全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (1): 27~36 2 7
收稿 2010-10-08 修定 　2010-11-08
资助 湖北省重点(培育)学科农业资源利用(0903)和湖北省自
然科学基金项目(2 005 ABA083 )。
* 通讯作者(E-mail: Lsahmp68@yahoo.com.cn; Tel: 0712-
2 3 4 5 4 9 0 )。
植物螯合肽合成酶的研究进展
李安明 *, 李德华, 邓青云, 汪宜宇
孝感学院生命科学技术学院, 湖北孝感 432000
摘要: 植物螯合肽(phytochelatins, PCs)在植物解除重金属的毒性方面具有重要作用, 其结构为(γ-Glu-Cys)n-Gly (n=2~11), 它
不是基因的编码产物, 而是在植物螯合肽合成酶(phytochelatin synthase, PCS)的催化下以谷胱甘肽(glutathione, GSH)为底
物合成的。PCS能够被金属离子激活, 高度保守的N-端是催化结构域, 而其C-端则是多变的。本文就PCS的结构, 功能与
催化机制以及PCS的最新研究进行了介绍。
关键词: 植物螯合肽; 植物螯合肽合成酶; 植物螯合肽合成酶基因
Research Progress on Phytochelatin Synthase
LI An-Ming*, LI De-Hua, DENG Qing-Yun, WANG Yi-Yu
School of Life Sciences and Biotechnology, Xiaogan University, Xiaogan, Hubei 432000, China
Abstract: Phytochelatins (PCs), with a general structure (γ-Glu-Cys)n-Gly (n=2–11), play an important role in
heavy metal detoxification in plants. PCs are post-translationally synthesized directly from glutathione (GSH) by
the enzyme phytochelatin synthase (PCS), of which the activity is dependent on the presence of heavy metals.
The conserved N-terminal core domain of PCS functions as the catalytic domain, whereas the C-terminal region
is highly variable. The review focused on the structure, functions and catalytic mechanisms of PCS, prospects
were also included.
Key words: phytochelatin (PC); phytochelatin synthase (PCS); phytochelatin synthase gene
重金属污染是全球性环境问题, 植物修复技术
因其廉价、安全与环境友好的特点, 给重金属污染
环境的修复带来了新的希望(Salt等1998)。植物修
复就是利用植物去除环境中的污染物或者将其转变
成无毒及毒性较低的物质的过程( P i l on- S mi t s
2005)。超富集植物是指那些能够抗重金属且地上
部分累积较多重金属的植物(Cunningham等 1995;
Salt等 1998), 在植物修复中具有重要作用。超富
集植物对重金属的抗性主要是通过两个方面实现
的: (1)阻止金属通过细胞膜的运输将细胞质中有毒
金属离子的浓度维持在较低水平, 主要是通过三条
途径来完成的: 提高细胞壁的结合能力、改变离子
通道的通透性, 减少金属的吸收以及提高主动将金
属运出细胞的能力(Silver和Misra 1988); (2)解除进
入细胞中金属的毒性, 主要是通过螯合作用使金属
失活, 降低金属毒性或者通过区室化作用来实现的
(Tong等 2004)。
Salt等(1998)将植物对金属的抗性机制分为螯
合作用、区室化作用、生物转化与细胞修复四个
方面。其中螯合作用是指植物中的重金属通过与
高亲和力的物质结合形成螯合物而被吸收, 从而降
低重金属离子的浓度, 减少其毒性。金属硫蛋白
(metallothionein, MT)和植物螯合肽(phytochelation,
PC)被认为是其中两种起主要作用的金属结合蛋
白。MT是基因编码的一类低分子量的富含半胱
氨酸的多肽(Robinson等 1993)。但在高等植物中
分离最多的重金属结合肽, 不是MT而是 PC。
