全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (6): 869~881　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0161 869
收稿 2015-03-19　　修定 2015-04-24
资助 国家自然科学基金(31371709)。
* 通讯作者(E-mail: chenjunying3978@126.com; Tel: 0371-
63558122)。
玉米种子老化相关MAPK途径基因表达分析
吕伟增, 曹广灿, 林一欣, 薛梅真, 陈军营*
河南农业大学农学院, 郑州450002
摘要: 促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)在活性氧 (reactive oxygen species, ROS)信号转导过
程中起重要作用, 然而MAPKs途径相关基因在种子老化过程中的表达变化尚不清楚。本文以玉米杂交种‘郑单958’种子为
材料, 研究了人工老化处理(温度45 ℃、RH 100%)对玉米种子活力及生理特性的影响, 并用数字基因表达谱技术研究老化
相关MAPKs途径基因表达变化。结果表明, 随着老化时间的延长, 种子活力指数迅速下降; 种胚内超氧阴离子产生速率在
老化处理第3天达到高峰, 随后下降; ABA含量表现为下降趋势; 种子老化过程中检测到MAPK途径相关基因53个, 其中差异
表达的有25个(上调基因14个, 下调基因11个); 对响应ROS的MAPK基因启动子区域(上游2 kb)碱基序列分析发现, 该区域分
布有ABRE、DRE/CRT等多种ABA的顺式作用元件; 对MEKK1-MKK4/MKK5-MPK3/MPK6途径基因表达分析发现, MKK4
(GRMZM5G878379)基因上调表达, 而受ROS激活的ZmMPK6 (AC188023.3_FG011)基因下调, 表明MEKK1-MKK4/MKK5-
MPK3/MPK6途径信号传递可能受阻。因此, 推测MAPK信号转导途径的破坏可能是种子劣变的重要原因之一。
关键词: 玉米; 种胚; MAPK; 种子老化
Analysis of MAPK Pathway Genes Expression Related to Maize Seed Ageing
LÜ Wei-Zeng, CAO Guang-Can, LIN Yi-Xin, XUE Mei-Zhen, CHEN Jun-Ying*
College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
Abstract: The MAPKs (mitogen-activated protein kinases) play an important role in ROS (reactive oxygen
species) signal transduction. However, the mechanism of MAPKs cascade in seed ageing is unclear. In this
study, maize (Zea mays L.) cultivar (‘Zhengdan 958’) seeds were used as a model and the effect of artificial
ageing treatment (temperature 45 ℃, relative humidity 100%) on seed vigor and physiological features were
studied. The technology of Digital Gene Expression Profile was performed to screen the differentially expressed
genes related to MAPKs during artificial ageing. The results indicated that the seed vigor index decreased dra-
matically with the prolongation of ageing time. The superoxide anion production rate in the embryo reached the
peak on the 3rd day and then declined. The ABA content showed a decreasing trend. During the process of seed
ageing, there were 53 MAPK pathway genes identified and among of them, twenty five genes showed signifi-
cant difference (14 up-regulation genes, 11 down-regulation genes). Analysis of promoter sequences (2 kb) of
MAPK genes responded to ROS stimulation was performed and some cis-acting elements responding to ABA,
such as ABRE, DRE/CRT etc were found. Expression of genes in MEKK1-MKK4/MKK5-MPK3/MPK6 cas-
cade were investigated. MKK4 (GRMZM5G878379) gene expression was up-regulated and ZmMPK6
(AC188023.3_FG011) activated by ROS was down-regulated. This data suggested that the MEKK1-MKK4/
MKK5-MPK3/MPK6 signal transduction pathway might be damaged. So it is speculated that the breakage of
MAPK signal transduction system might be one of the important cause leading to seed deterioration.
