全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (7): 1091~1098　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0581 1091
收稿 2015-02-05　　修定 2015-06-10
资助 国家自然科学基金(31160060和31260568)。
* 通讯作者(E-mail: tspaulzhao@163.com; Tel: 0938-8362830)。
过表达拟南芥点突变乙酰羟酸合成酶基因改变植物对缬氨酸的抗性及增
强缬氨酸合成
赵菲佚*, 焦成瑾, 王太术, 田春芳, 谢尚强, 刘亚萍
天水师范学院生物工程与技术学院, 甘肃天水741001
摘要: 拟南芥乙酰羟酸合成酶(acetohydroxyacid synthase, AHAS)在支链氨基酸合成中具有重要的作用。为考察AHAS不同
亚基关键位点突变对植物缬氨酸抗性与缬氨酸合成的影响, 对AHAS大小亚基上特定位点进行体外突变, 构建AHAS点突
变过表达转基因植物, 研究AHAS不同亚基点突变转基因植物对缬氨酸抗性及其合成的影响。研究结果表明: AHAS小亚
基G88D突变解除了终端产物对该酶的反馈抑制作用, 使转基因植物缬氨酸含量提高。大亚基E305D突变增强小亚基G88D
突变效应, 而大亚基E482D突变对G88D突变具有相反的作用。AHAS全酶E305DG88D双突变转基因植物较E482DG88D具
有更强的缬氨酸抗性表型和更高的缬氨酸含量。这些结果提示AHAS大小亚基间存在着相互作用, 大小亚基不同位点突变
对AHAS全酶活性具有不同的影响。
关键词: 乙酰羟酸合成酶; 点突变; 转基因植物; 缬氨酸抗性表型; 缬氨酸含量
Overexpression of the Point Mutated Acetohydroxyacid Synthase Alters Resis-
tance to Valine and Enhances Production of Valine in Arabidopsis
ZHAO Fei-Yi*, JIAO Cheng-Jin, WANG Tai-Shu, TIAN Chun-Fang, XIE Shang-Qiang, LIU Ya-Ping
School of Bioengineering & Biotechnology, Tianshui Normal University, Tianshui, Gansu 741001, China
Abstract: Acetohydroxyacid synthase (AHAS) plays a pivotal role in the synthesis of brahched-chain amino
acids (BCAAs) in Arabidopsis. To investigate effects of various specific mutated sites harboring in the large
and small subunits of AHAS on resistance to valine and production of valine in Arabidopsis, transgenic plants
overexpressing the point mutated AHAS were generated by site-directed mutagenesis, and the phenotype of re-
sistance to valine and production of valine of the transgenic plants were evaluated in planta. The results showed
that the G88D mutation in the small unit of AHAS abolished the feedback-resistant of valine to AHAS and
this mutation resulted in increase of valine in the transgenic plants. The E305D mutation in the large unit of
AHAS strengthens the effect of the G88D mutation. Interestingly, the E482D mutation in the large unit of
AHAS acts antagonistically on the G88D mutation in resistance to valine and production of valine in transgenic
plants. Compared with the combined double E482DG88D AHAS mutant transgenic plants, the E305DG88D
AHAS transgenic plants exhibited the increased valine resistance and accumulated the more content of valine in
planta. The results in this study suggested that the large unit interacts with the small unit of AHAS and different
mutations in various sites of AHAS displayed distinct effects on the holoenzyme activity of AHAS.
