全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 2期，2009年 2月 111
细胞壁中的过氧化物酶参与机械刺激诱导的烟草悬浮培养细胞的氧化爆发
李忠光 *, 龚明, 陈秀娟
云南师范大学生命科学学院, 昆明 650092
提要: 细胞壁中的过氧化物酶(CWPOD)是植物细胞中产生H2O2的酶源之一。机械刺激可提高烟草悬浮培养细胞中CWPOD
的活性, 促进烟草悬浮培养细胞中 H2O2的积累, 增加悬浮细胞培养介质的 pH值。用 CWPOD的抑制剂KCN或水杨苷异
羟肟酸(SHAM)预处理烟草悬浮细胞后, 机械刺激诱发的H2O2爆发和介质pH值的增加都不同程度地受到削弱。这些结果
暗示CWPOD有可能参与了机械刺激诱发的烟草悬浮细胞中H2O2爆发的形成。
关键词: 烟草悬浮培养细胞; 机械刺激; 氧化爆发; 细胞壁过氧化物酶
Involvement of Cell Wall Peroxidase in Mechanical Stimulation-induced Oxi-
dative Burst in Tobacco (Nicotiana tabacum L.) Suspension Culture Cells
LI Zhong-Guang*, GONG Ming, CHEN Xiu-Juan
School of Life Sciences, Yunnan Normal University, Kunming 650092, China
Abstract: Cell wall peroxidase (CWPOD) is one of the enzyme resources of H2O2 production in plant cells.
Mechanical stimulation (MS) enhanced the activity of cell wall peroxidase, induced H2O2 accumulation and
increased pH value of culture medium in tobacco (Nicotiana tabacum) suspension cells. In addition, the pre-
treatments with peroxidase inhibitors, KCN or salicylhydroxamic acid (SHAM), respectively, inhibited sharply
MS-induced H2O2 burst in tobacco suspension cells and the increase of pH value in culture medium. These
results suggested that cell wall peroxidase involved in the formation of MS-induced H2O2 burst in tobacco
suspension cells.
Key words: tobacco suspension cells; mechanical stimulation; oxidative burst; cell wall peroxidase
收稿 2008-09-19 修定 2008-11-11
资助 国家自然科学基金(30 4 60 0 1 6)、云南省自然科学基金
(2006C0030M)和云南省教育厅基金(06Y117B)。
* E-mail: zhongguang_li@163.com; Tel: 0871-5517394
越来越多的研究表明, 植物在高温、低温、
水涝、干旱等非生物胁迫和细菌、真菌侵染及动
物啃食等生物胁迫过程中都会引发细胞中以H2O2
为代表的活性氧(reactive oxygen species, ROS)的
迅速积累, 以此作为植物对环境胁迫的信号感受、
传导和适应的第二信使(Gong等 2001; Dietz 2008;
Meyer 2008; Miller等 2008), 但不同的环境胁迫所
引发的H2O2积累途径并不完全相同, 细胞壁中的过
氧化物酶(cell wall peroxidase, CWPOD)在外界环境
所诱发的H2O2积累过程中起作用(Bolwell等2002;
Bindschedler等 2006; Verma等 2008)。我们的最
近研究结果也表明, 机械刺激(mechanical stimulation,
MS)可诱发烟草悬浮细胞中H2O2的积累(李忠光和
龚明 2008), 但是其产生途径尚不清楚。本文以烟
草悬浮培养细胞为材料, 证实MS预处理可以诱发
烟草细胞中H2O2的积累, 并且阐明CWPOD可能
是MS诱发的烟草悬浮细胞H2O2爆发的主要酶源
之一。
材料与方法
烟草(Nicotiana tabacum L.)品种 ‘Bright Yel-
low’的愈伤组织来源于其幼嫩的茎髓, 悬浮细胞的
具体培养方法见前文(李忠光等 2005)。
培养 5 d的烟草悬浮培养细胞从 120 r·min-1、
26 ℃的摇床中转到 150、200或 250 r·min-1、26 ℃的
另一摇床中进行MS处理 40 min后, 进行CWPOD
活性、H2O2含量和 pH 值的测定。
在CWPOD活性测定中, MS处理后的细胞经
研究报告 Original Papers
植物生理学通讯 第 45卷 第 2期，2009年 2月112
真空抽滤后, 按照 Lin和Kao (2001)文中的方法分
别提取和测定活性。
测定 H2O2和 pH值时, 培养 5 d的烟草悬浮
细胞经过MS处理或MS处理前 10 min分别用
终浓度为 0.1 mmol·L-1 KCN和水杨苷异羟肟酸
(salicylhydroxamic acid, SHAM)两种 CWPOD抑制
剂处理后, 按前文方法(李忠光等2007)测定烟草悬浮
细胞介质中的H2O2含量和用pH计测定介质的pH值。