Key words: maize; seed embryo; MAPK; seed ageing
促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated pro-
tein kinases, MAPKs)由MAPKK激酶(MAPKKK)、
MAPK激酶(MAPKK)和MAP激酶(MAPK)组成, 在
信号转导网络中具有重要作用。MAPKs级联反应
途径是植物对生物和非生物胁迫的共同响应途径
(Colcombet和Hirt 2008; Pitzschke等2009; Scandalios
1997)。尽管植物中不同应激反应的信号转导途径
存在一定的差异, 但是MAPKs很可能是防御信号
网络中的一个枢纽(Zhang和Klessig 2001)。抗氧化
系统的存在使活性氧(reactive oxygen species, ROS)
植物生理学报870
等自由基处于非毒害水平并在信号转导途径中扮
演第二信使的角色, 从而作为MAPK途径的上游激
活剂, 参与调控植物生长发育、胁迫响应和程序性
死亡等过程(Gechev等2006; Baxter等2013)。抗氧
化系统如果不能有效控制ROS的平衡, 则过量的
ROS造成不可逆的细胞损伤和死亡, 破坏正常的生
理代谢活动(Halliwell和Gutteridge 1989)。MAPK信
号途径能够通过激活多种抗氧化酶系统来维持体
内ROS含量平衡。当植物处于氧化胁迫状态时, 植
物通过MAPKKK-MAPKK-MAPK三重磷酸化级
联反应将外界环境信号放大, 诱导细胞胁迫耐受
性响应。植物中MAPKKK位于级联途径的上游,
通过信号分子的受体或其本身直接感受胞外刺激
后磷酸化激活; MAPKK是双重特异性蛋白激酶,
含有保守的S/T-X3-5-S/T基序, 通过上游MAPKKK
的磷酸化而激活; MAPK也含有一个非常保守的
TXY (X代表任意氨基酸)基序, 通过上游MAPKK的
双重磷酸化而激活, 磷酸化位点是TXY基序中的
苏氨酸和酪氨酸残基。MAPK被激活后进入细胞
核, 通过激活特定的转录因子引起功能基因的表
达, 或滞留在细胞质中, 通过激活其他蛋白激酶而
引起植物细胞对内外刺激的生理生化反应(Jonak等
2 0 0 2 )。在M A P K级联途径中蛋白磷酸酶2 C
(PP2C)作为负调控者, 通过对MAPK活化环上的丝
氨酸/苏氨酸和酪氨酸去磷酸化, 参与调控信号转
导途径的关闭过程(Mishra等2006)。目前, 拟南
芥、烟草、苜蓿等植物的MAPK家族多数成员已
经被克隆, 拟南芥MAPK家族中存在60个MAPK-
KK、10个MAPKK和20个MAPK (MAPK Group等
2002), 玉米中有7个MAPKs和4个MAP2Ks (Kong
等2013)。MAPK级联反应途径的组分可通过不同
组合方式, 以不同的途径参与各种生理响应, 其中,
MAPKK决定了信号转导过程的多样性(Xing等
2007; Nakagami等2006; Teige等2004; Matsuoka等
2002)。Cai等(2014)研究表明, 在盐和干旱胁迫条
件下, MAP2Ks的过量表达能够有效提高ROS和
ABA响应基因的表达量, 包括POD、CAT、RAB18
和RD29A等, 然而, 种子老化过程中MAPKs级联反
应相关基因的表达变化尚不清楚。
延长种子寿命是种质资源保护的基础。种子
在贮藏过程不断受到来自各方面的氧化胁迫, 即使
是采用最优越的保存条件也难以避免种子活力的
下降与丧失, 因此, 阐明种子老化机理对提高种子
及种质资源的耐贮性具有重要的理论和实践意
义。本研究以玉米杂交种‘郑单958’种子为材料, 采
用高温高湿(45 ℃, RH 100%)的人工老化处理方法,
研究了人工老化对玉米种子活力及生理特性的影
响; 用基因数字表达谱筛选出老化响应的MAPKs
途径相关差异表达基因, 并进行生物信息学分析,
以期为揭示玉米种子劣变的分子机理提供依据。
材料与方法
1 材料及处理
以玉米(Zea mays L.)杂交品种‘郑单958’种子
为实验材料, 购自河南省农科院秋乐种业公司。
种子人工老化处理参照Basak等(2006)的方法
并稍加修改。选取粒形一致的健康种子置于人工
老化箱中, 在45 ℃、RH 100%条件下分别处理1、
2、3、4和5 d, 然后取出并在室内阴凉处风干、备
用, 以未老化处理(0 d)的种子为对照。
2 种子活力评价
种子活力测定参照GB3543.4-1995进行。采
取纸床发芽法, 选取20粒种子置于发芽盒中, 在光
照培养箱(28 ℃)中进行发芽试验, 3次重复。以胚
芽长度达到种子一半时视为发芽, 每天按时统计
芽数、芽长等指标, 连续统计5 d, 按下列公式计算
发芽指数和活力指数。
发芽指数(GI)=∑(Gt/Dt), 式中: Gt为在不同时
间的发芽数; Dt为相应的发芽日数; ∑为总和。
活力指数(VI)=GI×S, 式中: GI为发芽指数, S
为一定时期内幼苗长度(cm)。
3 超氧阴离子产生速率和ABA含量测定
超氧阴离子产生速率的测定参照李忠光和龚
明(2005)的方法。
ABA含量测定采用酶联免疫吸附法, 参照王
学奎(2006)的方法。
4 MAPKs相关基因筛选与表达分析
4.1 总RNA提取与纯化
以人工老化0和3 d的玉米种胚为材料 , 按
TransZol Plant试剂盒(全式金公司, 北京)使用说明
提取高质量RNA, –80 ℃储藏备用。
4.2 数字基因表达谱测序及数据处理
数字基因表达谱(Digital Gene Expression Pro-
filing, DGE)测序由华大基因公司完成。样品提取
吕伟增等: 玉米种子老化相关MAPK途径基因表达分析 871
总RNA后, 用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA, 并
在高温条件下使其片段化; 再以片段后的mRNA为
模板, 合成cDNA, 经过磁珠纯化、末端修复、3末
端加碱基A、加测序接头后, 进行PCR扩增, 完成
整个文库构建工作。构建好的文库用Agilent2100
Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR
System进行质量和产量检测, 文库质控合格后使用
Illumina HiSeqTM 2000进行测序, 获得原始数据后
经过Clean reads、与参考序列比对、测序评估和
基因表达量统计等分析, 然后对差异基因进行筛