自Grill等(1985)从 Cd处理过的印度萝芙木
(Rauvolfia serpentina)悬浮培养细胞中分离纯化到
一类新的能够结合重金属的蛋白即PC, 又陆续在真
核生物包括高等植物(Grill等 1988; Gekeler等
1989)、真菌(Grill 等1986)与藻类(Gekeler等1988)
中发现了 PCs。PC是一类含有 γ-Glu-Cys二肽重
复单位而在其C-末端以Gly结尾的多肽, 其基本特
征是: Glu位于其N-端, 下一个残基是通过 γ-羧基
植物生理学报2 8
与Glu相连的 Cys, γ-Glu-Cys可以重复 2到多次
(Rauser 1995)。通过化学与物理方法证明 PC的基
本结构是(γ-Glu-Cys)n-Gly, 通常 n在 2到 5之间变
化, 最高可以达到 11 (Zenk 1996; Cobbett 2000a, b;
Cobbett和Goldsbrough 2002)。在高等植物中发现
除了以Gly为C-末端氨基酸的PCs分子之外, 还存
在以其他氨基酸为C-末端氨基酸残基的PCs分子,
根据其羧基末端氨基酸的不同将PCs分为五种类型
(Rauser 1995; Zenk 1996)。PCs不仅能够被 Cd, 而
且还可以被其他有毒重金属和一些必需重金属, 如
Hg、Zn、Cu和Ni诱导合成。Grill等(1987)最早
在悬浮培养的植物细胞中发现植物螯合肽合成酶
(phytochelatin synthase, PCS)活性, 他们的研究表
明PCS可以被重金属激活, 以谷胱甘肽(glutathione,
GSH)为底物催化 PC的合成。
1 PC的作用
PC富含Cys可以通过其巯基与金属结合而形
成硫醇盐, 它们的作用主要表现在两个方面: 提高
植物对重金属的抗性与解除重金属对植物的毒害作
用; 维持细胞内环境中金属离子浓度的相对稳定
(Rauser 1990, 1995; Zenk 1996; Cobbett 2000a, b;
Cobbett和Goldsbrough 2002)。
1.1 提高植物对重金属的抗性与解除重金属的毒
害作用
为了获得抗Cd2+的细胞, Steffen等(1986)将番
茄(Lycopersicon esculentum cv. Heinz)细胞置于正
常情况下足以致死的浓度下筛选, 获得的Cd2+抗性
细胞中, PC的累积量大大高于正常细胞, 但当用谷
胺酰半胱氨酸合成酶抑制剂丁胱亚磺酰亚胺
(buthionine sulfoximine, BSO)处理上述抗Cd2+的细
胞后, 其对Cd2+的敏感性恢复, 认为PC介导了细胞
对Cd2+的抗性, PC的水平与对Cd2+的抗性是相关的。
用不同植物重复该实验得到了相同的结果(Gupta和
Goldsbrough 1991)。PC抗 Cd2+最令人信服的结
果是由Howeden等(1995a; b)发表的, 他们成功的
分离到一个对 Cd2+敏感的拟南芥(Arabidopsis
thaliana)突变体, 这个突变体对Cd2+是高度敏感的,
且不能形成Cd-PC复合物, 尽管其合成GSH的速度
没有变化。PC合成酶活性实验表明, 与野生型植
物相比, 这个突变体是 PCS缺陷型。在 Cd2＋的胁
迫下该突变体不能富集PCs, 同时突变体对Cd2+所
表现出来的敏感性与PC的含量降低是一致的。食
用蘑菇美味牛肝菌(Boletus edulis)能够通过 PCs螯
合Cd (Collin-Hansen等2007)。而表达线虫CePCS3
的烟草提高了对 Cd的抗性, 同时细胞质与液泡中
累积 PC/Cd的比例也有所增加, 表明 PCs对 Cd的
解毒作用是通过在细胞质中PCs暂时螯合Cd的结
果(Wojas等2010)。这些研究说明PCs能够解除Cd
对植物的毒害作用, 提高植物对 Cd的抗性。
越来越多的研究表明PCs不仅能够解除Cd对
植物的毒害作用与提高植物对 Cd的抗性, 还能够
抗Cd以外的许多金属和非金属。利用拟南芥与酵
母(Saccharomyces cerevisiae) PCS缺陷型突变体研
究表明PCs在解除Cd和As的毒害作用中具有重要
作用, 但在解除 Zn、Ni和 Se的毒害作用中却没有
明显的作用。拟南芥 PCS缺陷型突变体 cad1-3与
cad1-6即使在Zn2+浓度较低的培养基上生长对Zn
也是高度敏感的, 而且其根富集Zn的能力也大大降
低, 表明 PCs在植物对 Zn的抗性与累积方面具有
重要功能(Tennstedt等 2009)。大豆(Pisum sativum)
富集Cd与As的量与(h)PC (homo-phytochelatin) 是
一致的, (h)PC能够解除Cd和As的毒性(Vázquez等
2009; Kim等 2009)。PCs也能够提高植物对 Pb的
抗性(Andra等 2009; Estrella-Gómez等 2009)。
