全 文 ：文章编号:1002-8110(2002)06-0077-03
低双乙酰啤酒酵母工程菌的构建
李　艳1 ,铁翠娟2 ,王正祥1 ,张博润2 ,诸葛健1
(1.江南大学 教育部工业生物技术重点实验室 ,江苏 无锡 214036;2.中国科学院微生物研究所 ,北京 100080)
摘　要:利用PCR技术以啤酒酵母QY的染色体为模板扩增出含有乙酰羟酸合成酶(AHAS)基因 ILV2 的片段 ,
将 ILV2基因的内部 EcoRI 片段连接到整合载体 YIp5 上 , 并在该载体的 Bam HI-SalI 位点插入铜抗性基因
CUP1-MT1 , 构建了 YIpCE 质粒 ,将其转化啤酒酵母 QY, 所得到的转化子 AHAS 酶的活力比受体菌 QY 降低
75%左右 , 在发酵测试中 ,转化了产生双乙酰的量比原始菌株降低 30%。
关键词:啤酒酵母;乙酰羟酸合成酶;ILV2;基因破坏
中图分类号:TS262.5;TS261+1　　　　文献标识码:A
　　双乙酰是啤酒主要风味物质 , 在啤酒中的阈值很低 , 当
双乙酰在啤酒中的浓度超过阈值会产生一种不愉快的馊酸
味。它是由酵母异亮氨酸-缬氨酸(Ile-Val)生物合成途径
中的中间产物α-乙酰乳酸渗透到胞外经非酶促氧化脱羧反
应生成的。一般在啤酒发酵后期还原双乙酰需要约 5 到 6
周时间 ,因而双乙酰的形成与消除是啤酒风味成熟的重要限
速步骤。随着对酵母形成双乙酰机理及其分子遗传学的逐
渐了解 ,国外有关学者开始用基因工程的手段修饰异亮氨酸
-缬氨酸合成途径中相关的基因来构建低双乙酰羟酸合成
酶催化丙酮酸和活性乙醛在胞内过量合成双乙酰的前体物
质α-乙酰酸。本文报道了部分乙酰羟酸合成酶基因缺失的
啤酒酵母菌的构建。
1　材料和方法
1.1　材料
1.1.1　菌种和质粒(表 1)
1.1.2　培养基和工具酶:LB培养其按常规配制[ 4] , 使用前根
据需要加入 100μg/mL Amp , 50μg/mL Tet。培养酵母菌及酵母
转化子用 YEPD培养基[ 5] 。限制性内切酶 , T4DNA 连接酶 ,
Taq DNA 聚合酶 , Alkaline Phosphatase购自华美公司。
收稿日期:2002-09-19
作者简介:李　艳(1973-), 女 , 江苏徐州人 , 江南大学在读
博士生。
　　表 1　 菌种与质粒
Strain and plasmid Genotype Source
E.coli DH5a supE44 ΔlacU169hsd R17 recAl
endAl gyrA96thi-lrelAl Our lab.
QY Wilde type Our lab.
YEP352 AmpRURA3 Our lab.
pCM1-1 AmpRLEU2CUP1-MT1 Provided by
Pro.Winge
pMT1 AmpRURA3 This study
YIp5 AmpRtetRUEA3 Our lab.