Key words: acetohydroxyacid synthase; point mutation; transgenic plants; valine-resistance phenotype; valine
content
缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸由于具有支链碳
骨架被称为支链氨基酸, 在动物生长与发育过程
中有着不可或缺的作用(Harris等2005; Nair和Short
2005; Brosnan和Brosnan 2006)。已有研究表明: 在
动物体内, 支链氨基酸可被如mTOR (mammalian
target of rapamycin)信号蛋白感应, 在促进蛋白合
成与抑制蛋白降解中起着重要的作用。此外, 支
链氨基酸也直接或间接参与神经递质谷氨酸的合
成与区室化; 对胺类神经递质5-羟色胺、儿苶酚胺
类多巴胺和去甲肾上腺素的合成也有影响(Hutson
等2001; Fernstrom 2005; Nair和Short 2005)。然而,
动物体内不能进行支链氨基酸的从头合成, 只能
植物生理学报1092
从饮食中获取, 植物是动物获取支链氨基酸的重
要来源。因而, 植物支链氨基酸的合成与调控研
究具有重要的理论与实际意义。
植物、细菌与真菌通过一个保守的代谢途径
进行支链氨基酸的合成, 该合成途径中的合成酶
活性不仅受到底物的严格调控, 而且受终端产物
的反馈抑制(Singh和Shaner 1995; Duggleby和Pang
2000; Chipman等2005)。乙酰羟酸合成酶(AHAS,
也称为乙酰乳酸合成酶)为支链氨基酸合成途径的
第1个合成酶。在植物中, 3种支链氨基酸对AHAS
的活性均有抑制作用, 但缬氨酸显示出较亮氨酸
与异亮氨酸更为明显的抑制效应(Miflin和Cave
1972)。
至今, 人们对不同物种的AHAS已进行了比较
详细的研究。细菌AHAS为四聚体, 由2个催化亚
基(CSUs)和2个调节亚基(RSUs)组成。调节亚基
上包含1个高度保守的ACT功能结构域, 该结构域
使调节亚基有稳定和增强催化亚基活性的功能
(Vyazmensky等1996)。另外, 调节亚基与催化亚基
相互作用介导终端支链氨基酸对AHAS活性的反
馈抑制作用(Lee和Duggleby 2001, 2002; Mendel等
2001, 2003; Kaplun等2006)。与细菌AHAS不同,
植物AHAS催化亚基含有2个ACT功能结构域, 使
植物AHAS可能有与细菌AHAS不同的拓扑属性,
导致与细菌AHAS功能的差异(Hershey等1999)。
过表达植物AHAS催化亚基不能提高支链氨
基酸含量(Tourneur等1993), 表明植物AHAS的调
控方式可能更复杂。最近发现拟南芥R S U的
T119L显性突变可解除缬氨酸对AHAS的反馈抑
制, 使vat1突变体有较高的缬氨酸含量(Chen等
2010)。但该研究仅对AHAS调节亚基上点突变对
植物支链氨基酸的合成影响进行了探讨。对原核
AHAS研究表明: AHAS大小亚基同时突变导致酶
蛋白产生变构效应, 进而影响酶活性。细菌AHAS
大亚基H132、K155、E213、D217、E221、
E389、E393和S414为关键性活性位点, 除E213D
外, 其余位点突变使细菌AHAS活性完全丧失。
E213D突变使细菌AHAS的酶活性只有野生酶蛋
白的25% (Tyagi等2005)。菠菜AHAS大亚基体外
突变分析结果与细菌的相似 , 大亚基R 2 5 8、
E311、D315、E319、E488、E492、S518和T520
组成了AHAS的活性中心, 除E488D突变外, 其他
突变导致酶活性丧失, E488D突变的酶活性为野生
型的48% (Dumas等1995)。蛋白序列比对发现, 细
菌AHAS大亚基E213对应拟南芥E305, 菠菜E488
对应拟南芥E482。细菌AHAS小亚基 i l vH上
N11A、G14D、N29H、T34L、A36V及Q59L突变
对细菌AHAS的缬氨酸抗性效应与酶活性均有影
响, G14D突变酶活性为野生型的92%, 并表现出最
强的缬氨酸抗性。细菌G14D突变对应拟南芥小亚
基G88D突变(Mendel等2001)。
本研究对拟南芥AHAS大小亚基上相应于细