选和功能注释(杨伟飞等2014)。
4.3 MAPKs相关基因的筛选与分析
通过NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和
MaizeGDB (http://www.maizegdb.org/)网站对玉米
基因表达谱检测结果进行初步注释, 按系统默认
参数筛选MAPKs相关基因。获取每个基因在处理
时间点和对照时间点的表达信号值, 同时以每个
时间点的表达信号值除以0 h (对照)的表达信号值,
将所得商值取以2为底的对数, 即Log2Ratio。其结
果是正值为上调表达(≥+1为有意义上调差异表达),
负值为下调表达(≤–1为有意义下调差异表达)。
4.4 ROS响应基因启动子区域顺式作用元件分析
用GeneSpring 4.2软件分析MAPKs相关基因转
录起始位点(ATG)上游2 000 bp序列(记为2 000~0 bp,
其中基因转录起始位点为0位)顺式作用元件核心序
列, 确定其在不同基因调控序列上的种类与分布。
5 目的基因的RT-PCR分析
以玉米基因Actin1为定量分析的内参基因, 对
14个目的基因进行RT-PCR功能分析。取1 μg的总
RNA反转录为cDNA模板, 稀释10倍备用。使用
Thermo Scientific Maxima SYBR Green qPCR Mas-
ter Mix (2×), ROX Solution provided试剂盒的反应
体系, 采用荧光定量PCR仪(Bio-Rad)进行荧光定量
检测。PCR条件为95 ℃预变性3 min; 95 ℃变性30
s, 59 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 40个循环; 72 ℃延
伸4 min, 22 ℃保存。
实验结果
1 人工老化对玉米种子活力的影响
种子发芽能够反映种子活力的高低。发芽实
验结果显示, 随着老化时间的延长种子的发芽率
不断下降(图1), 活力指数表现出急剧下降趋势, 人
工老化处理5 d之后种子活力指数下降接近于零
(图2), 种子活力几乎完全丧失。
2 人工老化对玉米种胚ROS产生和ABA含量的
影响
人工老化处理过程中种子呼吸作用逐渐加强,
从而加速了活性氧的产生, 其中超氧阴离子不稳
定, 能够迅速生成H2O2对细胞结构造成破坏。结
果表明, 人工老化处理的种子细胞内超氧阴离子
产生速率在老化1~3 d表现为上升趋势, 达到高峰
之后逐渐下降(图3)。
图1 人工老化处理对种子发芽的影响
Fig.1 The effect of artificial ageing on seed germinability
植物生理学报872
号途径的相关基因53个, 其中差异显著的有31个
(上调基因17个, 下调基因14个)。
MAP3Ks基因25个: 7个差异显著的上调基因
中, 上调幅度较大(4.8~6.3倍)的为GRMZM2G-
041774、GRMZM2G542686、GRMZM2G439350
和AC204050.4_FG006, 这4个基因属于MEKK亚
族, 具有激酶活性。其中, AC204050.4_FG006参与
细胞蛋白质修饰, 而GRMZM2G041774、GRM-
ZM2G542686和GRMZM2G439350所参与的生物
学过程尚不清楚; 7个差异显著的下调基因中, 下
调幅度最大(约9.1倍)的为GRMZM2G100992, 该基
因编码的蛋白质是细胞膜结构的重要组分, 具有
蛋白激酶活性。GRMZM2G093316和GRMZM2-
G175504均表现为下调, 其编码的蛋白质是气孔发
育调控途径的组成部分, 该基因座位发生突变导
致胚胎死亡。GRMZM2G044557 (上调1.218倍)和
GRMZM2G158860 (下调1.088倍)均能编码MEKK
家族A3族群蛋白, 而基因上下调表达变化相反, 前
者功能尚不明确, 而后者可传递冷、盐、镉和损
伤胁迫信号, 使MEK1磷酸化, 进而放大传递刺激
信号(MAPK Group 2002)。
MAP2Ks基因差异显著的有7个(5个上调, 2个
下调), GRMZM2G004067上调幅度最大(7.7倍), 属
于MEKK4, 响应生物胁迫; GRMZM2G330731上调
幅度达到6倍, 可激活MPK3/MPK6, 参与乙烯的生
物合成, 响应非生物胁迫; 基因GRMZM2G392737
和AC215181.3_FG004负向调控生长素运输, 过表
达可激活系统抗病性, 种子老化过程中二者上调
ABA可提高种子的抗逆性。通过酶联免疫吸
附法测定玉米种胚内ABA含量变化(图4), 结果显
示, 随着老化处理时间的延长, 种胚内的ABA含量
逐渐下降, 1~2 d下降速度最快, 到第5天时含量下
降超过50%。
3 人工老化对MAPKs途径相关基因表达的影响
MAPKs途径是植物对生物和非生物胁迫的共
同响应途径。利用数字基因表达谱技术分析种子
老化过程中MAPKs途径相关基因的表达情况(表
1), 结果检测到种胚差异表达基因有3 379个, 这些
基因主要参与生物调节、细胞加工、代谢过程、
刺激响应以及细胞死亡等过程, 其中参与MAPK信
图2 人工老化对玉米种子活力指数的影响
Fig.2 The effect of artificial ageing on seed vigor index
图3 人工老化对超氧阴离子产生速率的影响
Fig.3 The effect of artificial ageing on superoxide anion
production rate
图4 人工老化对脱落酸含量的影响
Fig.4 The effect of artificial ageing on ABA content
吕伟增等: 玉米种子老化相关MAPK途径基因表达分析 873
表1 人工老化处理条件下玉米种胚MAPK相关基因及其表达差异
Table 1 MAPK cascades-related genes and their expression in artificial aged maize seed embryo
基因ID Log2 Ratio FDR 染色体位置 ORF/bp 氨基酸数/aa 注释
MAP3K蛋白相关基因
GRMZM2G066120 1.803 2.51E-07 Chr1: 37 466 206~ 1 341 446 编码M E K K ( M A P K / E R K激酶激
37 471 599 (反向链) 酶)家族A1亚族成员。MAPKKK11
