全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
!"#&*#!*#+
&修改稿收到日期$
!"#$*"!*"%
基金项目$国家自然科学基金"
%##"""
!
%#!"$)
#
作者简介$赵菲佚"
#1+!(
#!男!博士!副教授!主要从事植物分子生物学研究
2*34.5
$
6/
7
4859:4;
!
#%,<;3
拟南芥乙酰羟酸合成酶"
$%$&
#点
突变原核表达与活性测定
赵菲佚!焦成瑾!田春芳!王太术!谢尚强!何丽娟
"天水师范学院生物工程与技术学院!甘肃天水
+&#""#
#
摘
!
要$拟南芥乙酰羟酸合成酶"
=>=?
#参与支链氨基酸合成为考察
=>=?
不同结构域对支链氨基酸合成的影
响!分别对其大小亚基上特定位点进行点突变后进行原核表达!体外重组后对其全酶活性进行测定!并对其终端产
物之一(((缬氨酸对
=>=?
全酶活性的影响进行探讨结果显示$
=>=?
小亚基
@))A
突变将解除其终端产物的
反馈抑制作用!而大亚基
2%"$A
与
2&)!A
的突变降低
=>=?
全酶活性!且
!
种不同突变大亚基对
=>=?
全酶活
性影响存在差异
=>=?
大亚基
2&)!A
突变较
2%"$A
突变影响更大研究结果表明$
=>=?
大小亚基间存在着
相互作用!且大小亚基不同结构域突变对
=>=?
全酶活性具有不同的影响
关键词$乙酰羟酸合成酶&点突变&原核表达&全酶活性
中图分类号$
B+)
&
B+)1
文献标志码$
=
(
)
*+,,#"-.-!/+0+*1#-.0#"-"2$30#4#0
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"206+7"#-0
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G
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7
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7
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G
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6:F
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[:.<:./;0F;N6:FN.045F0X
7
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!
;06:F4<6.W.6.F/;N6:F38646FX:;5;F0*
9
G
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7
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K
F80.6XF6.W.6
G
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G
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K
F80.6X./
7
54
G
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=>=?40X6:F2&)!A38646.;0
7
TF/F06/6:F3;TFFNNF<6/6:406:F2%"$A;06:F4<6.W.6
G
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K
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34.0/.06:F80.6/;N=>=?FY:.Z.6X./6.0<6N80<6.;0/,
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=>=?
&
7
;.0638646.;0
&
Z4<6FT.45FY
7
TF//.;0
&
:;5;F09
G
3F4<6.W.6
G
!!
缬氨酸)亮氨酸和异亮氨酸由于具有支链碳骨
架而被称为支链氨基酸支链氨基酸参与动物生长
与发育诸多代谢过程*#*%+在动物细胞中!支链氨基
酸通过信号蛋白
3LD]
"
343345.4064T
K
F6;NT4
7
4*
3
G
<.0
#进行信号传递!通过促进胞内蛋白合成及降
解过程在蛋白质合成中起着重要的作用此外!支
链氨基酸也直接或间接影响兴奋性神经递质谷氨酸
的合成与区室化过程*&+!对胺类神经递质
$*
羟色胺)
儿茶酚胺类多巴胺和去甲肾上腺素的合成也有影
响*!!$+由于动物不能从头合成支链氨基酸!只能
通过饮食获取!使植物成为支链氨基酸的重要来源
在植物)细菌及真菌中!支链氨基酸通过非常保
守的代谢途径进行合成!合成过程受合成酶底物及
合成途径终产物的严格调控*+乙酰羟酸合成酶
"
4G
XT;Y
G
4<.X/
G
06:4/F
!
=>=?
#也称乙酰乳酸
合成酶"
4G
06:4/F
#!是该代谢途径第一
个酶!催化两分子丙酮酸盐生成缬氨酸和亮氨酸的
前体物质乙酰乳酸&也能催化丙酮酸盐与
"
*
酮丁酸
生成异亮氨酸前体乙酰羟基丁酸盐*++由于
=>=?
可作为一些化学除草剂的靶点!其结构与功
能在不同生物中已有较好研究细菌
=>=?
全酶
为四聚体!由
!
个较大的催化亚基和
!
个较小的调
节亚基组成!小亚基可稳定并增强催化亚基的活
性*)+!包含
#
个保守的
=JL
结构域!大亚基则介导
终产物的反馈抑制作用对植物
=>=?
