全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (12): 1780~1784　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.10391780
收稿 2014-10-15　　修定 2014-12-02
资助 上海市科委基础研究重点项目(12JC1407800)、上海市种
业发展项目(沪农科种字2011第1号)和国家大麦青稞产业
技术体系(CARS-05)。
* 共同通讯作者(E-mail: liuchenghong@saas.sh.cn, E-mail:
sw1@saas.sh.cn; Tel: 021-62201032)。
大麦单倍体的离体培养与快速繁殖
何婷1,2, 陆瑞菊1,2, 高润红1,2, 郭桂梅1,2, 黄亦辰1,2,3, 杨沙沙1,2,3, 陈志伟1,2, 徐红卫1,2, 李颖波1,2,
刘成洪1,2,*, 黄剑华1,2,*
1上海市农业科学院生物技术研究所, 上海201106; 2上海市农业遗传育种重点实验室, 上海201106; 3上海海洋大学水产与生
命学院, 上海201306
摘要: 以大麦品种‘花30’小孢子培养来源单倍体植株作为起始材料, 分别对其丛生芽诱导、扩繁、生根以及再生植株水培
等技术进行了研究。结果表明, 添加0.5 mg·L-1 噻苯隆(TDZ)的1/2MS培养基适宜丛生芽诱导; 添加1.0 mg·L-1 TDZ的1/2MS
培养基适宜丛生芽增殖; 分别添加400 mg·L-1水解酪蛋白(CH)、20 mg·L-1亚精胺(Spd)和1.0 mg·L-1多效唑(MET)可以促进丛
生芽的健壮; 添加0.05 mg·L-1 α-萘乙酸(NAA)和1.0 mg·L-1 MET的1/2MS培养基适宜生根。水培7~10 d后, 90%以上的再生
植株正常生长。
关键词: 大麦; 单倍体; 丛生芽; 快速繁殖
In Vitro Culture and Rapid Propagation of Barley Haploid
HE Ting1,2, LU Rui-Ju1,2, GAO Run-Hong1,2, GUO Gui-Mei1,2, HUANG Yi-Chen1,2,3, YANG Sha-Sha1,2,3, CHEN Zhi-Wei1,2,
XU Hong-Wei 1,2, LI Ying-Bo1,2, LIU Cheng-Hong1,2,*, HUANG Jian-Hua1,2,*
1Biotech Research Institute, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201106, China; 2Shanghai Key Laboratory of
Agricultural Genetics and Breeding, Shanghai 201106, China; 3College of Fisheries and Life Sciences, Shanghai Ocean University,
Shanghai 201306, China
Abstract: In order to establish a stable barley haploid population, the haploid plants derived from microspore
culture of barley (Hordeum vulgare) cultivar ‘Hua-30’ were used as materials, and the induction and rapid prop-
agation of multiple buds, rooting and hydroponics of regenerated plantlets were studied. The results showed
that the supplement of 0.5 mg·L-1 thidiazuron (TDZ) in 1/2MS basal medium was suitable for multiple buds
induction; the supplement of 1.0 mg·L-1 TDZ in 1/2MS basal medium was suitable for bud rapid propagation
and the addition of 400 mg·L-1 casein hydrolysate (CH), 20 mg·L-1 spermidine (Spd) and 1.0 mg·L-1 multi-
effect triazole (MET) improved the state of buds growth. The supplement of 0.05 mg·L-1 α-naphthaleneacetic
acid (NAA) and 1.0 mg·L-1 MET in 1/2MS basal medium were suitable for rooting of regenerated plantlets, and
more than 90% plantlets survived after an acclimation of 7–10 days by hydroponics.