GRMZM2G180555 1.691 9.68E-12 Chr9: 141 371 304~ 编码MEKK (MAPK/ERK激酶激酶)
141 381 330 (正向链) 1 800 599 家族A2亚族成员。MAPKKK10
GRMZM2G041774 6.334 2.43E-01 Chr3: 205 363 024~ 1 545 514 MEKK亚族成员, 构成细胞内膜结合
205 364 659 (正向链) 的细胞器
GRMZM2G542686 5.524 7.07E-01 Chr6: 13 738 145~ 903 300 玉米的转录位点; MAPKKK
13 743 357 (反向链)
GRMZM2G439350 4.922 6.31E-01 Chr8: 152 959 026~ 1 371 456 MEKK亚族成员
152 960 464 (正向链)
AC204050.4_FG006 4.878 6.82E-01 Chr6: 162 141 712~ 1 413 470 MEKK亚族成员, 构成细胞内膜结合
162 143 210 (反向链) 的细胞器, 参与细胞内蛋白质修饰
GRMZM2G044557 1.218 9.04E-02 Chr1: 264 962 378~ 1 902 633 编码MEKK (MAPK/ERK激酶激酶)
264 986 784 (反向链) 家族A3亚族成员
GRMZM2G404078 0.803 6.78E-01 Chr3: 205 391 808~ 1 305 435 MEKK亚族成员, MAPKKK15
205 393 318 (反向链)
AC209208.3_FG001 0.758 4.08E-01 Chr5: 193 309 763~ 2 967 988 MAPKKK4, 气孔发育调控途径组成
193 318 041 (反向链) 部分; 该位点突变导致胚致死现象
AC197029.3_FG003 0.410 6.97E-01 Chr7: 105 507 165~ 855 284 MAPKKK1, 促分裂原活化蛋白激酶
105 508 617 (反向链) 激酶激酶活性
GRMZM2G476477 0.218 9.39E-01 Chr6: 162 155 557~ 1 452 483 MEKK 亚族成员, MAPKKK17
162 157 184 (反向链)
GRMZM2G064613 0.187 7.17E-01 Chr4: 78 778 399~ 2 070 689 促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶活性
78 784 784 (反向链)
GRMZM2G165099 –0.290 7.33E-01 Chr3: 205 374 539~ 1 428 475 MEKK亚族成员
205 376 245 (反向链)
GRMZM2G130927 –0.590 1.26E-01 Chr5: 12 032 678~ 1 890 629 编码MEKK (MAPK/ERK激酶激酶)
12 038 315 (正向链) 家族A3亚族成员
GRMZM2G098828 –0.683 3.46E-01 Chr2: 178 262 247~ 2 025 674 MEKK亚族成员, MAPKKK16
178 270 690 (反向链)
GRMZM2G140726 –0.689 1.37E-04 Chr10: 117 820 487~ 2 184 727 MEK激酶(MAP3Ka)
117 829 661 (反向链)
GRMZM2G034877 –0.783 6.99E-01 Chr5: 6 279 965~ 2 070 689 MEKK亚族成员, MAPKKK5
6 303 438 (正向链)
GRMZM2G017654 –0.783 3.56E-03 Chr2: 3 775 744~ 4 014 1337 花粉发育所需但不是必要的; 在叶毛状
3 804 915 (正向链) 体、根小柱细胞和胚珠发育中表达
GRMZM2G158860 –1.088 8.30E-09 Chr4: 178 052 009~ 1 578 525 编码MEKK (MAPK/ERK激酶激酶)
178 063 510 (反向链) 家族A3亚族成员。传递冷、盐、镉
和损伤胁迫信号, 可使MEK1磷酸化
(MAPK Group 2002)
GRMZM2G093316 –1.157 1.38E-03 Chr4: 153 631 537~ 2 688 895 MAPKKK, 气孔发育调控途径组成部
153 641 128 (反向链) 分; 该位点突变导致胚致死现象
GRMZM2G140082 –1.249 4.39E-11 Chr9: 95 454 682~ 1 620 539 蛋白激酶超家族蛋白
95 458 450 (反向链)
GRMZM2G175504 –1.446 9.13E-02 Chr2: 18 113 572~ 2 664 887 MAPKKK, 气孔发育调控途径组成
18 132 251 (正向链) 部分; 该位点突变导致胚致死现象
GRMZM2G540772 –1.519 2.73E-01 Chr5: 172 739 072~ 1 803 600 MEK激酶(MAP3Ka)
172 743 799 (正向链)
植物生理学报874
GRMZM2G156800 –1.887 4.16E-24 Chr1: 280 087 793~ 1 268 755 MEKK亚族, MAPKKK5
280 097 855 (反向链)
GRMZM2G100992 –9.081 3.92E-01 Chr1: 215 913 878~ 198 65 蛋白激酶活性, 构成细胞膜组织
215 914 575 (正向链)
MAP2K蛋白相关基因
GRMZM2G004067 7.735 4.21E-01 Chr4: 175 273 095~ 390 130 MKK4推定的MAPKK; 玉米蛋白编码
175 274 172 (反向链) 基因LOC100281486
GRMZM2G330731 6.389 2.42E-01 Chr8: 160 985 969~ 1 488 495 自动磷酸化以及使MPK3和MPK6磷酸
160 987 553 (正向链) 化。不依赖乙烯和植物抗毒素生物合
成。诱导ACS2、ACS6、ERF1、ERF2、
ERF5、ERF6、CYP79B2、CYP79B3、
CYP71A13和PAD3等转录本的表达
GRMZM2G392737 5.383 6.43E-01 Chr9: 145 512 160~ 996 331 MKK7, MAPK激酶激酶D组成员, 负