研究表明$
植物
=>=?
大小是细菌的
!
倍!催化亚基含有
!
个
=JL
结构域!推测植物
=>=?
的构象可能与细菌
不同*1+
基于植物
=>=?
在支链氨基酸代谢中的关键
作用!研究者试图过表达该基因各自的亚基来提高
植物体内的支链氨基酸含量!但实验结果均未达到
预期目标*#"*##+对细菌
=>=?
大亚基的研究确定
了
>#%!
)
#^$$
)
2!#%
)
A!#+
)
2!!#
)
2%)1
)
2%1%
和
?&#&
为其关键位点!除
2!#%A
外!其余位点的突变
使细菌
=>=?
酶活性完全丧失!
2!#%A
的突变使细
菌
=>=?
的酶活性只有野生型酶蛋白的
!$_
*
#!
+

波菜
=>=?
大亚基体外突变分析结果与细菌相似!
大亚基
]!$1)
)
2%##
)
A%#$
)
2%#1
)
2&))
)
2&1!
)
?$#)
和
L$!"
组成
=>=?
的活性中心!除
2&))A
突变
外!其它突变均消除了该酶活性!
2&))A
突变使其
酶活性为野生型的
&)_
*
#%
+
对
=>=?
氨基酸序列
在不同物种间的比对分析发现!细菌
2!#%
与拟南
芥
2%"$
对应!而波菜
2&))
与拟南芥
2&)!
相对应
细菌
=>=?
小亚基
.5W>
中!
M##=
)
@#&A
)
M!1>
)
L%&R
)
=%`
及
B$1R
突变对细菌
=>=?
全酶活性
与对缬氨酸的敏感性有影响!其中
@#&A
突变具有
野生型
=>=?
酶活性的
1!_
!并使细菌具有对缬
氨酸最强烈的抗性!比对发现此突变与拟南芥小亚
基
@))A
突变相对应*#&+
近期
J:F0
等*#$+通过正向遗传学筛选到拟南芥
突变体
+#,#
"
W45.0F*6;5FT406#
#!并发现催化亚基的
L##1R
突变可解除终产物抑制!使支链氨基酸含量
增加植物
=>=?
全酶催化亚基与调节亚基间存
在着相互作用!进而影响
=>=?
催化活性已有研
究多集中于对
=>=?
各自亚基功能的探讨!对大小
亚基上关键结构域同时突变!并从全酶水平进行活
性研究未见报道本研究对拟南芥
=>=?
两亚基
不同位置进行体外突变!然后在原核细胞中分别表
达!不同突变亚基蛋白经体外重组后测定
=>=?
全
酶活性变化研究结果在理论上将为了解
=>=?
亚基间相互作用提供信息!实践上将为提高支链氨
基酸含量的基因操作提供依据
#
!
材料和方法
=,=
!
实验材料
拟南芥野生型"
J;583Z.4*"
#订购自
?=R^
"
:6*
6
7
$%%
/.
K
045,/45a,FX8
%#种子用含
",#_LT.6;0P*
#""
的
!"_
次氯酸钠消毒液在
2b
管中消毒
#!
3.0
!灭菌
XX>
!
D
漂洗
$
次后!点种于
\?
固体培养
基平板上置于
&c
下春化
!
#
%
后移至
!!c
连续
光照条件下竖直培养
=>?
!
$%$&
点突变原核表达载体构建
平板上生长
+X
的拟南芥整株幼苗!提取其总
]M=
!采用上海生物工程公司总
]M=
提取试剂盒
进行"
?40
K
;0
!
?^ #%#!
#!提取的总
]M=
使用
.0*
W.6T;
K
F0
公司反转录酶进行
第一链反转录
"
.0W.6T;
K
F0
!
#)")"*"1%
#!以
为模板!使用高
保真酶进行
=>=?
大小亚基
JA?
全长
bJ]
扩增
"
LT40/
!
=b!!#*"#
#野生型
=>=?
大亚基使用引
物
=RVE
"
$d*JJ@@==LLJ=L@@J@@J@@JL=*
JLLJ=LJJ=LJ*%d
#和
=RV]
"
$d*JJJ==@JLL*
LJ=@LL@JL=@=LL@=J@J==J*%d
#&野 生 型
=>=?