然而超富集植物体内合成的PC与其对重金属
的耐性和超富集性无关。与非超富集植物相同, 超
富集植物体内的 PCs主要在根中由 Cd诱导合成,
Cd诱导PCs的快速累积只在对Cd敏感的超富集植
物天蓝遏蓝菜(Thlaspi caerulescens)(Schat等2002)
与非超富集植物东南景天(Sedum alfredii)(Sun等
2007) 观察到。As能够有效诱导非超富集植物PCs
的合成, 然而, 在As的诱导下, As超富集植物蜈蚣
草(Pteris vittata)却只能够合成极少量的 PCs (Zhao
等 2003)。
1.2 维持细胞内环境中金属离子浓度的相对稳定
仅用微量金属元素处理过的植物组织与体外
培养的细胞中就能够检测到PCs的存在, 同时体外
培养细胞中产生 PCs的水平与培养基中金属离子
减少的水平是一致的。表明 PCs在维持新陈代谢
过程中金属离子的相对稳定方面有一定的作用
(Rauser 1995, 1999; Zenk 1996)。另外, 体外实验
表明PC-Cu和PC-Zn复合物可以分别激活依赖于Cu
李安明等: 植物螯合肽合成酶的研究进展 2 9
的二胺氧化酶和依赖于Zn的碳酸酐酶(Thumann等
1991), 表明PCs金属复合物能够给需要金属离子的
酶提供金属离子; 此外, 还有人提出 PCs也可以参
与 Fe和 S的新陈代谢(Zenk 1996; di Toppi和
Gabbrielli 1999)。
1.3 参与植物体内金属离子尤其是Cd的运输
根特异性表达小麦(Triticum aestivum) TaPCS1
的拟南芥突变体cad1-3抑制了突变体对Cd、Hg及
As 的敏感性, 同时在根、叶及茎都可以检测到
PCs, 且根中 Cd2+的浓度比突变体低, 表明 PCs不
仅可以提高植物对这些重金属的抗性, 而且可以从
根向地上部分运输 PCs与 Cd2+ (Gong等 2003), 转
基因植物主要以Cd-PC2 的形式螯合Cd, 且地上部
分 Cd的浓度是根的 2倍, 是野生型植物的 1.6倍
(Sadi等 2008)。地上部分特异性表达小麦 TaPCS1
的拟南芥突变体 cad1-3恢复了对Cd及As的抗性,
并且根中累积的Cd比地上部分高, 同时检测到PC2
的存在, 但在突变体中没有检测到, 表明 PCs也可
以从植物地上部分向根运输(Chen等 2006)。另外
通过质谱与荧光 H P L C 分析发现印度芥子菜
(Brassica juncea)在Cd处理24小时之后, 韧皮部含
有高浓度的 PCs, 木质部中只检测到极其微量的
PCs, 并且韧皮部 Cd浓度是木质部的 4倍, 表明
PC-Cd的运输是通过韧皮部而不是木质部实现的
(Mendoza-Cózatl等 2008)。香根草(Vetiveria
zizanioides)能够通过合成PCs提高对Pb的抗性, 并
且能够螯合与转运Pb, 将其储藏在根与地上部分微
管组织的液泡中(Andra等2009)。由于PCs是在Cd
的诱导下合成的, 因此可以相信 PCs可参与 Cd在
植物体内的长距离转运过程。
2 PC的合成
2.1 PC是以GSH为底物, 由PCS催化合成的
以大量植物为研究对象, 利用体外培养细胞的
生理学、化学与遗传学研究证明GSH (或GSH类
似物)是 PCs 合成的底物(Rauser 1995; 1999)。早
期的研究发现, 在体外培养的细胞中PCs是在Cd的
诱导下合成的, 同时伴随着GSH含量的降低。进
一步的研究发现当向细胞或者植物培养液中加入
GSH合成抑制剂BSO, 导致它们对Cd的敏感性, 也
使PCs的合成受到抑制, 向培养液中加入GSH可以
使这些现象消失(Cobbett 2000a; b)。 PCs合成途径
的详细特征是通过研究酵母与拟南芥突变体而得到
的。遗传学的研究证明酵母与拟南芥GSH缺陷型
突变体中 PCs的含量很低, 同时对 Cd高度敏感
(Howden等 1995a, b; Wang和Oliver 1996), 尤其是
拟南芥GSH突变体 cad2-1不仅是GSH缺陷型, 而
且GSH合成的前两个酶之一谷氨酰半胱氨酸合成
酶(glutamylcysteine synthease, GCS)也是没有活性
的。突变体 cad2-1的GCS基因的一个外显子缺失
了 6个碱基, 从而影响与预测的酶活性位点相邻的
结构域(Cobbett等1998), 使GSH的合成不能进行。
拟南芥GSH也可参与类PCs的合成, 而且在Cd存
在时, 甘氨酸是合成PCs及其相关蛋白质的关键因
素之一(Ducruix等 2006)。
2.2 PC的合成与金属离子的诱导有关
研究表明在酵母与植物及体外培养的植物细
胞中 PCs的合成可以被很多金属所诱导(Rauser
1995)。超富集植物东南景天 (Sedum alfredii H.)