Key words: barley (Hordeum vulgare); haploid; bud; rapid propagation
细胞、组织培养系统的建立, 不仅使通过细
胞无性系变异进行作物遗传改良成为可能, 同时
也为植物的遗传转化提供了较为理想的受体材料
(杜志钊等2010)。在大麦组织培养中, 幼胚是最常
用的愈伤诱导外植体和遗传转化受体, 本实验室
已建立了大麦品种‘花30’幼胚为外植体的高效再
生体系(高润红等2012), 但在遗传转化中幼胚作为
二倍体受体材料, 无法获得纯和的转基因植株。
所以在小孢子来源单倍体再生植株的基础(高润红
等2012)上, 本试验以单倍体植株为外植体, 研究了
不同培养条件对单倍体丛生芽诱导的影响。
单倍体用于遗传改良的特殊作用, 有2个优点:
其一, 单倍体材料无同源染色体联会配对的影响,
单套基因易于插入外源基因, 转化效率可能会较
高, 染色体加倍后外源基因成等位基因遗传稳定
性会较好; 其二, 经转化后获得的植株不存在显隐
性问题, 加倍后即可获得纯合的二倍体转化植株
(陈彩艳2006)。单倍体群体构建的意义在于小孢
何婷等: 大麦单倍体的离体培养与快速繁殖 1781
子及其愈伤的单倍体特征存在时间短, 并且需要
的技术难度高, 构建单倍体群体后可以长时间利
用, 是机理研究的好材料, 可以揭示倍性变化对重
要性状的调控机制。双子叶植物中见到油菜单倍
体丛生芽诱导的报道(刘成洪等2005), 谷类作物中
已有二倍体丛生芽诱导的报道, 研究多集中在不
同外源激素对离体培养和快速繁殖的影响方面,
除激素浓度外, 外源有机氮源、精胺类等物质在
离体培养中对外植体的增殖也有较大影响(张杰等
2010; 余敏2011; 艾珊珊等2012)。至今未见到谷类
作物单倍体群体构建的研究报道。我们对大麦小
孢子来源的单倍体植株的丛生芽诱导、扩繁、生
根以及再生植株水培等技术进行了研究, 建立了
比较稳定的技术程序。本研究的相关结果为下一
步以单倍体茎尖为转化受体的转基因再生体系的
研究打下了基础, 并为其它谷类作物的单倍体群
体构建提供借鉴。
材料与方法
1 材料
供试材料为大麦品种(Hordeum vulgare L.) ‘花
30’小孢子来源的再生单倍体植株, 培养方法参考
陆瑞菊等(2001, 2002)方法, 选取分蘖期生长情况
良好的单倍体苗。鉴定方法参考何婷等(2014)方
法, 剥除外部叶片, 保留基部长度为8 cm左右的茎
段待处理。
2 方法
2.1 外殖体材料的处理
将收集的茎段用自来水快速冲洗5 min, 洗净
表面灰尘, 再用75%酒精漂洗30 s, 无菌水冲洗3~4
次 , 对茎段表面进行杀菌 , 沥干水分加入30%
NaClO溶液边浸泡边振荡10~15 min, 用无菌水冲
洗3~4次, 沥干。在超净台上用解剖刀剥去外部较
大叶片和多余部分, 保留基部分蘖结部位1 cm左
右, 接种到诱导培养基中启动丛生芽的萌发。
2.2 诱导培养
诱导培养基为附加0.5 mg·L-1噻苯隆(thidi-
azuron, TDZ)的1/2MS培养基, 去除培养基中污
染、褐化的丛生芽, 挑选萌发状况良好的丛生芽,
经过3~4次继代, 得到适宜的丛生芽。
2.3 增殖培养
将单倍体苗接种到附加0.5、1.0和2.0 mg·L-1
TDZ的1/2MS培养基中进行增殖培养, 对照为不添
加TDZ的1/2MS培养基, 每个处理接种5瓶, 每瓶5
个茎节, 总共25个外殖体。培养42 d后统计增殖倍
数、株高及植株生长状况。
将单倍体苗分别接种到附加1.0 mg·L-1 TDZ及
不同浓度(400、800、1 200和1 600 mg·L-1)水解酪
蛋白(casein hydrolysate, CH)、不同浓度(10、20和
