCCTGAACAACGCAACTTAGC GTGGGTGGTGGGTAGTATGGATT
PpMPK9 (ppa007254m) CTCTGCTTCTTCAACGGATGCTAA TGACAGCCGCACAGACAATGC
PpMPK10 (ppa008312m) TGTCTGTGCGGCTGTCAATG GTGGTCGTACAATGTCCTTGATGG
PpMPK11 (ppa002837m) CACTTCTCACCAACGGGAACAAA GGTAGCGACTTGCCTCTCCATAT
PpMPK12 (ppa007376m) ACTGTTGAGGAGGCACTGAATCA AAAGACGAAAGGAGATGGGCAAAC
PpMPK13 (ppa007370m) ACAACATCTTCGGCAACCTCTTC TCTTCATCGCCACCATCTCCTT
PpMPK14 (ppa007418m) TATGTTGTCACTCGCTGGTATCGT AGTTGGTTGAGGCATTCAGTTCC
PpMPK15 (ppa006536m) TTGATGTATGGTCGGTCGGTTGTA GCTCCATAAGCAGACGAAGTTGATG
β-actin GTTATTCTTCATCGGCGTCTTCG CTTCACCATTCCAGTTCCATTGTC
2 花芽中内源ABA、H2O2含量分析
一般认为ABA在休眠过程中发挥着重要的调
节作用, 其含量变化决定着休眠进程(段成国等
2004), 而H2O2的含量与植物休眠的解除也存在着
重要关联(高东升等2002)。为了更好地研究休眠
过程中ABA、H2O2的含量变化, 测定了10月15日
至次年2月1日8个时期花芽中ABA、H2O2的含量
(图2和3)。
由图2可知, 花芽中ABA在10月份维持在较高
水平, 最高值出现在10月15日, 达991 ng·g-1。随着
休眠解除期的临近, ABA含量自11月15日开始大
图1 油桃花芽的休眠进程
Fig.1 Dormancy process of nectarine floral buds
图2 休眠进程中油桃花芽的ABA含量变化
Fig.2 Change of ABA contents in nectarine floral buds during
dormancy
不同的小写字母表示在0.05水平有显著差异。图3、5、6同此。
杜培勇等: 油桃花芽休眠解除过程中MAPK家族基因表达分析 219
幅度下降, 12月31日降至309 ng·g-1。而休眠解除
后ABA趋于平稳, 并维持在较低水平(图2)。在自
然休眠过程中H2O2含量总体呈现先升后降的趋
势。10月15日至10月30日呈上升趋势, 最大值为39
ng·g-1。随后H2O2含量开始下降直至休眠解除, 12
月31日之后开始趋于稳定(图3)。在休眠解除期,
花芽中ABA、H2O2的含量总体变化一致, 均呈现
出了下降趋势。可见, ABA、H2O2的含量变化动
态与休眠解除过程是相吻合的, ABA、H2O2的含
量下降可能与休眠解除相关。
3 MAPKs基因序列系统进化分析
植物MAPK分为A、B、C、D四个组, 其中A
组、B组和C组成员的磷酸化基序是TEY, 而D组磷
酸化基序是TDY。拟南芥中A组包括MPK3、
MPK6和MPK10及其在其他物种的同源蛋白几乎
参与了植物的所有生命活动, 不仅参与非生物胁
迫(Droillard等2002), 而且还参与到激素和生长发
育信号转导途径(Bush和Krysan 2007; Wang等2007;
Yoo等2008)。B组MAPK也参与了由环境胁迫引
起的细胞内信号转导, 以及细胞分裂过程中的一
些事件。例如, 对拟南芥中MPK4的研究表明, 生
物胁迫和非生物胁迫都可以引起MPK4的激活
(Brodersen等2006; Droillard等2004)。关于植物C
组MAPK的研究比较少, AtMKK3是C组MAPK的
上游互作组分, 证实AtMKK3–AtMPK7参与H2O2
的调控(Doczi等2007)。D组MAPK的研究发现其
主要参与植物抗病信号转导(Cheong等2003)。
通过拟南芥中20个MAPK的保守序列在NCBI
中进行Blastp比对, 得到15个桃树MAPK编码基因
信息。将其与20个拟南芥MAPKs基因一起进行进
化树分析。通过进化树结果可以看出(图4), 桃树
的MAPKs基因可以分为A、B、C、D四组。其中
A组包含PpMPK13、PpMPK15 2个基因; B组包括
PpMPK6、PpMPK9、PpMPK10、PpMPK12 4个
基因; C组包括PpMPK5、PpMPK14 2个基因; D组
包括PpMPK1、PpMPK2、PpMPK3、PpMPK4、
PpMPK7、PpMPK8、PpMPK11 7个基因。
以前的研究结果表明, 在拟南芥中外源ABA
处理, 所有的C组成员都检测出显著的表达上调
(Danquah等2015), 这预示着不同组的MAPKs基因
在休眠的过程中可能行使着不同的生物学功能。
休眠是植物对于低温、光周期的一种环境响应,
MAPKs基因是否参与休眠过程, 下面我们将通过
荧光定量PCR技术进行初步探讨。
4 MAPKs基因的组织表达特性
采用实时荧光定量PCR对‘中油四号’油桃不
同组织中MAPKs基因的转录水平进行分析。结果
发现‘中油四号’油桃15个MAPKs基因在花芽、
根、枝、叶、花、果实和种子中均有表达(图5), 其
中PpMPK2、PpMPK11在不同组织中表达差异显