在 Cd的诱导下, 根茎叶中都可以检测到 PC, 而在
Pb诱导下只在茎与根检测到 PC的存在(Zhang等
2008)。体外反应表明, PCs合成反应能够进行到
激活它们合成的金属离子被反应所合成的PCs或加
入的金属螯合剂如 E D T A 等螯合完后才终止
(Loeffler 等 1989)。多种金属如 Ni、Cu、Zn、
Ag、S n、Te、V、Au、H g、P b、B i 的硝酸
盐或硫酸盐以及As、Se的阴离子均可诱导 PCs产
生, 体外实验表明, Cd2+是最强的诱导剂(Zenk 1996),
其诱导的效率是 Cd2+>Ag+>Bi3+>Pb2+>Zn2+>Cu2+>
Hg+> Au3+>As5->In3+>Tl3+>Ge4+>Bi3+>Ga3+; 而其他一
些离子, 如 Na +、K+、Ca 2+、Mg2+、Fe3+、Al3+
就没有激活作用; Cd2+诱导速度最快, 数量最多, 是
其他金属离子的几倍或几十倍(Reddy和 Prasd
1990)。不同的金属在不同的浓度下对PCS活性的
影响是不同的。对 Cd而言, 10~100 μmol·L-1 为
PCS的最适活化浓度; 而在 10 μmol·L-1时, Ni、
Cu、Pb、Co 对 PCS的催化能力影响最大; Zn、
Ag在 50 μmol·L-1 时最大; Hg和Mg在 100 μmol·L-1
时最大。并且 PCS的活性与重金属元素的相互作
用有关, Cu-Cd、Hg-Cd为拮抗作用, 而 Pb-Cd、
Mn-Cd为协同作用(Nakazawa和 Takenage 1998)。
对海生矽藻(Thalassiosira pseudonana)类进行研究,
发现(γ-Glu-Cys)3-4-Gly的产生主要决定于 Cd2+、
植物生理学报3 0
Pb2+、Ni2+、Cu2+ 的自由离子的浓度, 而不是金属
的总浓度(Gupta和 Coldsbrough 1991)。PCs的金
属复合物, 如 Cd2+、Ag+、Hg2+、Pb2+ 与 PCs形
成的复合物, 引起了研究者的关注。采用EXAFS及
可见光谱等手段对这些复合物进行的结构分析阐明
了这些金属离子与 PCs巯基之间的配位结合形式。
2.3 PC合成的调节
PC的生物合成途径可以被多种机制所调节。
第一个可能的调节机制是通过调节GSH的生物合
成。通过转基因研究发现, 在印度芥子菜中表达
GSH合成酶基因不仅增加了PCs的合成, 而且提高
了它对Cd的抗性(Zhu等 1999a; b), 这表明GSH生
物合成的调节可能是 PC合成调控的一种内在机
制。Cd胁迫可以提高野生型印度芥子菜GCS基因
的转录(Schafer等 1998); 同样, Cd与 Cu胁迫下的
拟南芥中与GSH生物合成相关的2个基因 (GCS和
GC) 以及 GSH还原酶基因的转录水平也会提高
(Xiang和Oliver 1998)。除了研究很清楚的GSH的
生物合成受GSH的反馈抑制外, 也有证据证明GCS
的表达与转录后调控有关(May等 1998; Noctor和
Foyer 1998)。
当然, PCS的调节是PCs合成调节的最主要方
式。利用植物细胞的动力学研究表明, 在 Cd胁迫
下PCs的合成很快就会发生, 与酶被激活的体外观
察是一致的, 酶的表达似乎与金属胁迫无关。在液
体或固体培养基中培养的膀胱麦瓶草( S i l e n e
cucubalis) (Grill等 1989)、 拟南芥(Howden等
1995a; b) 和番茄(Chen等 1997)的细胞中发现培养
基中只含有微量的重金属时PCs也能够合成, 表明
增加了 PCS活性。而且, PCS活性的增加不仅可
以通过转录调节PCS的量实现, 也可以通过转录后
激活该酶的活性而实现(Estrella-Gómez等 2009)。
总之, 这些研究表明通过金属激活PCS调控PCs的
合成是最基本的调节途径。
3 PCS与 PCS基因
3.1 PCS的结构、特点与作用
Grill等(1989)从膀胱麦瓶草的悬浮培养细胞中
分离纯化了一种具有活性的酶, 它可以通过将供体
GSH 的γ-Glu-Cys转移到受体分子而催化PCs的合
成。研究发现这种转肽反应开始的时候是将GSH