145 513 491 (正向链) 向调控生长素极性运输。过表达导致
激活基底和系统获得抗病性
GRMZM5G878379 2.972 2.33E-05 Chr5: 212 653 739~ 624 207 MKK4; 该蛋白与MKK5共同激活MPK3/
212 655 188 (反向链) MPK6和早期防御基因。在植物中可
通过RNAi技术减少MKK5和MKK6
的水平, 这些蛋白质在调节植物花器官
脱落中发挥作用
AC215181.3_FG004 1.218 7.15E-01 Chr5: 10 497 391~ 981 326 MAPKK7; 植物MAPK激酶D组成员;
10 498 371 (正向链) 负向调控生长素极性运输; 过表达可
导致基底和系统获得抗病性
GRMZM2G004468 0.413 8.20E-02 Chr3: 111 057 348~ 1 686 561 编码MAPKK, 激活MPK8
111 082 507 (正向链)
GRMZM2G006821 0.218 9.30E-01 Chr3: 169 582 019~ 978 325 编码MAPKK2, 调控MPK6和MPK4响
169 583 032 (正向链) 应冷和盐。在原生质体中和MEKK1共
同表达可激活MKK2活性, 表明MEKK1
可能调控 MKK2
GRMZM2G703639** 0.218 9.21E-01 Chr1: 76 507 945~ 420 139 参与过氧化氢代谢; 响应ROS
76 509 306 (反向链)
GRMZM5G834697 0.009 9.55E-01 Chr9: 11 928 114~ 1 044 347 涉及到先天性免疫; 该蛋白与MKK5
11 929 852 (正向链) 共同激活MPK3/MPK6和早期防御基
因。在植物中可通过RNAi技术减少
MKK5和MKK6的水平, 这些蛋白质
在调节植物花器官脱落中发挥作用
GRMZM2G344388 –0.017 9.87E-01 Chr1: 28 609 368~ 1 206 401 MAPKK7, 植物MAPK激酶D组成员;
28 610 802 (反向链) 负向调控生长素极性运输; 过表达可
导致基底和系统获得抗病性
GRMZM2G400470** –0.502 2.83E-01 Chr9: 19 607 909~ 1 053 350 编码MAPKK 2, 在冷和盐胁迫下调控
19 611 586 (正向链) MPK6和MPK4。在原生质体中和MEKK1
共同表达可激活MKK2活性 , 表明
MEKK1可能调控MKK2
GRMZM2G167856 –0.729 1.87E-10 Chr3: 201 894 260~ 1 068 355 编码MAPKK家族成员蛋白质, 可使
201 901 554 (正向链) MPK12在体外磷酸化, 同样在体外可
被MPK2去磷酸化
AC214743.3_FG002 –0.783 8.49E-01 Chr3: 169 539 198~ 786 261 MAPKK7, 植物MAPK激酶D组成员;
169 540 145 (正向链) 负向调控生长素极性运输; 过表达可
导致基底和系统获得抗病性
GRMZM2G081423** –0.783 8.49E-01 Chr2: 227 307 012~ 300 99 参与过氧化氢代谢; 响应ROS
227 308 391 (正向链)
表1 (续1)
基因ID Log2 Ratio FDR 染色体位置 ORF/bp 氨基酸数/aa 注释

吕伟增等: 玉米种子老化相关MAPK途径基因表达分析 875
GRMZM2G021021** –0.783 6.99E-01 Chr6: 7 405 006~ 249 83 参与过氧化氢代谢; 响应ROS
7 405 374 (反向链)
GRMZM2G163217 –5.005 7.31E-01 Chr5: 10 708 282~ 1 113 370 自动磷酸化以及使MPK3和MPK6磷
10 709 572 (反向链) 酸化。不依赖乙烯和植物抗毒素生物
合成。诱导ACS2、ACS6、ERF1、ERF2、
ERF5、ERF6、CYP79B2、CYP79B3、
CYP71A13和PAD3等转录本的表达
GRMZM2G338293 –6.742 3.93E-01 Chr3: 203 680 957~ 1 002 333 自动磷酸化以及使MPK3和MPK6磷酸
203 681 966 (反向链) 化。不依赖乙烯和植物抗毒素生物合
成。诱导ACS2、ACS6、ERF1、ERF2、
ERF5、ERF6、CYP79B2、CYP79B3、
CYP71A13和PAD3等转录本的表达
MAPK蛋白相关基因
GRMZM2G125656 1.703 6.53E-02 Chr10: 139 316 025~ 2 091 696 信号转导; 转导蛋白/WD40重复类超
139 319 484 (正向链) 家族蛋白
GRMZM2G017792 1.218 6.02E-01 Chr1: 43 685 604~ 1 131 376 ZmMPK3, 转录本和蛋白通过ABA和
43 688 500 (反向链) H2O2激活上调
GRMZM2G002100** 0.765 4.04E-02 Chr6: 74 598 823~ 1 197 398 病原体、乙烯生物合成、氧化胁迫和
74 604 163 (反向链) 渗透胁迫诱导编码的MAP激酶
GRMZM2G120784 0.609 2.04E-01 Chr4: 113 854 312~ 912 303 信号转导
113 859 045 (正向链)
GRMZM2G089484 0.276 7.02E-01 Chr10: 88 681 122~ 1 674 557 MAPK家族成员, MPK16
88 686 973 (正向链)
GRMZM2G053987 0.118 7.33E-01 Chr9: 138 430 366~ 1 125 374 编码MAPK, 在触碰、寒冷、盐胁迫
138 433 991 (反向链) 和几丁质寡聚物的刺激下其mRNA水
平增加
GRMZM2G017351 –0.046 9.86E-01 Chr2: 209 920 083~ 933 310 MAPK家族成员, MPK16
209 927 992 (正向链)
GRMZM2G007848 –0.732 8.77E-02 Chr8: 149 031 928~ 1 770 589 MAPK家族成员, MPK20