小亚基使用
=?VE
"
$d*J@J@@=LJJ=L@*
@J@@J@=J@=J@=JL@JL=J*%d
#和
=?V]
"
$d*
JJJ==@JLLJL=J===@@==@=@=@L=LJJ*
=J@*%d
#&
=>=?
大亚基在第
%"$
位
2%"$A
的正向
突变引物为
=RV%"$E
"
$d*=JLJLL@==J=@@=*
LL=J=@@=@L@=J*%d
#!反向突变引物
=RV%"$]
%
&
期
!!!!!!!!!
赵菲佚!等$拟南芥乙酰羟酸合成酶"
=>=?
#点突变原核表达与活性测定
"$d*@LJ=JLJJL@L==LJJL@LLJ==@=@L*%d
#&
=>=?
大亚基第
&)!
位
2&)!A
正向突变引物为
=RV&)!E
"
$d*J=JLJLL=JLJ=@=L=LJ=LJ*
==J@=@*%d
#!反向引物为
=RV&)!]
"
$d*JLJ@L*
L@=L@=L=LJL@=@L==@=@L@*%d
#
=>=?
小亚基第
))
位
@))A
正向突变引物
=?V))E
"
$d*
@@J@=L@=@=@J@=L=L==L===L=@=*%d
#!
反 向 突 变 引 物 为
=?V))]
"
$d*LJL=LLL=L*
L=L=LJ@JLJLJ=LJ@JJ*%d
#引物中下划线
标记各酶切位点
bJ]
扩增产物经胶回收柱
"
?40
K
;0
!
?^ )#%!
#纯化后双酶切!再次纯化后连接
到
7
2L!)4
表达载体上!所有克隆序列送上海生物
工程公司进行测序!确认克隆正确后分别进行
=>=?
大小亚基蛋白原核表达
=>@
!
$%$&
突变大小亚基蛋白原核表达
将测序正确的原核表达载体转入
SR!#
"
A2%
#
菌株!按
#e#"""
的比例接种至
"3R
含
$"
$
K
%
R
卡那霉素的
RS
液体培养基!
%+c
过夜小量培养
次日将
#"3R
过夜培养物转入
#R
含
$"
$
K
%
3R
4^0
的
RS
培养基中继续培养!当菌液
DA
""
达
",
时收菌!
&"""T
%
3.0
离心!沉淀加入
%"3R
裂解液
"
$" 33;5
%
R M4>
!
bD
&
!
%"" 33;5
%
R M4J5
!
#"
33;5
%
R.3.X49;5F
!
7
>),"
#重悬!在超声破碎仪上
破碎后
#!"""T
%
3.0
离心!上清液中加入
B.4
K
F0
公
司
M.*ML=
树脂!重组蛋白提取按
B.4
K
F0
公司树
脂使用方法进行纯化蛋白保存于
&c
冰箱备用
=>A
!
$%$&
突变大小亚基蛋白体外重组与全酶活
性测定
=>=?
蛋白酶大小亚基体外重组与全酶活性
测定按照
\4T.4`
G
493F0/a
G
的方法进行*)+!并依
据发表文献进行部分修改*#*#++野生型及各突变等
量
=>=?
大小亚基蛋白"
$""
$
K
#加入
$""
$
R
重组
缓冲液
=
"
,#33;5
%
RE=A
!
#"33;5
%
R2AL=
!
#
33;5
%
RALL
!
",#3;5
%
R
磷酸钾缓冲液!
7
>+,
#
中
%+c
保温
#$3.0
使
=>=?
大小亚基进行重
组!后加入
$""
$
R
缓冲液
S
"
)"33;5
%
R
丙酮酸钠!
",!33;5
%
RLbb
!
"33;5
%
RK
J5
!
!
","$33;5
%
R
E=A
!
#33;5
%
RALL
!
#"33;5
%
R2AL=
溶解于
",#3;5
%
R
磷酸钾缓冲液中!
7
>+,
#!至已保温完
全的缓冲液
=
中开始反应此反应混合液在
%+c
保温
%" 3.0
后加入
#
%
#"
总反应体积的
#"_
>
!
?D
&
以终止反应!在
"c
下加热
#$3.0
使乙酰
乳酸转变为
%*
羟基
*!*
丁酮!再加入
#!"