pLZ-2 AmpRURA3ILV2 This study
YIpE AmpRtetRUEA3 This study
YIpCE AmpRtetRUEA3 CUP1-MT1 This study
1.2　方法
1.2.1　转化 E.coliDH5α法进行[ 4] , 转化啤酒酵母 QY采用完
整细胞转化法[ 5] 。
1.2.2　啤酒酵母总 DNA的提取方法[ 5] 。
1.2.3　引物合成与 PCR扩增:根据文献报道的 ILV2 基因序
列[ 6]设计 PCR 反应的引物。 5 端引物:5 GCA GGATCCBamHI
GGCTTCAGTTGCTGACT-3
3 端引物:5 CAGGTCGACGGCCACTG TTCTTATGCTT-3
为垂直投影长而非实长);4 、分别计算出各线段实际长度;如
bC实长= bC 2　　投影长+H 2　高度5 、各线实长求出后即可做出展开
图(具体作图步骤与天方地圆相同 , 见相关资料);例如外料
斗的展开见图 3。
内外料斗制做完成后 ,准备安装。在安装前应已制做好
料斗的底部支撑(其结构略)。首先安装外料斗 , 把外料斗安
置在底部支撑上 ,使其弧段外壁与仓体底部内壁紧密接触并
焊接牢固 ,外料斗之间配合处也牢固焊接;后安装内料斗 , 把
内料斗安置在底部支撑上 , 使内 、外料斗配合处楞边对齐找
正后焊接 ,内料斗间配合处楞边焊接。最后在料斗的各配和
楞边处用角钢焊接牢固 ,以提高强度及加强封闭性。
经实践证明此多底斗结构可大大提高脱脐率 , 经济效益
十分明显。只是在制做安装中存在些难度 , 但只要细心琢
磨 ,认真研究 , 一切都会迎刃而解。
第 29卷　第 6期
2 0 0 2 年 1 1月　 　　　　　　　　　　　　　　　　　
酿　　酒
LIQUORMAKING
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.29 ,No.6
Nov., 　2002
　　以QY总 DNA为模板扩增 ILV2 基因 , PCR反应体系:10x
缓冲液 5μL , 4dNTP(2mmol/ L)20μL , 12.5μmolo/L 引物各 2μL ,
模板 2μL , TaqDNA Polymerase1μL , 用无菌水调整至 50μL。 94
变性 5min ,加入 Taq 酶。循环参数:94℃变性:40s;52℃退火
2min;72℃延伸 3min ,其 30 个循环 ,最后 72℃延伸 15min。
1.2.4　AHAS 酶活的测定方法:通透细胞测定法[ 7] , 蛋白质
含量用考马斯蓝染色法测定 ,以牛血清白蛋白作为测定参照
标准[ 8] 。酶活力单位(U)的定义为:在规定条件下每小时生
成 1μmol的乙酰乳酸时所需的酶量。
1.2.5　酵母转化子铜抗性测定:将酵母菌受体及转化子在
无菌水中饥饿 2 ～ 4h 后 , 分别点种于不同浓度 CuCO4 的
YEPD平板上 , 28℃培养 48h ,观察生长情况。
1.2.6　双乙酰含量测定[ 9] 。
2　结果与讨论
2.1　质粒 PLZ-2 的构建
用 PCR方法以啤酒酵母总 DNA为模板扩增 ILV2 基因 ,
产物电泳结果显示在 2.9Kb附近出现特异的单一 DNA条带 ,
与文献报道大小一致。载体 YEP352 和 PCR扩增产物分别用
BamHI和 SalI 双酶切 , 低熔点胶回收后连接 , 转化大肠杆菌
DH5α, 采用小量抽提质粒的方法筛选到有 ILV2 基因插入的
重组质粒 pLZ-2 , 酶切分析与预期结果一致。
2.2　重组质粒 YIpCE 的构建与酶切分析
图 1　重组质粒 YIpCE的构建
图 2　重组质粒 YIpCE酶切分析
质粒 pLZ-2 用 EcoRI 酶切后 , 低熔点琼脂糖凝胶回收
LIV2 内部的 2024bp EcoRI 片段 , 将其插入到质粒 YIp5 的
EcoRI 位点上 ,得到质粒 YIpE。同时用 BamHI/ EcoRi 酶切质
粒 pCM1-1 , 用 EcoRI/SalI 酶切质粒 pMT1 , 分别回收酶切下
来的0.43KbCUPl启动子片段和 0.9KbMT1片段 , 在T4 连接酶
的作用下将这两个片段插入质粒 YIpE 的 BamHI/SalI 位点
上 ,转化 DH5α,将转化子分别转移至含有四环素和氨苄青霉
素的平板上 ,挑取 Amp r、Tets 菌落提取质粒 , 经酶切分析(图
2),筛选得到重组质粒 YIpCE(图 1), 此质粒带有铜抗性基
因 ,可用来筛选啤酒酵母转化子。
2.3　啤酒酵母 QY 转化子的获得及AHAS 酶活性的测定