的 γ-Glu-Cys 转移到另一个GSH而形成PC2, 随后
的反应中, 可以将 γ-Glu-Cys转移到PC分子上从而
形成一个 PCn+1 的寡聚体。这种(γ-Glu-Cys)二肽转
移酶被称为 PCS。它是一个分子量为 95 000的三
聚体, 对GSH的 Km是 6.7 mmol·L-1, 体外活性实验
发现该酶只有在存在金属离子时才有活性。在所
测试的金属中 Cd激活效果最好, 依次是Ag、Bi、
Pb、Zn、Cu、Hg和Au。随后在大豆 (Klapheck
等 1995)、番茄(Chen等 1997)与拟南芥(Howden
1995a; b)中也发现了类似的酶活性。大豆中同时
含有GSH与同源的hGSH, 用其根的粗提酶研究发
现, PCS 不仅可以用GSH作为底物, 也可以用同源
hGSH为底物进行催化反应, 但其催化效率要低于
前者。在同时存在这两种底物时, 合成 (h)PCs 的
能力可以提高(Klapheck等 1995)。拟南芥AtPCS1
在 γ-GS向 γ-EC的转变中起主要作用, 研究发现转
染AtPCS1的突变细胞, 在Cd2+存在时 γ-EC的浓度
增加了好几倍, 而在AtPCS1与AtPCS2双突变体中
却没有改变, 表明 AtPCS1可以催化 GS的降解
(Blum等 2010)。
自 1999年克隆到 PCS以来, 已经克隆到很多
PCS。通过DNA序列预测 PCS的分子量在 42~70
k D a。氨基酸序列比较发现植物、酵母及动物
PCS的N-末端序列的同源性高达 40%~50%, 然而
其C-末端却是多变的。C-末端的显著特征是含有
许多Cys残基, 它们常常是以成对或接近于成对的
形式存在的, 这种 Cys的排列类似于MT中 Cys的
排列方式。例如, 拟南芥与酵母的 PCS, 其 C-末
端分别含有 10个和 7个 Cys残基, 其中的 4个与 6
个分别是成对存在的。然而, 这些Cys的位置却没
有明显的保守性。相反, 通过全序列比较却发现
单子叶植物小麦的TaPCS1与双子叶植物拟南芥的
AtPCS1的同源性高达 55% (Clemens等 1999)。前
者含有 14个Cys残基, 其中包括C-末端的 2对, 但
原核生物的PCS却只含有相当于真核生物N-末端
的序列, 其中也含有成簇的 C ys 残基(Tsu j i 等
2004)。
研究表明酵母与植物细胞中 PCS的合成可以
被许多金属所诱导(Rauser 1995)。用培养的植物
细胞进行的酶动力学研究发现在Cd诱导几分钟后
PCs的合成就开始。PCS的表达似乎不需要金属
诱导。在微量重金属处理过的植物细胞与组织的
李安明等: 植物螯合肽合成酶的研究进展 3 1
粗提物中就发现含有PCS, 表明PCS主要是被金属
激活, 而不依赖于金属调节其表达。这些结论也被
在大肠杆菌与酵母中表达PCS的实验所证实, 这些
被表达的酶可以被 Cd、Ag、Pb、Zn、Cu和 Hg
激活(Clemens 1999; Ha等 1999; Vatamaniuk等
1999)。
3.2 PCS的催化机制
自Grill等(1989)最先从膀胱麦瓶草的悬浮培
养细胞中分离纯化到 PCS以来, 对 PCS的催化机
制, 包括其被金属离子的激活过程就开始研究, 但
得到的研究结果不尽相同, 到目前出现了5种解释
PCS催化机制的模型。
Grill等(1989)的研究发现 PCS可以被很多金
属离子激活, 其中Cd是最强的激活剂(Zenk 1996)。
酶催反应动力学分析表明其催化反应可以分成两
步:
(1) γ-EC-Gly+酶 → γ-EC-酶 +Gly
(2) γ-EC-酶 +(γ-EC)n-Gly → (γ-EC)n+1-Gly +酶
第一步GSH中Gly的切割与酶中间体的形成;
第二步将(γ-EC)从酶中间体转移到受体GSH或PC
寡聚体, 是通过转肽反应完成的。最近的研究发现
如果受体是水, PCS可以催化谷胺酰半胱氨酸巯基
偶联物的形成(Beck等2003)。Vatamaniuk等(2004)
通过体外表达AtPCS1-FLAG, 直接证明PCS是一个
二肽转移酶, 能够催化γ-Glu-Cys从一个含巯基多肽
转移到另一个多肽或者已经合成的PC, 从而介导多
肽从N端向 C端的方向延伸, 同时, 证明 PCS有 2