$
R#,+_
肌
酸!使用
!,$3;5
%
RM4D>
调节反应液至碱性!后
加入
#&"
$
R
"
*
奈酚!
"c
保温
#$3.0
使其显色
反应生成的
%*
羟基
*!*
丁酮使用
J=]f$"S.;
分光
光度计在
$!$03
下进行比色测定在此反应条件
下!一个酶活力单位定义为
#
$
3;5
乙酰乳酸在
#
3.0
内生成的产物测定重复
%
次!计算均值与标
准差外源加入缬氨酸对
=>=?
酶活性影响测定
方法除在缓冲液
S
中加入所需浓度的缬氨酸外!其
余步骤与上述标准测定方法相同
!
!
结果与分析
?>=
!
$%$&
蛋白结构及其突变位置
拟南芥
=>=?
全酶由
!
个相同的大亚基和
!
个相同的小亚基构成!大亚基为催化亚基!小亚基为
调节亚基
=>=?
大亚基"
=RV
#定位于拟南芥第
$
条染色体上"
=6$
K
$)#"
#!其
JA?
共有
#++%Z
7
!
编码蛋白含
$1#
个氨基酸蛋白第
%"$
位氨基酸由
2
转 变 为
A
!导 致 第 一 个 大 亚 基 突 变 蛋 白 为
=RV
2%"$A
!第
&)!
位氨基酸由
2
转变为
A
形成该大
亚基第二个突变蛋白
=RV
2&)!A
"图
#
!
=
#
=>=?
小亚基"
=?V
#定位于拟南芥第
%
条染色体上
"
=6%
K
#!1"
#!其
JA?
其有
#&&#Z
7
!共编码
&++
个
氨基酸!属于
=JL
超家族小亚基蛋白包含
!
个
=JL
结构域!分别位于
+)
#
#$"
和
%"1
#
%)%
氨基
酸区域蛋白第
))
位氨基酸由
@
转变为
A
形成小
亚基突变蛋白
=?V
@))A
"图
#
!
S
#
?>?
!
$%$&
原核表达载体构建
=RV
野生型与
=RV
第
%"$
位
2
突变为
A
的
=RV
2%"$A
)第
&)!
位
2
突变为
A
的
=RV
2&)!A突变蛋
白和
=?V
野生型及
=?V
第
))
位
@
突 变为
A
的
图
#
!
=>=?
蛋白大小亚基结构与突变位置示意
=,=RV
结构与突变位置&
S,=?V
结构与突变位置&
图中数字表示从翻译起点处氨基酸位置&
=JL,=JL
结构域
E.
K
,#
!
?<:F346.K
T43/;N6:F54T
K
F40X/34580.6/
40X6:F386406
7
;/.6.;0/;N6:F=>=?
7
T;6F.0
=,?6T8<68TF;N=RV40X6:F386406
7
;/.6.;0/.06:F386406=RV
WFT/.;0
&
S,?6T8<68TF;N=?V40X6:F386406
7
;/.6.;0.06:F
386406=?VWFT/.;0
&
M83ZFT/.0X.<46F6:F386406
7
;/.6.;0/
TF546.WF6;6:F6T40/546.;0/64T6/.6F
&
=JL,=JLX;34.0
&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
=?V
@))A突变蛋白
JA?
以
bJ]
方式进行扩增!并被
克隆到原核表达载体
7
2L!)4
中"图
!
#从图
!
可
看出!
bJ]
扩增产物与
=>=?
大小亚基片段大小
相符合!大亚基片段大小为
#,+aZ
!小亚基大小约
#,&aZ
扩增片段连接到
7
2L!)4
后经酶切验证克
隆正确!用于后续表达试验
?>@
!
$%$&
突变蛋白原核表达
将构建并测序验证的
=>=?
大小亚基及其突
图
!
!
=>=?
大小亚基及其突变形式原核表达载体构建
#
,AR!"""
&
!
,
%
AM=
%
-.]
&
g/%*X

&
#
#
$
分别为
=RV
)
=?V
)
=RV
2%"$A
)
=RV
2&)!A及
=?V
@))A
&

#
#"
分别为
#
#
$bJ]
产物克隆至原核表达载体
7
2L!)4
后
经
0#1>
&
与
2#3
&
双酶切鉴定
E.
K
,!
!
J;0/6T8<6.;0;N6:FZ4<6FT.45FY
7
TF//.;0WF<6;T/;N6:F
=>=?54T
K
F40X/34580.6/40X386406WFT/.;0/;N=>=?