菌与菠菜的关键位点进行体外突变, 构建AHAS点
突变转基因植物, 观察其缬氨酸抗性表型并对转
基因植物缬氨酸含量进行测定, 考察AHAS大小亚
基关键位点突变对植物支链氨基酸合成的影响。
研究结果对揭示AHAS大小亚基相互作用方式及
提高支链氨基酸含量方法具有指导意义。
材料与方法
1 引物设计
使用Primer Premier 5.0软件进行引物设计, 研
究用所有引物由上海生物工程公司进行合成。引
物序列见表1。
2 AHAS点突变植物表达载体构建
拟南芥总RNA提取选用MS平板上生长7 d的
整株幼苗(Col-0), 使用上海生物工程公司总RNA
提取试剂盒进行(Sangon, SK1312)。提取总RNA
使用Invitrogen公司反转录酶进行cDNA第一链反转
录(Invitrogen, 18080-093), 以cDNA为模板, PCR高保
真酶扩增AHAS大小亚基CDS (Trans, AP221-01)。
野生型AHAS大亚基使用ALU-F和ALU-R引物对
进行扩增。AHAS小亚基扩增正向引物为ASU-F,
反向引物为ASU-R。AHAS大亚基第305位E305D
的正向突变引物为ALUE305D-F, 反向突变引物为
ALUE305D-R。大亚基第482位E482D正向突变引
物为ALUE482D-F, 反向引物为ALUE482D-R。
AHAS小亚基第88位G88D正向突变引物为ASUG-
88D-F, 反向突变引物为ASUG88D-R。突变引物
中下划线指示各突变碱基(表1)。PCR方式引入目
标突变, 以AHAS大小亚基基因全长正向引物与目
标突变位点反向突变引物或全长反向引物与目标
赵菲佚等: 过表达拟南芥点突变乙酰羟酸合成酶基因改变植物对缬氨酸的抗性及增强缬氨酸合成 1093
突变正向突变引物为引物对, 以cDNA为模板进行
PCR扩增, 分别扩增的PCR产物经胶回收柱(San-
gon, SK8132)回收后等量混合作为突变全长PCR模
板, 再次以基因全长两端引物进行扩增, 扩增产物
回收后进行双酶切 , 再次纯化后连接到pCAM-
BIA1307植物表达载体上。转化DH5α宿主菌, 每
个突变载体挑选2个不同克隆送上海生物工程公
司测序验证, 每个克隆重复测2次, 以2个不同克隆
4次测序结果与基因标准参考序列进行比对, 如与
参考序列相同并在目标突变位点引入正确突变,
则突变载体构建成功, 否则, 重新构建突变载体,
直至正确为止。
3 植物材料、生长条件、植物转化与鉴定
植物材料使用拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)
野生型(Col-0), 营养钵中AHAS点突变转基因植
物生长表型观察使用22 ℃下长日照(16 h光/8 h暗)
条件培养。含不同缬氨酸浓度MS竖直平板上转
基因植物初生根长表型分析使用22 ℃下连续光照
培养。
植物转化方法采用农杆菌浸蘸法, 拟转化农
杆菌GV3101在含50 μg·L-1的利复平和50 μg·L-1卡
那霉素的LB培养基中小量过夜培养, 次日接种至
250 mL与小量培养液相同的LB培养液中, 当菌液
OD600至2左右时, 4 000 r·min
-1常温离心10 min收集
菌体, 菌体沉淀重悬浮于150 mL转化液(每升含MS
盐2.22 g、蔗糖50 g、SilwetL-77 200 μL、6-BA
200 μL)中, 拟被转化植物倒置浸入转化液中20~30
s后用保鲜膜包裹, 水平放置于培养盘中24 h后转
入正常培养。转基因植物T0代种子在MS固体平板
(含40 μg·L-1潮霉素和50 μg·L-1的头孢氨苄)上进行
筛选。
用衍生型酶切扩增多态性序列(derived cleaved
amplified polymorphic sequence, dCAPS)分子标记
技术鉴定转基因阳性候选植株。AHAS大亚基
E305D及E482D, 小亚基G88D的dCAPS鉴定引物
由dCAPS Finder 2.0 (http://helix.wustl.edu/dcaps/
dcaps.html)设计如下: AHAS大亚基E305D突变鉴
定引物为E305D-F和E305D-R (ScaI切野生型)。
AHAS大亚基E482D突变鉴定引物为E482D-F和
E482D-R (EcoRI切野生型)。小亚基G88D突变鉴