30 mg·L-1)亚精胺(spermidine, Spd)和不同浓度
(1.0、2.0和3.0 mg·L-1)多效唑(multi-effect triazole,
MET)的1/2MS培养基中进行增殖培养的优化, 对
照为附加1.0 mg·L-1 TDZ的1/2MS培养基, 每个处
理接种5瓶, 每瓶5个单芽, 总共25个外殖体。培养
42 d后统计丛生芽株高、增殖倍数、叶绿素含量
及植株生长状况。
2.4 生根培养
将增殖培养基中生长42 d后的单倍体苗一部
分直接接种到附加0.05 mg·L-1 NAA和1.0 mg·L-1
MET的1/2MS培养基中进行生根培养; 另一部分先
在1/2MS培养基中预处理4周后, 再进行生根培
养。42 d后统计生根率、生根数及根长数, 每个处
理25个外殖体。
2.5 水培及移栽
将生根的单倍体苗在清水中预处理3 d后, 用
Hoagland营养液水培7~10 d, 再移栽至盆钵中。
上述培养基中均附加40 g·L-1蔗糖和6 g·L-1琼
脂粉, pH 5.8左右, 培养温度(23±1) ℃, 湿度65%左
右, 光照强度为40 µmol·m-2·s-1, 光周期10 h·d-1。
2.6 数据统计分析
采用Excel软件统计数据, 并用DPS 7.05软件
进行数据处理和统计分析。
实验结果
1 大麦单倍体的诱导培养
诱导培养阶段, 丛生芽出现污染、褐化, 经过
3 ~ 4次继代后获得生长状况良好的丛生芽 (图
1-A)。
2 大麦单倍体的增殖培养
2.1 不同TDZ浓度对大麦单倍体增殖的影响
由表1看出, 不同浓度TDZ对单倍体丛生芽增
殖倍数的影响较大, 而对株高的影响较小。低浓
度(0.5和1.0 mg·L-1) TDZ可提高单倍体苗的株高,
而高浓度(2.0 mg·L-1) TDZ则降低株高, 但是不同
植物生理学报1782
处理间差异并不显著。随着TDZ浓度升高, 增殖倍
数显著提高, 当TDZ浓度为2.0 mg·L-1时, 增殖倍数
达到最高值。但TDZ对植株的生长有较强的毒害
性, 植株叶片明显失绿, TDZ浓度愈高, 叶片绿色越
浅, 且植株整体瘦长细弱。所以为了同时获得较高
的增殖倍数和较好的植株生长状况(图1-B), 选择
浓度为1.0 mg·L-1 TDZ为增殖培养基的基本浓度。
2.2 不同CH浓度对大麦单倍体增殖的影响
将单倍体苗接种到附加1.0 mg·L-1 TDZ和不同
CH浓度的1/2MS培养基中进行增殖培养的优化。
由表2看出, 不同CH浓度对单倍体苗的株高影响较
小, 随着CH浓度的升高, 株高先下降后上升再下
降, 但与对照的无显著差异。不同CH浓度对增殖
倍数和叶绿素含量有较大影响。在CH浓度为400
mg·L-1, 丛生芽的增殖倍数达到最大值, 与对照差
异显著, 之后随着CH浓度升高而下降, 这说明较低
浓度的CH对单倍体苗的增殖有很好的效果。在叶
绿素方面, 添加CH可显著提高叶绿素含量, 但处理
间无显著差异。综合比较, 400 mg·L-1 CH既有利
于增殖倍数的提高, 又改善了单倍体植株叶片在
TDZ作用下的失绿状况。
2.3 不同Spd浓度对大麦单倍体增殖的影响
将单倍体苗接种到附加1.0 mg·L-1 TDZ和不
同Spd浓度的1/2MS培养基中进行增殖培养的优
化。由表3看出, 不同浓度的Spd对单倍体苗的株
高和增殖倍数无显著影响; 对叶绿素的影响比较
大。20.0 mg·L-1 Spd对增殖生长最有利, 株高和增
殖倍数达到最大值, 且叶绿素也较高, 达到11.7。
在此浓度下, 丛生芽的生长状况有所改善, 叶片和
基部坚韧有力。
2.4 不同MET浓度对大麦单倍体增殖的影响
将单倍体苗接种到附加1.0 mg·L-1 TDZ和不同
图1 大麦单倍体的组织培养与快速繁殖