所有实验均重复 3次, 每次实验的测定重复 2
次, 图中数据均为平均值 ±标准误。
实验结果
1 MS对烟草悬浮培养细胞CWPOD活性的效应
培养 5 d的烟草悬浮细胞经过MS处理后, 与
未经MS处理的相比, 经MS处理的烟草悬浮细胞
其CWPOD活性都有了不同程度的提高, 并且随着
MS强度的增加, CWPOD活性也随之增加(图 1)。
这些表明MS可提高烟草悬浮细胞CWPOD活性。
2), 并且 pH值的增加与H2O2的积累呈现相同的趋
势。
3 CWPOD 抑制剂对 MS 诱发的烟草悬浮培养细
胞介质中H2O2积累和pH值的影响
KCN和SHAM是CWPOD的两种抑制剂(Hung
和Kao 2004), 培养5 d的烟草悬浮细胞分别用终浓
度为0.1 mmol·L-1 KCN和SHAM预处理后, 不同程
度地削弱了MS诱导的H2O2积累和细胞培养介质中
pH值的增加(图 3)。这些表明 CWPOD有可能是
MS诱导的H2O2积累的主要途径。
讨　　论
烟草悬浮培养细胞经过 3个强度的MS处理
(150、200和 250 r·min-1)后, 其 CWPOD活性都有
不同程度的提高, 诱发H2O2积累, 并且H2O2的积累
与CWPOD活性上升和细胞培养介质中pH值的增
加呈正相关(图1和2), 而CWPOD抑制剂则削弱了
MS诱发的H2O2积累和细胞培养介质中pH值的增
加(图3), 表明CWPOD是MS诱发的烟草悬浮培养
细胞H2O2积累的主要酶源。
多种环境胁迫都可诱发以H2O2为代表的ROS
图 1 MS对烟草悬浮培养细胞CWPOD活性的影响
Fig.1 Effect of MS on the activity of CWPOD in
tobacco suspension culture cells
**P< 0 . 0 1。
2 MS对烟草悬浮培养细胞介质中H2O2积累和pH
值的影响
从图 2可以看出, 烟草悬浮培养细胞在 3种强
度的MS处理后都可不同程度地诱发H2O2的积累,
并且随着MS强度的增加, H2O2积累水平也随之增
加, 表现出与MS诱导的CWPOD活性上升呈正相
关的趋势(图 1)。胞外碱化是CWPOD参与氧化爆
发的主要特征(Bolwell等 2002; Bindschedler等
2006), 烟草悬浮细胞经过不同强度的MS处理后,
都不同程度地增加了细胞培养介质中的 pH值(图
图 2 MS对烟草悬浮培养细胞介质中
H2O2积累和 pH值的影响
Fig.2 Effects of MS on H2O2 accumulation and pH values in
tobacco suspension culture cells
**P< 0 . 0 1。
植物生理学通讯 第 45卷 第 2期，2009年 2月 113
的积累, ROS在植物细胞中的产生途径主要可分为
胞内途径和胞外途径, 胞内途径主要包括叶绿体的
光合电子传递、线粒体的呼吸链、过氧化物酶体
途径(光呼吸)等; 胞外途径主要包括 CWPOD、质
膜NADPH氧化酶、胺氧化酶和草酸氧化酶途径等
(Bolwell等 2002; Meyer 2008; Miller等 2008)。虽
然不同环境胁迫都会诱发ROS积累这一共同生理
特征, 但不同的环境胁迫过程中所诱发的ROS积累
的途径不完全相同。高光胁迫过程中产生的氧化
胁迫主要来源于光合电子传递过程中电子泄漏所产
生的ROS (Dietz 2008; Meyer 2008); 创伤可提高质
膜NADPH氧化酶活性, 触发细胞中 ROS的积累
(Miller等 2008); 而镉、干旱胁迫和病菌侵染等非
生物和生物胁迫过程中都可提高芥末、毒麦幼苗
和拟南芥叶片中 CWPOD活性, 从而诱发细胞中
ROS的迅速产生(Bacon等 1997; Bindschedler等
2006; Verma等2008); 激发子所诱发的大豆悬浮细
胞中H2O2的爆发与培养介质中pH值的增加有关, 说
明CWPOD是H2O2爆发所必须的酶源(Bindschedler
等 2006)。正如 Passardi等(2004, 2005)所说, POD
犹如一把 “瑞士军刀 ”, 一方面严密地调控着ROS,
特别是H2O2的产生, 另一方面又以H2O2为电子受
体氧化催化多种底物, 从而调节植物的生长、发
育、保护反应和适应等生理过程。此外, 搅拌、
超渗、挤压、触摸等MS也可诱发大豆和荷兰芹
悬浮细胞中以 H 2O 2为代表的 R OS 的迅速积累
(Legendre等 1993; Yahraus等 1995; Gus-Mayer等
1998), 但对其产生途径尚不完全清楚。我们实验
室以前和本文的结果也都表明, MS可诱发H2O2的
积累和细胞培养介质中pH值的增加(李忠光和龚明
2008; 图 2), 并且这种积累和增加与 CWPOD活性
上升呈正相关(图1), 而CWPOD抑制剂预处理则削
弱MS诱发的H2O2积累和细胞培养介质中pH值的
增加(图3), 这暗示CWPOD可能是MS诱发的烟草
悬浮培养细胞中H2O2积累的主要酶源之一。
参考文献
李忠光, 龚明(2008). 机械刺激诱导的烟草悬浮培养细胞耐热性
及其与过氧化氢的关系. 植物生理学通讯, 44 (1): 42~44
李忠光, 宋玉泉, 龚明(2007). 二甲酚橙法用于测定植物组织中
的过氧化氢. 云南师范大学学报(自然科学版), 27 (3): 50~
5 4
李忠光, 杨仕忠, 周滔, 龚明(2005). 烟草悬浮培养细胞系的建立
及其对机械刺激的敏感性研究. 云南师范大学学报(自然科
学版), 25 (6): 40~46
Bacon MA, Thompson DS, Davies WJ (1997). Can cell wall
peroxidase activity explain the leaf growth response of
Loliume temulentum L. during drought? J Exp Bot, 48:
2075~2085
Bindschedler LV, Dewdney J, Blee KA, Stone JM, Asai T, Plotnikov
J, Denoux C, Hayes T, Gerrish C, Davies DR et al (2006).
Peroxida se-dependent a popla st ic oxida t ive bu r st in
Arabidopsis required for pathogen resistance. Plant J, 47:
851~863
Bolwell GP, Bindschedler LV, Blee KA, Butt VS, Davies DR,
Gardner SL, Gerrish C, Minibayeva F (2002). The apoplastic
oxidative burst in response to biotic stress in plants: a three-
component system. J Exp Bot, 53: 1367~1376
Dietz KJ (2008). Redox signaling integration: from stimulus to
networks and genes. Plant Physiol, 133: 459~468
Gong M, Chen B, Li ZG, Guo LH (2001). Heat-shock-induced
cross adaptation to heat, chilling, drought and salt stress in
maize seedlings and involvement of H2O2. J Plant Physiol,
158: 1125~1130
Gus-Mayer S, Naton B, Hahlbrock K, Schmelzer E (1998). Local
mechanical stimulation induces components of the patho-
图 3 KCN和 SHAM对MS诱发的烟草悬浮细胞培养
介质中H2O2积累和 pH值的影响
Fig.3 Effects of KCN and SHAM on MS-induced H2O2
accumulation and pH values in tobacco
suspension culture cells
**P< 0 . 0 1。
植物生理学通讯 第 45卷 第 2期，2009年 2月114
gen defense response in parsley. Proc Natl Acad Sci USA, 95:
8398~8403
Hung KT, Kao CH (2004). Hydrogen peroxide is necessary for
abscisic acid-induced senescence of rice leaves. J Plant
Physiol, 161:1347~1357
Legendre L, Rueter S, Heistein PF, Low PS (1993). Characteriza-
tion of the oligogalacturonide-induced oxidative burst in
cultured soybean (Glycine max) cells. Plant Physiol, 102:
233~240
Lin CC, Kao CH (2001). Abscisic acid induced changes in cell wall
peroxidase activity and hydrogen peroxide level in roots of
rice seedings. Plant Sci, 160: 323~329
Meyer AJ (2008). The integration of glutathione homeostasis
and redox signaling. J Plant Physiol, 165: 1390~1403
Miller G, Shulaev V, Miller R (2008). Reactive oxygen species
signaling and abiotic stress. Physiol Plant, 133: 481~489
Passardi F, Cosio C, Penel C, Dunand C (2005). Peroxidases have
more functions than Swiss army knife. Plant Cell Rep, 24:
255~265
Passardi F, Penel C, Dunand C (2004). Performing the paradoxical:
how plant peroxidases modify the cell wall. Trends Plant
Sci, 9: 534~540
Verma K, Shekhawat GS, Sharma A, Mehta SK, Sharma V (2008).
Cadmium induced oxidative stress and changes in soluble and
ionically bound cell wall peroxidase activities in roots of
seedling and 3-4 leaf stage plants of Brassica juncea (L.)
czern. Plant Cell Rep, 27: 1261~1269
Yahraus T, Chandra S, Legendre L, Low PS (1995). Evidence for
a mechanically induced oxidative burst. Plant Physiol, 109:
1259~1266