#
,AR!"""
&
!
,
%
AM=
%
-.4
&
g/%*X

&
#($.0X.<46F6:FbJ]
7
T;X8<6/;N=RV
!
=?V
!
=RV
2%"$A
!
=RV
2&)!A
40X=?V
@))A
!
TF/
7
F<6.WF5
G
&
(#".0X.<46F6:F0#1>
&
%
2#3
&
X;8Z5FX.
K
F/6.;0
WFT.N.<46.;0;N<;0/6T8<6/.0[:.<:6:FbJ]
7
T;X8<6/;N540F/
#($[FTF<5;0FX.06;6:F
7
2L!)4Z4<6FT.45FY
7
TF//.;0WF<6;T/
变形式原核表达载体转入原核表达菌株
SR!#
"
A2%
#进行大小亚基蛋白分别表达!表达的不同形
式蛋白经
>./
标签纯化!经
#!_?A?*b=@2
蛋白
胶检测结果见图
%

图
%
!
=
显示!
=RV
及其
!
种突变形式
=RV
2%"$A
)
=RV
2&)!A均得到正确表达!其大小都在其预测的
$
aA
从图
%
!
S
可看出!
=?V
及
=?V
@))A也得到了表
达!预测大小为
$%aA
!然而小亚基的表达除有一条
表达主带外!还有其它非特异性条带存在为进一
步确认
=>=?
大小亚基表达的正确性及小亚基的
正确位置!对所纯化的蛋白使用抗
>./
标签抗体进
行
OF/6FT0
检测"图
%
!
J
#结果表明!
=>=?
大小
亚基均为
>./
融合蛋白!其与预测大小符合!且
=>=?
小亚基位于非特异性条带下方
?>A
!
$%$&
突变蛋白体外重组与全酶活性测定
为考察
=>=?
各亚基不同点突变形式对其全
酶活性的影响!对已在原核中表达的
=>=?
亚基的
不同突变形式在体外进行重组!并对重组的全酶活
性及不同缬氨酸浓度对全酶活性影响进行了测定结
果见图
&

图
&
表明!当
=>=?
大亚基第
%"$
位或其第
&)!
位由谷氨酸变为天冬氨酸"
2
突变为
A
#!而小
亚基第
))
位由甘氨酸变为天冬氨酸时"
@
突变为
A
#!不同的大亚基突变形式与突变的小亚基重组后
依然表现出酶活性!但不同的突变大亚基形式与突
变小亚基组合对其全酶活性的影响不同与未突变
图
%
!
=>=?
大小亚基及其突变蛋白表达与纯化
=,=RV
)
=RV
2%"$A和
=RV
2&)!A
>./
标签融合蛋白表达与纯化&
S,=?V
及
=?V
@))A
>./
标签融合蛋白表达与纯化&
J,=?V
与
=?V
@))A
>./
标签融合蛋白
OF/6FT0
检测!图中上部为纯化蛋白考马斯亮蓝染色"
JSS
#!下部为
>./
标签抗体杂交结果
E.
K
,%
!
2Y
7
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7
8T.N.<46.;0;N6:F:FY4:./6.X.0F*64
KK
FX
7
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=>=?54T
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FX
7
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!
=RV
2%"$A
40X=RV
2&)!A
&
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KK
FX
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@))A
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J,OF/6FT0Z5;66.0
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;N6:F
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K
0.N.F/6:FOF/6FT0Z5;66.0
K
XF6F<6.;0
$
&
期
!!!!!!!!!
赵菲佚!等$拟南芥乙酰羟酸合成酶"
=>=?
#点突变原核表达与活性测定
图
&
!
突变
=RV
与
=?V
重组酶不同缬氨酸浓度下活性
=,
突变
=RV
与
=?V
重组全酶活性&
S,
不同浓度缬氨酸处理下突变
=RV
与
=?V
重组全酶活性
E.
K
,&
!