Fig.1 Tissue culture and rapid propagation of barley haploid
A: 诱导培养; B: 增殖培养; C: 优化培养, 左边为优化前, 右边为优化后; D: 生根培养; E: 水培, 左边为水培前, 右边为水培后; F: 移栽成活。
表1 不同TDZ浓度对大麦单倍体增殖的影响
Table 1 Effects of different concentrations of TDZ on proliferation of barley haploid
TDZ浓度/mg·L 株高/cm 增殖倍数 生长状况
0 (对照) 6.01±0.40A 1.82±0.44D 丛生芽少, 叶片绿色
0.5 6.48±0.54A 3.00±0.54C 丛生芽细弱, 叶片失绿
1.0 6.30±0.73A 4.60±0.69B 丛生芽细弱, 叶片失绿
2.0 5.77±0.54A 7.54±0.40A 丛生芽簇状, 极细弱, 叶片失绿
不同大写字母表示0.01差异显著水平, 下表同此。
何婷等: 大麦单倍体的离体培养与快速繁殖 1783
MET浓度的1/2MS培养基中进行增殖培养的优
化。由表4看出, 随着MET浓度提高, 单倍体苗的
株高及增殖倍数呈下降趋势, 而叶绿素呈上升趋
势, 且差异显著。添加MET后, 植株的生长状况明
显改善, 基部和叶片粗壮有力, 叶片失绿情况得到
极大改善。但MET浓度越高, 增殖倍数就越低, 说
明MET对丛生芽的萌发有抑制作用 , 所以1 .0
mg·L-1 MET为最适宜的增殖培养基浓度(图1-C)。
3 大麦单倍体的生根培养
将增殖培养基中培养42 d的单倍体苗, 一部分
接种到附加0.05 mg·L-1 NAA和1.0 mg·L-1 MET的
1/2MS培养基中进行生根培养; 另一部分接种到
1/2MS培养基中预处理28 d后, 再进行生根培养。
由表5可知, 经过预处理的单倍体植株生根率明显
高于直接生根的 ; 两者生根数及根长均差异显
著。说明经预处理后的生根状况好于直接生根,
这因为前期增殖培养阶段的TDZ对植株生根有一
定的抑制作用, 预处理的单芽在1/2MS培养基中得
到了缓解(图1-D)。
4 大麦单倍体的水培及移栽
将生根培养基中的单倍体苗取出, 在流水中
洗净基部残余培养基, 用海绵条包裹植株基部后,
插入打孔的塑料泡沫板上。在周转箱内加入5 L左
右清水 , 将泡沫板浮于水面 , 3 d后将清水换为
表2 不同CH浓度对大麦单倍体增殖的影响
Table 2 Effects of different concentrations of CH on proliferation of barley haploid
CH浓度/mg·L 株高/cm 增殖倍数 叶绿素含量(SPAD值) 生长状况
0 (对照) 6.30±0.73A 4.60±0.69BC 9.94±0.52B 丛生芽细弱, 叶片失绿
400 5.68±0.46A 5.72±0.25A 13.86±1.23A 丛生芽较细, 叶片淡绿
800 6.08±1.02A 5.36±0.27AB 13.82±1.52A 丛生芽较细, 叶片淡绿
1 200 6.04±0.43A 4.22±0.59C 14.72±1.64A 丛生芽稍壮, 叶片淡绿
1 600 6.02±0.47A 3.88±0.53C 13.88±1.31A 丛生芽稍壮, 叶片淡绿
表3 不同Spd浓度对大麦单倍体增殖的影响
Table 3 Effects of different concentrations of Spd on proliferation of barley haploid
Spd浓度/mg·L 株高/cm 增殖倍数 叶绿素含量(SPAD值) 生长状况