表1 本研究中使用的引物序列
Table 1 Primer sequences used in this study
引物名称 引物序列(5′→3′) 限制性酶
ALU-F CTAGTCTAGAATGGCGGCGGCTACTTCATCCATC XbaI
ALU-R ACGCGTCGACTCAGTTGCTAGATTGACGCAAC SalI
ASU-F CGCGGATCCATGGCGGCGACGACGACTGCTAC BamHI
ASU-R CCCAAGCTTCTACAAAGGAAGAGAGTATCCACG HindIII
ALUE305D-F ACTCTTGAACAGGATTACAGGAGTGAC
ALUE305D-R GTCACTCCTGTAATCCTGTTCAAGAGT
ALUE482D-F CACTCTTACTCAGATATCATCAACGAG
ALUE482D-R CTCGTTGATGATATCTGAGTAAGAGTG
ASUG88D-F GGCGATGAGAGCGATATAATAAATAGA
ASUG88D-R TCTATTTATTATATCGCTCTCATCGCC
E305D-F GCCGCCGATGTTGCATTGGGATG
E305D-R AAAGATGTCACTCCAGTA
E482D-F CGCGTCAGGAAGTCCAGACCTG
E482D-R CACGGATTCAATCACACTCTCGTTGATGAA
G88D-F GACGGGAGGAAGATGAGGAATGC
G88D-R TACTCCAGCAATTCTATTTATTAGA
35S-F CTCAAGCAATCAAGCATTCTAC
ASUN-F GTCTAGCTGTTGGTCCTGCTG
ASUN-R GATGCTGAAACAACGTGCA
ALUN-F GTCCAGACCTGCTGGTGACT
ALUN-R ACTCTCGACTTAATACTCCG
序列中下划线为酶作用位点或突变碱基。
植物生理学报1094
定引物使用G88D-F和G88D-R (DpnI切突变体)。
引物中下划线为dCAPS Finder 2.0引入的突变碱
基。dCAPS鉴定过程为: 提取转化植株或野生型
基因组DNA作为模板, 对AHAS点突变转基因植物
使用CaMV35S正向引物35S-F与突变基因全长反
向引物进行PCR扩增, 扩增产物作为模板, 以设计
的上述AHAS大小亚基上点突变位点dCAPS鉴定
特异引物进行PCR扩增; 野生型对照则以提取的基
因组DNA为模板, 直接以dCAPS突变鉴定引物进
行扩增, 扩增产物回收后以设计的内切酶进行酶
切, 酶切产物经5%琼脂糖凝胶电泳分离。
4 RNA提取、分离及Northern blot分析
以拟南芥野生型(Col-0)及AHAS各转基因植
株叶片为材料, 总RNA提取采用上海生物工程公
司试剂盒(SK8661), 并按照推荐提取方法进行。所
提取总RNA定量后, 取30 μg总RNA在含甲醛的
1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳, 后转到Hybond N+尼
龙膜上进行杂交, 杂交过程参考Liu等(2000)方
法。探针使用TaKaRa公司试剂盒(D6045), 以α32P-
dCTP为底物, 植物表达载体为模板进行标记, 对
AHAS小亚基使用引物对ASUN-F和ASUN-R; 大
亚基使用引物ALUN-F和ALUN-R。杂交在42 ℃
下进行, rRNA的EB染色作为上样对照, 杂交信号
用Phosphoimager扫描。
5 AHAS点突变转基因植物表型分析
AHAS点突变转基因植物种子4 ℃春化3 d后,
用20%次氯酸钠消毒液(含0.1% TritonX-100)在EP
管中消毒10 min, 灭菌ddH2O洗5次后点种于MS固
体培养基平板上, 置于22 ℃连续光照下竖直培
养。当幼苗根长至1.5~2.0 cm时将相同大小幼苗
移入含“品氏育苗”基质(Pindstrup, 丹麦品氏托普
公司)营养钵中, 置于22 ℃长日照(16 h光/8 h暗)条
件下生长, 2周后进行生长表型观察。同时将相同
大小幼苗转移至不同浓度缬氨酸的MS处理平板
上, 22 ℃连续光照培养条件竖直培养, 转板后6 d对
转基因植物拍照, 使用ImageJ (http://rsb.info.nih.