个 PCs合成所需的乙酰化位点。这是 PCS催化机
制的第一种模型。
Ha等(1999)报导尽管合成的量只有野生型的
33%, 缺失了C端的AtPCS1仍然能够催化PC的合
成。这表明, PCS的N-末端结构域是催化结构域,
对于其催化作用来说其 C- 末端并不是绝对必要
的。于是 Cobbett (1999)提出保守的N-末端具有
催化活性, 酶的激活来自于金属离子与该结构域中
可能是半胱氨酸的相互作用。C- 末端结构域是
PCS的重金属传感器, 由于该结构域也有很多半胱
氨酸, 它们首先结合Cd2+, 然后去激活N-末端结构
域。这是 PCS催化机制的第二种模型, 正被越来
越多的研究所证实。Ruotolo等(2004)发现截短的
AtPCS11-372 催化合成的PC与AtPCS11-485 的量一样
多, 而AtPCS11-283 的催化活性比AtPCS11-485 低很多,
其 C-末端 373-485可能决定重金属的范围。同样,
Tsuji等(2005)也证明 AtPCS11-221 在体外与体内都能
够催化PC的合成, 表明PCS的N-末端具有催化活
性, 对 PCS的催化作用是必不可少的。定点突变
PCS的 C-末端富含 Cys的区域 C358C359XXXC363
XXC366, 减少 Cys的含量, 降低 SH的含量, 减少了
其结合 Cd及其他重金属的量, 也影响了酶的活性,
表明C-末端尽管对PCS的活性不是绝对必需的, 但
它可以影响金属离子的作用范围(Ramos等 2008),
通过结合金属离子, 并且将它们传递到催化结构域,
而提高酶活性(Vestergaard等 2008)。用Ala取代
Cys358、Cys359、Cys363与 Cys366残基的研究也证
明, 突变体 PCS活性显著低于野生型, 而且很容易
受到氧化破坏, 表明 PCS的 C-末端在抗氧化方面
具有重要作用, 尽管PCS的C-末端不是保守的, 但
可能具有其他方面的功能(Matsumoto等 2009)
第三种模型是 Vatamaniuk等(2000)提出来
的。AtPCS1-FLAG催化动力学分析表明酶的激活
不需要 Cd2+ 与酶结合, 而是通过 Cd-GS2复合物来
激活 AtPCS1。这些复合物被用作 PC合成的底
物。用硫甲基谷胱甘肽作为底物的研究发现被阻
塞的巯基即使在没有重金属的情况下也足够激活
PCS。于是, 他们认为在 PC合成的过程中伴随着
从 Cd-GS2切除Gly而形成 γ-EC乙酰化酶中间体,
接着将 γ-EC从乙酰化酶中间体转移到受体分子而
产生包含增加了一个 γ-EC重复单元的产物。体内
PCS的生理学研究同样表明对于PCs的合成来说重
金属是不可缺少的(Zenk 1996)。
第四种模型是 Tsuji等(2005)提出来的。他们
通过比较分析原核生物与真核生物 PCS的两步催
化时发现, 在第一步反应中自由的GSH与PCs可以
作为供体给正在延长的PCs提供γ-EC单元, 将γ-EC
从GSH或PCs上切下来的过程中需要重金属离子,
更进一步通过比较根据NsPCS与AtPCS1序列得到
的突变体时发现 AtPCS11-221是该酶的催化活性区
域, Cys56残基对酶的催化活性是必需的。因此他
们认为PCS在真核生物中是组成型表达的, 在没有
重金属存在时它们以无活性的形式存在, 当生物受
到重金属胁迫时, 进入细胞的金属离子大多数与
GSH形成如Cd-GS2的复合物, Cd-GS2与PCS的亲
植物生理学报3 2
和力高于自由的 Cd (Vatamaniuk等 2000), 能够作
为 PCS的激活剂, 引起酶的折叠。从 Cd-GS2释放
的Cd使酶的构型发生改变并且激活酶。在酶折叠
与激活的过程中, 巯基还原物有助于含有大量半胱
氨酸的PCS分子间二硫键的还原。像GSH或者PCs
供体分子在折叠的有活性的酶的Cys56的帮助下可
以与酶接合, 一个 γ-EC就从这些分子中释放出来,
释放的 γ-EC可以立即转移到受体分子。Maier等
(2003)用根据PCS的活性位点建立的多肽库进行的
Cd结合实验与 Cys残基功能研究表明 AtPCS1中
Cys56、Cys90、Cys109与 Cys113对酵母突变体 S.