0 (对照) 6.30±0.73A 4.60±0.69A 9.94±0.52B 丛生芽细弱, 叶片失绿
10 5.68±0.72A 5.20±0.75A 11.89±0.70A 丛生芽细弱, 叶片失绿
20 6.12±0.43A 5.44±0.53A 11.70±0.83A 丛生芽坚韧, 叶片淡绿
30 5.89±0.20A 5.18±0.52A 10.98±0.34AB 丛生芽坚韧, 叶片淡绿
表4 不同MET浓度对大麦单倍体增殖的影响
Table 4 Effects of different concentrations of MET on proliferation of barley haploid
多效唑浓度/mg·L 株高/cm 增殖倍数 叶绿素含量(SPAD值) 生长状况
0 (对照) 6.30±0.73A 4.60±0.69A 9.94±0.52D 丛生芽细弱, 叶片失绿
1.0 4.97±0.37B 3.98±0.33A 18.58±1.41C 丛生芽健壮, 叶片绿色
2.0 4.72±0.40B 3.68±0.51A 21.68±0.90B 丛生芽健壮, 叶片绿色
3.0 3.19±0.31C 2.38±0.46B 23.84±0.72A 丛生芽少, 健壮, 有枯叶出现
表5 不同处理对大麦单倍体生根的影响
Table 5 Effects of different treatments on rooting of barley haploid
处理 生根率/% 生根数/条 根长/cm 根的生长状况
直接生根 76±0.17A 1.56±0.43B 1.32±0.38B 细弱, 不发达
预处理后生根 92±0.11A 3.36±0.26A 3.38±0.62A 稍壮, 比较发达
植物生理学报1784
Hoagland营养液, 继续培养7~10 d后移栽进盆钵(图
1-E和F)。单倍体植株的存活率极高, 达到90%以
上, 生长情况良好, 叶片浓绿, 植株健壮。
讨　　论
TDZ在植物组织培养中是一种有效的植物生
长调节剂, 显示出细胞分裂素作用的功能特点(徐
晓峰和黄学林2003)。利用TDZ进行禾本植物快繁
与再生是非常有效的, 在小麦栽培品种(张杰等
2010)、‘华大麦7号’ (余敏2011)、水稻地方品种(艾
珊珊等2012)上都成功地建立丛生芽再生体系。本
文中1.0 mg·L-1 TDZ为最佳浓度, 这与上述文章中
的结果相一致, 说明麦类作物对TDZ的浓度要求不
宜太高。在此基础上, 本文进一步探讨了TDZ与
CH、Spd、MET对大麦小孢子来源单倍体植株丛
生芽增殖的协同作用。结果表明, 单独使用TDZ虽
然能保持单倍体植株的增殖倍数, 但TDZ本身对植
株有很强的毒害作用, 通过添加400 mg·L-1 CH可以
提高丛生芽增殖倍数, 改善叶片失绿情况。
CH是一种有机氮源, 在组织培养中经常使用,
对愈伤组织和悬浮细胞培养有明显的促进(李忠光
和龚明2006), 对芽的平均高度有显著的增加效应
(谢志兵2003)。而本试验中以400 mg·L-1 CH为最
佳浓度, 株高随CH浓度升高呈下降趋势。
Spd是一种多胺成分, 在组织培养中有助于生
物体的增殖和生长(毛碧增2003; 程云清等2008)。
本试验中以20 mg·L-1 Spd为最佳浓度, 增殖倍数及
株高与对照相比并无显著差异, 但添加Spd的丛生
芽基部与叶片坚韧有力, 生长状况得到改善。
在试验中发现TDZ对单倍体植株生根有较强
抑制作用, 为了缓解不易生根的情况, 采取了1/2MS
培养基预处理和水培炼苗相结合的方法, 单倍体
植株在移栽前生长情况良好, 根系发达, 大大提高
了移栽存活率。
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