著。PpMPK5、PpMPK6、PpMPK7、PpMPK9、
PpMPK10、PpMPK13在花芽中优势表达, 在根、
枝、叶中表达量也较高; PpMPK1、PpMPK8、
PpMPK12、PpMPK14在种子中优势表达, 在花
芽、根、枝、叶、花中表达量较高, 在果实中表
达量较低; PpMPK3、PpMPK4、PpMPK15在不同组
织中均有表达且差异不显著; PpMPK2与PpMPK11在
所有成员中相对表达差异最显著, PpMPK2在根、
枝、叶、花、果实中的表达量 均不到花芽中的
1/5、种子中的1/8, PpMPK11在花中表达优势显著,
表达量分别为花芽的3倍、根的10倍、枝的4倍、
叶的6倍、果实的5倍、种子的4倍。
本研究中未发现特异性表达的基因, 仅一些
MAPKs基因在各组织中存在不同程度的表达差异,
这可能与不同组织所面临的胁迫与激素信号转导
有关。
5 MAPKs基因的表达分析
用RT-PCR分析MAPKs基因在‘中油四号’油桃
花芽休眠解除过程中的表达模式, 结果如图6所
示。可以看出: A组成员PpMPK13与PpMPK15在
图3 休眠进程中油桃花芽的H2O2含量变化
Fig.3 Change of H2O2 contents in nectarine floral buds during
dormancy
植物生理学报220
图4 油桃与拟南芥MAPKs系统进化树分析
Fig.4 Phylogenetic tree of MAPKs from nectarine and Arabidopsis
休眠解除期表达趋势一致, 12月1日至12月15日表
达趋势平稳, 从12月15日至休眠完全解除表达量
显著下降。B组成员中PpMPK6与PpMPK12从12
月1日开始表达量急剧上升, 在12月15日达到最大
值后开始显著下降, PpMPK9与PpMPK10在12月1
日至12月15日表达趋势平稳, 随后表达量显著下
降。C组成员PpMPK5与PpMPK14在休眠解除期
表达趋势一致, 从12月1日开始表达量上升, 在12
月15日达到最大值后急剧下降。D组成员中PpMPK7
与PpMPK8在12月1日表达量显著上升, 在12月15
日达到最大值后开始下降; PpMPK2与PpMPK4从
12月1日至休眠解除表达趋势平稳; PpMPK1从12
月15日开始表达量下降; PpMPK3在12月1日表
达量显著下降, 在12月15日到达最小值之后急剧
上升; PpMPK11从12月1日开始表达量下降至休眠
解除。
休眠是指含有分生组织的植物结构可见生长
的暂时停止, 是一种相对现象, 并非绝对地停止一
切生命活动, 休眠过程中芽内发生着一系列剧烈
的生理生化变化(高东升等2001)。本研究涉及15
个MAPKs基因, 其中有6个基因在‘中油四号’油桃
花芽解除过程中基本呈下降趋势(图6): PpMPK1、
PpMPK9、PpMPK10、PpMPK13、PpMPK15 5个
基因在12月1日及12月15日之后表现出先平稳后
显著下降的趋势; PpMPK11从12月1日开始至休眠
解除均呈下降趋势。这与花芽休眠解除过程中
ABA、H2O2水平的下降趋势相吻合, 而ABA、
H2O2含量的下降是休眠解除过程的重要特征, 这
说明在休眠解除过程中MAPKs基因很可能参与
ABA、H2O2的信号转导, 从而解除休眠。
MAPK级联途径在植物中是保守的信号转导
模型, 参与多种信号转导。当植物受到多种非生
物胁迫和生物胁迫, 如低温、干旱、高盐、机械
损伤、渗透胁迫、活性氧胁迫及病原菌侵染时,
MAPK都可能被激活(蔡国华等2013), 另外, 不同
的MAPKs基因组成了多种MAPK通路而存在于同
杜培勇等: 油桃花芽休眠解除过程中MAPK家族基因表达分析 221
图5 油桃MAPKs基因在不同组织中的表达分析
Fig.5 Expression analysis of MAPKs genes in different tissues of nectarine
图中A、B、C、D分别表示MAPKs基因的四个组。下图同此。
图6 油桃花芽休眠解除过程中MAPKs基因的表达分析
Fig.6 Expression analysis of MAPKs genes in nectarine floral buds during dormancy release
植物生理学报222
一个细胞系统中, 交叉传递各种刺激信号, 形成错
综复杂的信号转导网络(吕伟增等2015)。PpMPK5、
PpMPK6、PpMPK7、PpMPK8、PpMPK12、
PpMPK14 6个基因在花芽休眠解除期均出现一个
表达高峰, 即在12月1日之后均有一个显著的上调
过程(图6), 这与花芽休眠解除过程中ABA、H2O2
水平的变化趋势相反, 推测其响应的信号、行使
的功能有所不同, 同时也说明MAPK途径相关基因
表达调控的复杂性。结合这些研究结果, 推测在
油桃花芽休眠解除过程中, MAPKs基因可能参与
ABA、H2O2的信号转导过程, 调节相应的生理活
动, 从而解除休眠。
综上所述, 在‘中油四号’油桃中, 随着花芽休
眠的解除, 6个MAPKs基因的表达量呈下降趋势,
推测MAPKs基因可能参与花芽休眠解除的调控,
为休眠领域分子水平的研究提供候选基因。
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植物生理学报224