=<6.W.6.F/;N6:FTF<;0/6T8<6FX:;5;F09
G
3F/;N6:F38646FX=RV40X=?V80XFTW4T.;8/<;0=,=<6.W.6.F/;N6:FTF<;0/6T8<6FX:;5;
G
09
G
3F/;N6:F38646FX=RV40X=?V
&
S,=<6.W.6.F/;N6:FTF<;0/6T8<6FX:;5;F09
G
3F/
;N6:F38646FX=RV40X=?V80XFTW4T.;8/<;0的野生型全酶相比较!发生点突变后的全酶活性均
降低!下降最快的为大亚基发生
2&)!A
的突变形式
"图
&
!
=
!红色柱#!说明当
=>=?
的大小亚基不同
结构域突变会对其全酶活性产生影响为考察缬氨
酸对不同突变形式
=>=?
酶活性的影响!在不同突
变形式的重组体系中加入终浓度为
#33;5
%
R
缬氨
酸!并对此条件下
=>=?
酶活性进行了测定"图
&
!
=
!绿色柱#与无缬氨酸加入时不同!测试体系中
存在缬氨酸时!
=>=?
野生型蛋白酶活性受到抑
制!而突变形式
=>=?
酶活性被抑制的程度小于其
未突变的酶形式在大亚基
!
种不同突变形式中!
大亚基
2%"$A
突变形式酶活性被抑制的程度最小
此结果一方面说明!当
=>=?
小亚基发生
@))A
突
变时的确部分解除了其终端产物对全酶的抑制作
用!另一方面说明在小亚基与大亚基同时存在突变
时!大亚基上的突变又可部分减弱由于小亚基突变
导致的其终端产物对酶活性的影响!且在大亚基不
同位置的点突变对此减弱的程度存在差异
此外!对不同
=>=?
突变形式在不同浓度缬氨
酸存在时对其活性影响也进行了测定"图
&
!
S
#!结
果表明!在不同缬氨酸浓度下!野生型及突变形式
=>=?
活性均随着缬氨酸浓度的升高而降低!野生
型
=>=?
的活性降幅最大!在缬氨酸
"
#
","#
33;5
%
R
区 间 内!降 幅 达
$_
!而 突 变 形 式 的
=>=?
在此区间内的降幅与野生型相比则较小!大
亚基
2&)!A
突变的降幅为
%),#_
!而
2%"$A
的突
变降幅仅为
##,+_
在缬氨酸从
"
#
&33;5
%
R
区
间内!野生型
=>=?
活性的降幅平均为
)+,#_
!
2%"$A
的平均为
+",$_
!
2&)!A
为
)",)_
此结
果说明!当存在不同浓度缬氨酸终产物时!其对
=>=?
活性的抑制由于
=>=?
在大亚基上不同位
置的突变而有差异!与其在
#33;5
%
R
浓度下的测
定结果相似!在不同浓度缬氨酸影响下!呈现出突变
形式
=>=?
活性下降较野生型小!而在
!
种突变形
式
=>=?
中!
2%"$A
对终产物的反馈抑制影响又较
2&)!A
小!且缬氨酸对
=>=?
活性的抑制浓度集中
于
"
#
","#33;5
%
R
的狭窄区间内
%
!
讨
!
论
支链氨基酸是动物的必需氨基酸!植物是这些
氨基酸的主要来源植物
=>=?
作为支链氨基酸
合成途径中的第一个酶!其活性变化与调节在支链
氨基酸合成中起着关键性的作用植物中提高此类
氨基酸含量无法以过表达该基因的方式实现*+!##+!
对
=>=?
酶蛋白精细结构及活性调控研究成为实
现此目标的重要途径
本研究中!对拟南芥
=>=?
点突变大小亚基体
外表达与活性测定表明$
=>=?
野生型及不同位置
发生突变的大小亚基以融合蛋白方式在原核中均可
进行表达!纯化的原核表达大小亚基蛋白在体外可
进行重组!且全酶均表现出酶活性!然而在不同的突
变方式下其全酶活性存在差异在无缬氨酸存在
时!
=>=?
大亚基
2%"$A
或
2&)!A
与小亚基
@))A
突变组成的全酶与墅生型相比其活性均降低!其中
2%"$A
活性为野生型的
+&,&_
!
2&)!A
为
$),#_

当
=>=?
大亚基不同结构域特定位置发生点突变

西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
时!其活性会降低!此结果与在细菌及波菜中的研究
结果一致然而!在拟南芥中!与细菌或波菜的对应
位点突变后!其活性降低程度与细菌与波菜中不同
比对不同物种
=>=?
蛋白编码序列发现!其序列含
有
$
个保守结构域!