gov/nih-image/.)软件对初生根长度进行测量。
6 自由缬氨酸含量测定
自由氨基酸含量测定使用营养钵中生长4周
的野生型(Col-0)与转基因拟南芥幼苗为材料, 测定
方法参考Hacham等(2002)的方法进行。约200 mg
幼苗在液氮中研磨至粉末状, 加入600 μL提取液
(水:氯仿:甲醇=3:5:12, V/V), 再次充分研磨至匀浆
样转入离心管中, 600 μL提取液漂洗研钵合并至离
心管中, 12 000 r·min-1离心10 min, 将上清转入另
一离心管中, 加入300 μL氯仿和450 μL水, 再次
12 000 r·min-1离心10 min, 收集上部水与甲醇相冷
冻干燥, 产物重新溶于100 μL的20 mmol·L-1 HCl
中, 取出10 μL使用AccQ衍生试剂盒进行衍生化
(Waters, http://www.waters.com/)。衍生化后的氨
基酸使用ACQUITY UPLC系统进行自由氨基酸分
析(Waters), 用缬氨酸标准品定量。
实验结果
1 拟南芥AHAS大小亚基基因与蛋白结构及其突
变位置
拟南芥AHAS由2个大亚基和2个小亚基构
成 , 大亚基为催化亚基 , 小亚基为调节亚基。
AHAS大亚基(ALU)基因定位于第3条染色体上
(At3g58610), 基因全长3 658 bp, 包含11个外显子
和10个内含子(图1-A), CDS共有1 776 bp, 编码蛋
白含591个氨基酸(图1-B)。突变第6个外显子上第
1 611位(以其转译起点计) G为T, 蛋白第305位氨基
酸由E转变为D, 突变第10个外显子第2 749位(转译
起点计) A为T, 使蛋白第482位由E变为D。AHAS
小亚基 ( A S U )基因定位于第 5条染色体上
(At5g16290), 基因全长3 981 bp, 包含13个外显子
和12个内含子(图1-C), CDS共有1 441 bp, 编码477
个氨基酸(图1-D), 属于ACT超家族。该蛋白包含2
个ACT结构域, 分别位于78~150和309~383氨基酸
区域。突变第2个外显子上第733位(以转译起点
计)的G为A, 蛋白第88位由G变为D。
2 AHAS植物转化、筛选、突变鉴定与过表达分析
将AHAS小亚基及大小亚基点突变植物过表
达载体转化拟南芥野生型(Col-0), 转基因植物筛
选、突变体鉴定及AHAS点突变基因过表达分析
如图2所示。
使用含AHAS小亚基和大小亚基点突变植物
转化载体的农杆菌对目标植物(第一次为拟南芥野
生型, 第二次为已转入第一种突变载体的转基因
植物)分别进行两次基因转化操作, 每次转化后使
用卡那霉素抗性对转基因植株进行筛选, 筛选过
赵菲佚等: 过表达拟南芥点突变乙酰羟酸合成酶基因改变植物对缬氨酸的抗性及增强缬氨酸合成 1095
程示例如图2-A~D。从图中可看出, 构建的植物过
表达转化载体已将目标突变基因转入受体植物中,
转化植物在抗性筛选平板上表现出对卡那霉素的
抗性, 说明植物至少受到一种植物转化载体的转
化。从转化后代中, 使用dCAPS鉴定AHAS小亚基
单突变体和大小亚基双突变体, 图2-E~G表明转基
因后代群体中可筛选到AHAS大小亚基均发生目
标点突变的双突变体单株。获得AHAS小亚基
G88D突变35S:G88D3#和35S:G88D20#两个单突
变体植株、大亚基E305D与小亚基G88D双突变
图1 拟南芥乙酰羟酸合成酶(AHAS)基因与蛋白结构及其突变位置
Fig.1 Schematic diagram of the Arabidopsis acetohydroxyacid synthase (AHAS) genes, proteins and positions of mutations
A与C分别示例AHAS大亚基(ALU)与小亚基(ASU)基因结构。图中黑色棒表示内含子, 兰色方框表示外显子, 红色方框表示非编码区
(UTRs), 数字表示基因从翻译起始点的核苷酸突变位置。B与D分别示例AHAS大亚基(ALU)与小亚基(ASU)蛋白结构, 突变位点箭头表示
相应于转译起始点第一个氨基酸突变位置。
图2 AHAS点突变转基因植物筛选、突变鉴定与过表达分析
Fig.2 Screening, identification of mutations and Northern analysis of transgenic plants expressing the point mutated AHAS versions