149 038 235 (正向链)
GRMZM2G401869 –0.751 1.98E-03 Chr4: 236 677 619~ 5 823 1 940 信号转导
236 698 026 (正向链)
GRMZM2G020216** –1.183 1.58E-19 Chr9: 18 872 654~ 1 197 398 在抗氧化防御油菜素类固醇信号中发
18 878 542 (正向链) 挥功能, ZmMPK5
AC188023.3_FG011** –5.701 7.21E-01 Chr6: 165 358 085~ 687 228 病原体、乙烯生物合成、氧化胁迫和
165 359 290 (正向链) 渗透胁迫诱导编码的M A P激酶 ,
ZmMPK6
MAPK级联负调控因子相关基因(PP2C)
GRMZM2G074824 7.758 6.75E-01 Chr8: 59 170 818~ 192 63 蛋白激酶家族蛋白, 蛋白磷酸酶2C家
59 180 125 (正向链) 族蛋白
AC213094.3_FG003 6.327 4.23E-01 Chr2: 145 856 647~ 1 035 344 推定的蛋白磷酸酶2C
145 858 406 (反向链)
GRMZM2G308615 1.343 3.38E-05 Chr7: 89 034 033~ 1 077 358 编码蛋白磷酸酶2C家族A组成员, 在
89 035 626 (反向链) 负调控种子休眠中发挥作用
GRMZM2G134628 –1.522 3.15E-71 Chr3: 220 844 236~ 1 455 484 同源于 ABI2
220 850 001 (正向链)
GRMZM2G300125 –1.676 1.62E-02 Chr8: 147 912 922~ 1 185 394 受ABA高度诱导的蛋白磷酸酶2C基因
147 918 179 (正向链)
GRMZM2G010855 –2.175 9.69E-03 Chr1: 39 139 491~ 1 191 396 受ABA高度诱导的蛋白磷酸酶2C基因
39 141 597 (反向链)
　　在Log2 Ratio列中, 粗体字表示显著上调, 下划线表示显著下调; **表示活性氧(ROS)响应相关基因。
表1 (续2)
基因ID Log2 Ratio FDR 染色体位置 ORF/bp 氨基酸数/aa 注释

植物生理学报876
幅度分别为5.3倍和1.2倍。GRMZM5G878379上
调幅度2.9倍, 与植物发育早期的抗性有关。基因
GRMZM2G330731 (上调6.389倍)及GRMZM2-
G163217 (下调5.005倍)和GRMZM2G338293 (下调
6.742倍), 三者注释基因功能相同, 具有参与乙烯
及单氧化酶合成的功能, 响应外界生物和非生物
胁迫, 这种生理功能相同而基因表达迥异的现象
反映了基因功能的特异性和复杂性。
MAPKs基因差异显著的有4个, 可被ABA和
H2O2诱导的基因GRMZM2G017792上调表达(1.2
倍); GRMZM2G125656编码信号转导蛋白腺嘌呤
琥珀酸合酶, 上调表达幅度1.7倍; GRMZM2G-
020216和AC188023.3_FG011下调幅度分别为1.2
和5.7倍, GRMZM2G020216参与抗氧化过程中的
油菜素内酯生物合成, 油菜素内酯抑制生长素氧
化酶的活性 , 提高作物的耐冷性和抗病、抗盐
能力 , 使作物的抗耐性增强 (Zhang等2010)。
AC188023.3_FG011可被乙烯、病原体、氧化胁迫
和渗透胁迫诱导表达。这两个基因的下调均可导
致植物的耐逆性降低, 说明这两个基因的表达与
种子活力的保持存在一定的相关性。
蛋白磷酸酶2C具有催化已发生磷酸化的蛋白
质去磷酸化的功能, 与蛋白激酶构成了磷酸化和
去磷酸化的蛋白质活性开关系统(Schweighofer等
2004; Hirt和Meskiene 2004)。本研究发现, 6个
PP2C基因发生了显著性差异。基因GRMZM2-
G074824和AC213094.3_FG003上调幅度最大(6~7
倍), GRM-ZM2G308615的主要功能是负向调控种
子休眠, 在种子老化过程中上调表达。而GRMZM2-
G010855、GRMZM2G300125和GRMZM2G134628
为高度依赖ABA诱导的PP2C, 其下调表达与ABA
含量的下降有着密切关系。
4 MAPKs基因顺式作用元件分析
对MAPKs级联反应中响应ROS的GRMZM-
图5 响应ROS的MAPKs基因及其顺式作用元件分布
Fig.5 The MAPKs genes responsing to ROS and their cis-acting elements distribution
吕伟增等: 玉米种子老化相关MAPK途径基因表达分析 877
表2 MAPKs调控序列顺式作用元件分析
Table 2 Analysis of the cis-elements in the MAPKs gene promoter region sequence
基因ID Log2 Ratio 顺式元件 核心序列 数目 位置 响应因子
GRMZM2G703639 0.218 DRE/CRT CCGAC 4 –84; –819; –1 176; –1 390; ABA, 干旱
ABRE ACGT 3 –424; –665; –943; ABA
G-box CACGTG 1 –1651 ABA
MYB C/TAACNA/G 3 –754; –788; –845 ABA, 干旱, 盐
GCC-box AGCCGCC 2 –186; –1 307 乙烯
W-box TGAC 7 –430; –501; –646; –1 164; 抗病
–1 347; –1 628; –1 656
GRMZM2G081423 –0.783 DRE/CRT CCGAC 2 –84; –819 ABA, 干旱
ABRE ACGT 7 –8; –424; –665; –1 573; ABA
–1 711; –1 724; –1 863
MYB C/TAACNA/G 8 –754; –788; –845; –1 062; ABA, 干旱, 盐
–1 563; –1 666; –1 854; –1 975
GCC-box AGCCGCC 2 –17; –186 乙烯
W-box TGAC 7 –88; –430; –501; –646; 抗病
–1 052; –1 673; –1 716