pombe Δpcs在含有 Cd的培养基中生长是最基本
的。相反, Vatamaniuk等(2004)的研究表明 Cys56
在第一步与随后的 PC合成反应中是必不可少的,
而其他的半胱氨酸残基(Cys90、Cys91 、Cys109与
Cys113)却没有什么影响。Romanyuk等(2006)通过
突变体的研究也得到相同的结果。
第五种模型是Vivares等(2005)提出来的, 他们
用原核生物一种蓝细菌 Nostoc的 PCS (NsPCS)建
立了在活性与乙酰化条件下的NsPCS立体模型, 这
不仅是PCS立体结构的最早报导, 而且建立了PCS
属于木瓜蛋白酶超家族及其催化机制与半胱氨酸蛋
白酶相似的模型, NsPCS的 Cys70、His180 与Asp201
分别对应于AtPCS1的 Cys56、His162 与Asp180 组成
一个类似与木瓜蛋白酶的三联体的催化结构域, 突
变体的研究表明其中的任何一个对其催化活性都是
必不可少的( R o ma n y u k 等 2 0 0 6 )。长喙田青
(Sesbania rostrata) SrPCS 通过选择性剪接产生 4
个成熟的mRNA, 编码4种不同的PCS, 其中SrPCS1
与 SrPCS3具有Cys56、His162 与 Asp180 三个氨基酸,
预测立体结构与NsPCS立体模型相似, SrPCS2与
SrPCS4只有相当于SrPCS3的N-末端部分, 并且缺
少His162 与Asp180 立体结构与NsPCS也不相似, 表
达这 4个 PCS的酵母, 只有 SrPCS1与SrPCS3 提高
了对 Cd的抗性, 也证明了上述的模型(Li等 2009)。
尽管有这么多解释PCS催化机制的模型, 但还
没有一个被大家都普遍接受的模型。PCS立体结
构的建立为理解其催化机制提供了新的途径, 同时,
这些模型对N-末端是PCS的催化结构域都是肯定
的, 而C-末端对酶的催化活性没有太大的影响, 但
可以影响金属离子的作用范围。
3.3 PCS的克隆与表达研究
尽管 20多年前就发现与纯化到 PCS, 但直到
1999年三个小组才同时用不同的方法分别克隆到
PCS。其中两个小组通过在酵母中表达拟南芥与小
麦的cDNA文库, 分别发现表达AtPCS1 (Vatamaniuk
等1999)与TaPCS1 (Clemens等1999)的酵母提高了
对Cd的抗性。第三个小组通过图位克隆的方法克
隆得到拟南芥的AtPCS1 (Ha等 1999)。此后, 又陆
续从其他高等植物(Cazalé和Clemens 2001; Oven等
2002; Loscos等 2006)、动物(Clemens等 2001;
Vatamaniuk 2001; Brulle等 2008)、藻类(Osaki等
2008)、原核生物(Harada 等 2004; Tsuji等 2004;
Chaurasia等 2008)克隆到该基因, 表明PCS可能广
泛存在于生物界, 不仅如此, 研究还发现在植物中
存在PCS家族, 并且可以通过选择性剪接产生具有
不同功能的 PCS (Ramos等 2007; Li 等 2009)。
早期的研究推定PCS是一个组成型表达的酶,
其基因的表达不受重金属的诱导(Grill等 1987)。
这个推论通过用Northern与 RT-PCR分析 AtPCS1
的表达得到证实, AtPCS1 mRNA的含量在用重金
属如 C d、Zn、C u、氧压力、高盐、茉莉酸和
水杨酸处理后并没有发生改变( H a 等 1 9 9 9 ;
Vatamaniuk 等 2000; Cazale和 Clemens 2001)。但
在拟南芥发育的早期用 Cd处理过的生长 5 d的幼
苗AtPCS1的mRNA比未处理的幼苗增加了2倍(Lee
和Korban 2002)。最近的研究证明在整株拟南芥
都可以检测到AtPCS1, 但AtPCS2只在其根尖表达,
它们在细胞质中催化GSH的循环, 而AtPCS1起主
要作用(Blum等 2007)。用竞争性PCR分析小麦根
中 TaPCS1的表达发现用 100 μmol·L-1 Cd2+ 处理过