A~D: AHAS点突变转基因植物抗性筛选, 红色箭头示阳性转基因候选植株, 筛选培养基为MS+50 mg·L-1卡那霉素; E~G: AHAS点突
变阳性转基因植株dCAPS鉴定, DpnI切G88D突变体, ScaI与EcoRI分别切E305D和E482D野生型; H: AHAS点突变转基因植株过表达分析。
植物生理学报1096
体2个单株35S:E305DG88D5#与35S: E305DG-
88D19#、大亚基E482D与小亚基G88D双突变体2
个单株35S:E482DG88D7#与35S: E482DG88D16#
用于后续表型分析。为检测AHAS大小亚基突变
基因是否得到了过表达, 使用Northern方法对转入
的基因进行过表达分析。图2-H表明: 在不同的双
突变单株中, 对照野生型, AHAS小亚基G88D单突
变、大亚基E305D与E482D及小亚基G88D双突变
转基因均得到了过表达。
3 AHAS点突变转基因植物生长及缬氨酸处理下
初生根长度表型分析
AHAS小亚基突变及大小亚基双突变转基因植
株生长表型分析如图3-A。小亚基单突变体及大小
亚基双突变体转基因植株生长表型与野生型相同,
未观察到任何异常生长表型。表明当AHAS小亚基
发生单突变或大小亚基发生双突变后, 在无外源胁
迫条件时, AHAS突变不影响植物的生长表型。
AHAS合成的3种支链氨基酸中, 缬氨酸的反
馈抑制作用最为强烈(Porat等2004)。为测试当
AHAS小亚基单突变及大小亚基发生双突变后, 缬
氨酸对AHAS点突变转基因植物表型的影响, 分别
使用0、250、500和1 000 μmol·L-1外源缬氨酸对
转基因植株进行处理, 观察其表型变化, 结果如图
3-B~E。
测试结果表明, 在同一缬氨酸浓度处理下, 小
亚基G88D突变的转基因植物初生根长度均大于野
生型。说明AHAS小亚基发生G88D突变解除了缬
氨酸对AHAS的反馈抑制作用(图3-C~E), 使AHAS
小亚基单突变体或大小亚基双突变体产生对缬氨
酸的抗性, 在初生根长度上均表现出大于野生型,
此与Chen等(2010)的结果相同。在不同外源缬氨
酸浓度处理下, 与MS平板上各对照相比较, 处理板
上野生型及AHAS点突变转基因植物初生根生长
均受到抑制, 随缬氨酸处理浓度升高, 抑制程度增
加。不同缬氨酸处理浓度间初生根长度差异明显
(P<0.05) (图3-F)。此外, 在相同浓度缬氨酸处理
下, AHAS大亚基不同位置双突变体与小亚基单突
变体在初生根长度上又存在差异, E482DG88D转
基因植物相对初生根长度小于G88D转基因植物,
而E305DG88D转基因植物相对初生根长度大于
G88D转基因植物, 3种转基因植物相对初生根长度
差异显著(P<0.05) (图3-F)。说明AHAS大小亚基
图3 AHAS点突变转基因植物表型分析
Fig.3 Phenotypic analyses of transgenic plants expressing the point mutated AHAS versions
A: AHAS点突变转基因植株生长2周后生长表型; B~E: AHAS点突变转基因植株在不同浓度缬氨酸处理下初生根长度表型; F: 图B~E
中AHAS点突变转基因植株转板后6 d相对初生根长度。
赵菲佚等: 过表达拟南芥点突变乙酰羟酸合成酶基因改变植物对缬氨酸的抗性及增强缬氨酸合成 1097
同时发生突变后, 由于AHAS大亚基上的不同突变
位点对小亚基突变的影响作用存在差异, 可能对
AHAS活性产生不同影响, 使E305DG88D转基因
植物较E482DG88D转基因植物对缬氨酸处理更具
有抗性。
4 AHAS点突变转基因植物缬氨酸含量测定
为考察AHAS小亚基及大小亚基点突变转基
因植物中缬氨酸含量变化, 对AHAS转基因植株幼
苗及完全展开叶片中的缬氨酸含量进行了测定,
结果如表2所示。
表2数据表明, AHAS各转基因植株幼苗缬氨
酸含量升高, 含量达野生型的6~7倍之多。叶片缬
氨酸含量较幼苗低, 但叶片缬氨酸含量变化趋势
与幼苗中相同, 转基因植株叶片缬氨酸含量为野
生型对照的3~4倍(表2)。在AHAS大亚基不同位置
突变植株幼苗与叶片中, E305DG88D与E482DG88D
转基因植株的缬氨酸含量存在差异(P<0.05)。在
幼苗中, AHAS大亚基E482D转基因植株中缬氨酸
含量为E 3 0 5 D突变的8 2 . 5 % , 而叶片中只有