GRMZM2G400470 –0.502 ABRE ACGT 4 –545; –1 117; –1 438; –1 802 ABA
MYB C/TAACNA/G 10 –133; –189; –305; –565; –692; ABA, 干旱, 盐
–732; –851; –881; –1 333; –1 774
GCC-box AGCCGCC 1 –1 724 乙烯
W-box TGAC 6 –450; –619; –975; –1177; 抗病
–1 184; –1 265
GRMZM2G002100 0.765 ABRE ACGT 1 –1 876 ABA
MYB C/TAACNA/G 4 –91; –707; –1 815; –1 819 ABA, 干旱, 盐
W-box TGAC 5 –325; –431; –513; –1 247; –1 869 抗病
AC188023.3_FG011 –5.701 ABRE ACGT 6 –342; –439; –815; –1 958; –1 979 ABA
G-box CACGTG 1 –1 856 ABA
MYB C/TAACNA/G 5 –79; –160; –321; –1126; –1561 ABA, 干旱, 盐
W-box TGAC 5 –284; –347; –968; –1 241; –1 804 抗病
GRMZM2G020216 –1.183 DRE/CRT CCGAC 14 –910; –979; –1 306; –1 342; ABA, 干旱
–1 351; –1 530; –1 547; –1 599;
–1 653; –1 707; –1 762; –1 816;
–1 870; –1 950
ABRE ACGT 5 –318; –1 165; –1 214; –1 256;
–1 366 ABA
MYB C/TAACNA/G 4 –76; –435; –527; –1 262 ABA, 干旱, 盐
GCC-box AGCCGCC 1 –1 913 乙烯
　 W-box TGAC 6 –898; –1 104; –1 402; –1 920; 抗病
–1 981; –1 986

2G703639、GRMZM2G081423、GRMZM2-
G400470、GRMZM2G002100、AC188023.3_
FG011、GRMZM2G020216基因调控区域进行结
构分析发现(图5、表2): GRMZM2G703639的调控
区域内含有3个ABREs (核心序列ACGT)、4个
DRE/CRT (核心序列CCGAC)、3个MYB和1个
G-box, 7个W-box和2个GCC-box; GRMZM2-
G081423含有7个ABREs、2个DRE/CRT和8个
MYB, 7个W-box和2个GCC-box。GRMZM2-
G002100和AC188023.3_FG011的调控区域内则不
包含DRE/CRT元件; 基因GRMZM2G400470的调
控区域内存在4个响应ABA的ABREs元件、10个
MYB元件、1个GCC-box元件和6个W-box (核心序
列TGAC); GRMZM2G020216则包含14个DRE/
CRT, 5个ABREs和4个MYB, 1个GCC-box, 6个
W-box。
植物生理学报878
表3 用于qRT-PCR分析的基因及其引物序列、退火温度和产物长度
Table 3 Genes and their primer sequence, annealing temperature and product length in qRT-PCR
基因ID 引物方向 引物序列(5′→3′) 退火温度/℃ 产物长度/bp
GRMZM2G041774 FD TTGTTGGATCATCATGGC 59.2 174
RD GTGACGTGGACGATATTC 59.0
GRMZM2G542686 FD GCTTGATGTATCTGGTAGAAT 59.0 79
RD GCCATCGCTATGTATTGATA 59.0
GRMZM2G439350 FD GCTAGTACCTTGTAATCTAGTC 59.0 128
RD GGCATATAAGCAGAGCAG 59.1
AC204050.4_FG006 FD ATCCGATTGTACTCCATCT 59.1 130
RD AGCAAGAAAGGAAACAGG 58.9
GRMZM2G330731 FD CGATAGCCTTACAACTTCTAA 59.0 107
RD GTCTCATATCACGCCAAG 59.0
GRMZM2G004067 FD GATGGCAGTAGTATGTATTACA 59.0 185
RD AATCATCACCGCATCATC 59.0
GRMZM2G163217 FD CTAGCAAGCTCATCTCATC 59.0 116
RD GTTCTTGTCTTTGTGCATG 59.0
GRMZM2G338293 FD AATCAAGATGAGCGACTTC 59.1 99
RD CTGAAGTACATCTTAGTGCC 59.4
GRMZM2G020216 FD CTTCTAATGGAGGTGAGTTC 59.0 141
RD TAAGCAAGTCTTAATATGAGTGA 59.0
AC188023.3_FG011 FD ATGAAGCTCAGTGTCTCT 59.0 157
RD AATCATAACTATGGCAGCAA 59.0
GRMZM2G074824 FD TGTTCAATCAGGCAATAGG 59.0 103
RD TGGAATAAGGATTAATGTGTAGT 59.0
AC213094.3_FG003 FD CTAACTAATGGTCGTTCTGAT 59.0 152
RD GTCTTCTCTTCTTCTTACCG 59.0
GRMZM2G010855 FD CAGAGCAATCATCAGACAA 59.0 97
RD TAGTCCTGCTGTACTACTG 59.0
GRMZM2G300125 FD GAATTGCTCAATACATTGCTAT 59.0 137
RD TGGCTTCATGTAATAGTCAC 59.0
NM_001155179.1 (Actin1) FD GTATGAGCAAGGAGATCAC 58.9 194
RD TTAGAAGCACTTCATGTGG 59.0

基因GRMZM2G703639和GRMZM2G002100
中存在于基因上游转录调控区域中的MYB和
ABREs元件总数分别为6个和5个, 基因GRMZM-
2G081423、GRMZM2G400470、AC188023.3_