的根中mRNA的水平比没有处理的提高了5~10倍
( C l eme ns 等 1 9 9 9 )。而超富集植物水生蕨类
Salvinia minima受 Pb2+诱导的叶中 SmPCS表达量
显著提高, 表明Pb2+可以在转录水平调控该基因在
叶中的表达, 以增加 PCs的含量, 但在根中 SmPCS
表达是下调的(Estrella-Gómez等 2009)。表明在植
物的不同器官与植物发育的不同时期, 对重金属胁
迫防御反应的要求是不同的, PCS的表达是可以调
节的, 其机制也是不同的。
3.4 转 PCS植物的研究
自从克隆PCS以后, 通过在原核生物以及酵母
李安明等: 植物螯合肽合成酶的研究进展 3 3
中表达该基因与通过转基因植物研究其功能就开始
了。在细菌和酵母中表达 PCS提高了它们对重金
属的抗性(Clemans等 1999; Osaki等 2008; Singh等
2008)。并且表达鱼腥藻(Anabaena sp. PCC 7120 )
PC S 的细菌还提高了对多种非生物胁迫的抗性
(Chaurasia等 2008)。但是目前通过转基因植物研
究 PCS的功能得到的结论却不一致。超量表达拟
南芥AtPCS1的烟草增强了对Cd的耐受能力和积累
却不能把它运输到芽(Pomponi等 2006)。而超量
表达小麦的TaPCS1可以显著提高烟草对重金属如
Pb和 Cd的抗性, 同时转基因植物的地上部分累积
的 Pb是野生型的 2倍(Gisbert 等 2003)。在拟南芥
cad1-3突变体中表达TaPCS1可以抑制其对重金属
的敏感性, 且提高了Cd从根到芽的运输, 减少了Cd
在根中的累积(Gong等2003), 但在叶中特异性表达
AtPCS1虽然提高了植物对Cd的抗性, 却不能改变
其含量(Peterson和Oliver 2006)。在印度芥子菜中
超量表达 AtPCS1能够增加转基因植物对 Cd、Zn
与 As的抗性, 但不能增强其累积能力(Gasic和
Korban 2007a; b)。相反, 在拟南芥中超量表达
AtPCS1反而导致转基因植物对Cd的敏感性(Lee等
2003a), 也不能提高Cd的累积量(Lee等 2003b), 但
提高了对As的抗性(Li等2004)。表达小麦TaPCS1
的烟草在含有多种重金属的矿区生长良好, 而且富
集 Cd、Pb、Cu、Zn、Ni及 B的能力比野生型
提高了很多倍(Martínez 2006)。这些研究表明不同
来源的 PCS在不同的转基因植物中对提高植物在
重金属抗性方面的作用及机理可能不同。
4 结语
自20世纪80年代发现PC以来, 对PC的结构、
PCs对重金属的解毒作用与植物对重金属抗性机制
的研究越来越深入, 随后对PCS的结构及其催化机
制以及 PCS的克隆与表达及转基因植物的研究也
取得了不少进展, 但这些研究的结论并不是一致的,
今后应加强以下几个方面的研究。
(1) 继续加强对 PC的生物合成和功能的研
究。利用突变体以及功能获得的方法获得超量表
达PCS的转基因植物, 从分子生物学角度揭示其生
化合成途径与调控的机制, 为 PC的生化、分子和
生理研究提供基础材料, 以通过调控 PC增加植物
对金属的抗性。
(2) 继续加强对PCS的结构及其催化机制的研
究。通过克隆与表达 PCS, 分离纯化 PCS建立其
立体结构模型, 比较不同模型之间的异同, 以及通
过突变体的研究发现与该酶的催化活性相关的氨基
酸。一方面可以进一步了其解催化机制, 另一方
面, 可以有目的的改造它们, 通过提高其活性以增
加 PC的量, 提高植物对重金属的抗性。
(3) PCS普遍存在于生物界, 继续分离克隆这
些基因, 加强其表达与重金属诱导关系的研究, 增
加对 PC与植物重金属抗性之间关系的理解, 同时,
加强转基因植物的研究, 了解不同的转基因植物对
不同重金属反应不同的机理, 寻找能够稳定表达该
基因并提高对重金属的抗性与富集能力的植物物
种, 为将该基因应用于重金属污染土壤的植物修复
奠定基础。
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