72.8%。这表明AHAS小亚基G88D突变解除了终
端产物对AHAS的反馈抑制作用, 使转基因植株缬
氨酸含量相对于野生型提高, 而大亚基E305D与
E482D不同位置突变又使转基因植株间在相应组
织的缬氨酸含量存在差异。
讨　　论
本研究发现拟南芥AHAS小亚基G88D突变可
解除缬氨酸对AHAS的反馈抑制作用, 使AHAS突
变体内缬氨酸含量提高(表2), 并在初生根长度上
表现出对外源缬氨酸抗性(图3-C~E)。此结果与在
细菌及拟南芥中的研究结果一致(Mendel等2001;
Chen等2010)。然而 , 拟南芥AHAS双突变体
E305DG88D较E482DG88D转基因植物有更强的
缬氨酸抗性, 体内积累了更多的缬氨酸(图3-C~E,
表2)。说明在AHAS小亚基上发生G88D突变解除
终端产物反馈抑制的前提下, 大亚基不同位置的
突变对植物缬氨酸合成有不同的影响。对不同物
种AHAS大亚基蛋白编码序列比对发现, ALU含有
5个保守结构域, E305与E482分别位于第3与第4个
结构域中(Tyagi等2005)。拟南芥ALU在2个关键
结构域中突变可能造成该酶活性下降, 并且不同
位点突变对酶活性有不同的影响。因而, 在缬氨
酸抗性与缬氨酸积累上, AHAS双突变E305DG88D
与E482DG88D转基因植物在对外源缬氨酸抗性与
体内缬氨酸积累上存在差异是AHAS小亚基与大
亚基上两种突变共同作用结果。
细菌AHAS小亚基具有稳定并调节其大亚基
活性的作用, 小亚基介导终端产物支链氨基酸对
酶活性调节。尽管目前尚未发现小亚基结合支链
氨基酸的直接证据, 但在体外测试中, 当存在支链
氨基酸时, 大亚基活性的确会发生变化(Pang和
Duggleby 2001)。推测AHAS活性变化与其全酶构
象相关, 本研究结果支持此推测的合理性。
拟南芥AHAS大亚基点突变中, E305D突变较
E 4 8 2 D表现出对缬氨酸抑制更具有抗性 (图
3-C~E)。拟南芥AHAS小亚基与细菌的不同, 其包
含2个ACT结构域(细菌中仅有1个)。细菌AHAS更
倾向于形成2个大亚基与2个小亚基的四聚体, 介
表2 AHAS点突变转基因植株幼苗及叶片缬氨酸含量
Table 2 Valine content of seedlings and leaves in transgenic lines expressing the point mutated AHAS
突变株类型
缬氨酸含量/pmol·mg-1 (DW)
幼苗 叶
Col-0 418.3±35.4d 330.9±7.2d
35S:G88D3# 2 867.3±125.7b 1 102.9±22.4b
35S:G88D20# 2 903.6±138.4b 1 137.5±19.1b
35S:E482DG88D7# 2 544.4±147.6c 998.7±18.4c
35S:E482DG88D16# 2 632.3±152.5c 995.7±16.3c
35S:E305DG88D5# 3 079.1±201.5a 1 320.1±36.5a
35S:E305DG88D19# 3 124.1±207.6a 1 285.3±29.4a
表中数值为3次重复的平均值±标准差; 同列不同小写字母表示差异达到显著水平(P<0.05)。
植物生理学报1098
导终端产物抑制的位置存在于2个小亚基组成的
二聚体界面上(Pang等2002, 2003)。拟南芥AHAS
小亚基含有2个ACT结构域, 对大亚基活性调节与
细菌不同, 对小亚基不同ACT结构域的突变分析
表明, 小亚基2个ACT结构域存在分子内相互作用,
2个ACT形成U型结构, 且2个ACT在介导大亚基活
性抑制中均起作用(Chen等2010)。本研究中, 相同
AHAS小亚基点突变与不同位置大亚基点突变转
基因植株在缬氨酸抗性与缬氨酸积累上存在差异,
提示AHAS大小亚基间存在相互作用。AHAS大亚
基上的不同位置突变导致不同的全酶构象, 对酶
活性产生不同的影响, 最终反映出对外源缬氨酸
的抗性与体内缬氨酸积累的不同。
AHAS可能存在由不同位点突变产生的连续
构象变化, 也可能存在构象变化的阈值效应, 在一
定的空间变化范围内, 突变效应对酶活性产生影
响, 超过一定的阈值后将完全消除酶活性。不能
排除在AHAS大小亚基上存在对AHAS活性产生影
响的其他位点。
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