FG011和GRMZM2G020216中的MYB和ABREs元
件总数分别为15、14、11和9个。而DRE/CRT元
件在GRMZM2G703639、GRMZM2G081423和
GRMZM2G020216中分别为4、2和14个, 基因
G R M Z M 2 G 4 0 0 4 7 0、G R M Z M 2 G 0 0 2 1 0 0和
AC188023.3_FG011则不含DRE/CRT元件。由此
可知, 这些基因上游启动子区域普遍分布的ABRE
和MYB等顺式作用元件的数目与基因的上下调无
明显规律, 同样DRE/CRT元件的数量也与基因的
上下调关系无直接关系。基因GRMZM2G703639
和GRMZM2G081423在启动子上游84 bp到845 bp
位置内的顺式作用元件在数量和分布一致, 且二
者具有相同的功能, 这表明基因顺式作用元件与
其功能可能存在一定的关联性。
5 基因表达qRT-PCR验证
以玉米Actin1基因为内参, 用实时荧光定量
RT-PCR技术分析了14个基因(表3)在不同老化时
间点的表达模式(图6)。结果表明, 上调表达的基
因中GRMZM2G542686和GRMZM2G439350随着
老化程度加深而逐渐上调 , 基因GRMZM2G-
020216逐渐下调表达; GRMZM2G041774等7个基因
在老化第1天表现为下调, 之后逐渐上调。GRMZM2-
G004067和GRMZM2G338293从老化第1天出现
下调 , 第2天达到下调最低点 , 之后逐渐上调 ;
吕伟增等: 玉米种子老化相关MAPK途径基因表达分析 879
AC204050.4_FG006在老化第1天出现上调, 第2天又
表现为下调, 随后表现为上调, AC213094.3_FG003在
老化第1天上调, 之后表现为逐渐下调, 这些基因“U”
或“V”字形表达趋势反映出基因表达的复杂性。
讨　　论
1 种子老化过程中MAPK途径相关基因调控的复杂性
不同的MAPKs组成了多种MAPK通路而存在
于同一个细胞系统中, 交叉传递各种刺激信号, 形
成错综复杂的信号转导网络。MAPK级联反应可
由多种非生物胁迫如冷、热、盐、机械损伤、紫
外线、氧化胁迫和渗透刺激等引起信号激活, 这
些因素还会通过基因顺式作用元件影响基因表
达。基因的转录调控区域位于转录起始位点
(ATG)上游0~2 kb, 该区域包括多种响应不同胁迫
的顺式作用元件(Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki
2005), 如ABRE (ACGT)、DRE/CRT (CCGAC)、
G-box (CACGTG)、MYB (C/TAACNA/G)等。植
物激素ABA参与调控种子休眠、萌发、植物生长
发育等阶段, 而且增强植物对干旱、渗透、盐等
环境胁迫的抗性反应(Cutler等2010), ABRE是ABA
依赖型基因表达的主要顺式作用元件, 在ABA调
控基因表达中发挥着重要作用。不同基因调控序
列中所含的顺式作用元件种类、数量以及分布各
不相同, 许多作用元件(如ABREs、DRE/CRT等)受
多种激素或非生物因素调控(Nakabayashi等2005)。
本研究发现ABRE元件越多, 则差异基因的下调幅
度越大, 这与前人研究结果相似(Nakabayashi等
2005), 而本研究还发现差异不显著基因上游ABRE
元件数量多于差异显著基因, 其作用机理尚不清
楚。Narusaka等(2003)研究发现在干旱胁迫的
ABA应答反应中, ABRE和DRE/CRT协同行使功
能, 提高拟南芥的抗性。基因上游区域含有多种
顺式作用元件, 不同元件之间又存在相互作用, 共
同调控基因的表达。MAP2Ks基因GRMZM-
2G330731 (上调6.389倍)及GRMZM2G163217和
GRMZM2G338293 (分别下调5.005倍和6.742倍)注
释功能相同, 而在种子老化过程中表达趋势相反,
图6 种子老化过程中的部分MAPKs基因的表达模式
Fig.6 MAPKs genes expression pattern during seed ageing
植物生理学报880
说明MAPK途径相关基因表达调控的复杂性。
2 ROS诱导的MAPK信号传导途径的破坏可能是
种子劣变重要原因
盐、氧化、冷、干旱、微生物等多种胁迫诱
导产生的ROS, 激活MAPK级联反应并转导刺激信
号。ROS的产生和积累是加速衰老的关键因素
(Finkel和Holbrook 2000), 内源性ROS (尤其是O2¯·
和H2O2)的增加和MAPKs途径的激活被认为是加
速机体衰老的主要原因(Chretien等2008)。在多数
情况下, ROS对生物体具有破坏性(Guan等2000)。
然而, ROS并非总是有害的代谢副产物, ROS也可
作为第二信使转导刺激信号调控胁迫相关基因的
表达。研究表明, ROS可以激活MAP激酶进而调
节基因表达(Scandalios 2002)。尽管ROS激活MAPK
信号途径的详细分子机制尚不清楚, 但是模拟氧
化胁迫, 直接将细胞暴露在外源的H2O2下可以导
致MAPK途径的激活(Ruffels等2004; Dabrowski等
2000)。GRMZM2G020216基因(ZmMPK5)属于
MAPK家族, ROS对该基因激活能力最强, 表明该
基因响应活性氧刺激, 能够提高植物对胁迫的耐
受性(Matsuoka等2002)。已经被鉴定的MAPK信
号传导途径有两个, 分别是响应非生物胁迫的通
路为MEKK1-MKK2-MPK4/MPK6 (Teige等2004),
响应生物胁迫的MAPK信号通路为MEKK1-MKK4/
MKK5-MPK3/MPK6 (Asai等2002); 本实验中发现
随着种子的老化程度加深, ROS含量保持较高水
平, GRMZM2G004067和GRMZM5G878379为编码
MKK4的基因且上调表达(未发现MKK5, MKK2基
因变化不显著), 表明MKK4在信号的传递过程中
积极发挥着激活下游MAPKs的作用 , 而基因
AC188023.3_FG011 (ZmMPK6)和基因GRMZM2-
G020216 (ZmMPK5)表达水平逐渐下调。表明种
子老化过程中, ROS的过量积累可能破坏了MAPK
信号通路, 导致种子内部代谢系统的紊乱, 而该结
论是否正确仍需进一步的证据证明。
参考文献
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