2%"$
与
2&)!
处于第
%
与第
&
个结构域中!在拟南芥中!两个结构域上位点突变均
导致酶活性的下降!但下降幅度与其它物种不同!此
可能是由于拟南芥
=>=?
序列及其空间结构上的
不同所致在细菌与波菜中!第
%
与第
&
结构域在
反应中可结合镁离子!第
%
结构域介导后续还原反
应!而第
&
结构域介导后续异构化反应过程*#!*#%+
当在此两个结构域上特定位点发生突变后!对
=>=?
活性在总趋势为下降的同时!也存在物种特
异性
=>=?
小亚具有稳定并调节大亚基活性的作
用!也介导了支链氨基酸终端产物对全酶的活性调
节!尽管目前未发现小亚基结合支链氨基酸的直接
证据!但对酵母
=>=?
活性体外测定发现!当存在
支链氨基酸时!其大亚基活性的确会发生变化*#)+
已有研究发现!在支链氨基酸作为终端产物时!在缬
氨酸)亮氨酸和异亮氨酸中!对其活性起主要影响的
为缬氨酸!而其它两种的影响较小*#1+本研究中!
当缬氨酸在体外活性测定体系中达
#33;5
%
R
时!
对
=>=?
全酶活性影响与无缬氨酸时显示出不同
的效果!其对大亚基
2%"$A
突变酶活性影响较小!
而对
2&)!A
的影响较大不同缬氨酸浓度对
=>=?
野生型及突变形式全酶活性的影响测定中
也发现!其活性变化与在
#33;5
%
R
浓度下的趋势
相同!在不同缬氨酸浓度下!野生型与突变形式
=>=?
全酶活性均受到终端缬氨酸的抑制!对突变
形式的影响较野生型小!在
!
种大亚基突变形式中!
2%"$A
突变较
2&)!A
表现出对终端抑制更具有抗
性!且此抑制效应存在于
"
#
","#33;5
%
R
狭窄的
浓度范围内此抑制抗性效果显然来源于
=>=?
小亚基
@))A
突变已有研究显示$当此位点突变
后可解除终端支链氨酸对
=>=?
的活性抑制作用!
拟南芥
=>=?
小亚基与细菌不同!含有
!
个
=JL
结构域"细菌中仅含有一个#!在细菌体内!
=>=?
更倾向于形成
!
个大亚基与
!
个小亚基的四聚体!
而介导终端产物抑制位置存在于
!
个小亚基组成的
二聚体界面上*!"*!!+拟南芥中!由于小亚基含有两
个
=JL
结构域!其在调节大亚基活性的过程中与
其它物种的不同!已有对小亚基不同
=JL
结构域
突变分析表明!其作用方式为在小亚基上的两个
=JL
结构域存在着分子内的相互作用!
!
个
=JL
形成
V
型结构!且
!
个
=JL
在介导大亚基活性抑
制中均起作用*#$+本研究结果表明!一方面当小亚
基特定位点"
@))A
#发生突变后消除了其对大亚基
活性的反馈抑制作用!另一方面!由于大亚基上同时
存在的突变使得其对大亚基活性的抑制影响又存在
差异
本研究中!对
=>=?
大小亚基同时进行突变!
在小亚基上突变可解除终端产物抑制的前提下考察
大亚基不同位点对全酶活性的影响已有研究中!
=>=?
小亚基可通过与大亚基解离与结合达到调
节全酶活性目的基于本研究结果!可推测
=>=?
终端支链氨基酸对其活性影响来源于其全酶空间结
构变化!一方面!终端产物的结合可使
=>=?
小亚
基空间结构发生变化!且不同浓度终产物对其结构
变化影响不同!另一方面结构变化后的小亚基与大
亚基的相互作用也将会对大亚基的空间结构产生影
响!而
=>=?
大亚基不同活性位点突变所产生的结
构变化也会反映于全酶最终活性上对
=>=?
而
言!可能存在不同位点突变产生的连续结构变化和
阈值效应!当在一定空间变化范围内!该结构变化仅
不同程度地影响全酶活性!而超过阈值后将完全消
除其酶活性不能排除在其大小亚基上是否存在已
研究位点之外对
=>=?
活性可产生影响的其它位
点!对此推测的验证及
=>=?
突变后体内功能评估
是本研究的下一步工作
参考文献!
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