Expression analysis of MAPK genes involved in nectarine floral buds during
dormancy release
DU Pei-Yong*, WANG Dong-Ling*, TAN Qiu-Ping, LIU Li, FU Xi-Ling, CHEN Xiu-De, XIAO Wei, LI Dong-Mei, ZHU Cui-
Ying, LI Ling**, GAO Dong-Sheng**
State Key Laboratory of Crop Biology, Shandong Collaborative Innovation Center for Fruit and Vegetable Production with High
Quality and Efficiency, College of Horticulture Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Tai’an, Shandong
271018, China
Abstract: Previous studies have clearly shown that MAPK played a key role in ABA-induced ROS (reactive
oxygen species) generation, but the transcriptional changes of MAPKs in dormancy release of flower bud is still
to be explored. The homologous genes of Arabidopsis thaliana in peach were firstly identified by NCBI blast
toolkit. The tissue-specific expression pattern of MAPKs was investigated at length. At the same time the ex-
pression pattern of MAPKs was characterized during the dormancy release course in floral buds of six-year-old
‘Zhongyousihao’ nectarine (Prunus persica var. nectariana cv. ‘Zhongyousihao’). The main results were as fol-
lows: (1) A total of 15 MAPKs were identified in peach, and they were divided into four groups according to
phylogenetic analysis; (2) the fifteen genes were universally expressed at various tissues such as flower bud,
root, shoot, leaf, flower, fruit and seed, PpMPK2 had a higher expression level in seed tissue and floer bud,
while at a lower level in other tissues. The PpMPK11 gene was expressed at the highest level in flower, while
the relatively low expression levels in other tissues. The expression of six genes out of the MAPK family was
significantly down-regulated, which was consistent with dormancy release progress of the flower bud. Accord-
ing to the aforementioned results, we could speculate that MAPKs was involved in dormancy release of flower
bud.
Key words: MAPK; nectarine floral buds; dormancy release; tissue expression; gene expression
Received 2015-09-15 Accepted 2015-12-23
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31372050) and the Modern Agricultural Industry Tech-
nology System of Fruit Industry in Shandong Province – Equipment of Cultivation and Facilities (Grant No. SDAIT-03-022-05).
*Co-first author.
**Co-corresponding author (E-mail: lilingsdau@163.com; dsgao@sdau.edu.cn).