用 BglⅡ酶切重组质粒 YIpCE , 使其线性化 , 这样在与酵
母基因组具有同源性的区域切断质粒将会极大的提高该位
点重组的特异性和频率。采用完整细胞转化法将线性化的
YIpCE转化 QY。QY能在含 4.5mmol/ LCuSO4的 YEPD平板上
生长 ,因此选择含 5mmol/ LCuSO4的 YEPD平板用于转化子的
筛选。从 5mmol/LCuSO4 的 YEPD平板上随机挑选 50 个转化
子 ,按方法所述测其铜抗性。 结果表明转化子均能在含
5.5mmol/ LCuSO4 的 YEPD 平板上生长 , 而 QY 在 5.5mmol/
LCuSO4的 YEPD平板上不能生长。
线性化的 YIpCE 质粒两侧的游离末端与 QY 染色体上
ILV2 基因具有同源序列 ,转化后应整合在 QY染色体的 ILV2
位点上 , 因 YIpCE 质粒所携带的是功能丧失的 ilv2 基因 , 整
合后在酵母染色体上产生一个 ilv2基因重复(包括整合的质
粒), 但 ilv2 基因的每一个拷贝都不完整:其中一个丢失 3′
端 ,另一个丢失 5″端 ,破坏了 ILV2 基因的完整功能。本文研
究所用的啤酒酵母 QY 是 Saccharomyces Carlsbergensis。近年
来 ,嘉士伯实验室对该种酵母的遗传学研究表明 ILV2 基因
在该种酵母中以两种不同结构的等位基因形式存在 , 其中一
个等位基因序列相似于酿酒酵母(S..Cerevisiae)的 ILV2 基
因 ,另一个等位基因序列则不同于酿酒酵母 , 两者之间不能
发生同源重组 , 其编码的酶以一对同功酶形式存在[ 10] 。
YIpCE质粒所携有的 ilv2基因 EcoRI 片段序列来源于相似于
酿酒酵母的那个 ILV2 基因 , 因而只能和 QY 染色体的一个
ILV2 等位基因发生同源整合 ,保留了另一个等位基因功能的
完整 ,这种整合结果正是我们所希望的 , 因为如果全部破坏
了 ILV2 基因 ,酵母将不能合成 AHAS 酶 , 会形成异亮氨酸和
缬氨酸缺陷 ,从而影响其发酵性能 , 从 QY转化子中随机挑选
3 个转化子测定 AHAS 酶活性。从表 3 结果可以看出转化子
的AHAS 酶活比原始菌株 QY降低 75%左右 , 表明重组质粒
Y
QY降低了 40%, 6d后的嫩啤酒中双乙酰含量比 QY降低了 30%。表 2　 啤酒酵母 QY转化子AHAS 酶活性
Yeast strain QY Yq-1 Yq-2 Yq-3
AHAS activty(μmol/Lα- actolactate
formed/ h.mg protein) 0.5 0.14 0.11 0.13
2.4　啤酒发酵液中双乙酰含量的变化曲线
Yq -2 和 QY 菌株在实验室活化扩培 , 接到装有
300mL12°P麦汁的三角瓶中 , 12℃发酵 6d , 每隔 24h 取样测定
发酵液中双乙酰含量 , 结果如图 , 可以看出在整个发酵过程
中 Yq-2 产生双乙酰的量比较低 , 其双乙酰峰值比原始菌株
·78· 　　　　　　　　　　　　　　　　　　酿　　酒　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　第 29卷
QY降低了 40%, 6d 后的嫩啤酒中双乙酰含量比 QY 降低了
30%。
图 3　啤酒发酵过程中双乙酰含量变化曲线
啤酒酵母应用于酿造工业已有很悠久的历史 , 但迄今没
有进行系统的育种 ,只是沿袭以往的习惯根据酵母的发酵情
况和啤酒的风味筛选较理想的酿造菌株 , 亦即依靠“自然育
种” 。这个过程不仅需要漫长的时间 , 而且很难获得遗传性
变化较大的菌株。现代啤酒酿造技术主要着眼于提高质量 、
降低成本 ,因此应用现代生物工程技术改造传统的啤酒产业
是啤酒工业发展的大趋势。 近年来对啤酒酵母实施基因改
良方面取得了一定的成果 , 国内有学者将α-乙酰乳酸脱羧
酶基因引入酵母中的报道[ 11] , 但用引入来源于细菌的α-乙
酰乳酸脱羧酶基因的酵母工程菌生产出的啤酒是否安全 , 是
否能被消费者接受还需长时间的实践证明。 本文尝试利用
酵母本身的 DNA 来转化和修饰酵母基因 , 提高产品的安全
性 ,从本文的研究结果来看用基因工程手段可以成功地降低
啤酒酵母中 AHAS 酶的活力从而较好地降低啤酒发酵过程
双乙酰的产生 ,这为利用基因工程技术进行酿酒生产相关菌
株的改良提供了模型 ,同时也为啤酒酵母工程菌在工业化生
产中的应用打下了良好的基础。 作者对文中所构建的酵母
工程菌的其它一系列的发酵试验正在研究之中 , 相信随着生
物高新技术的研究及应用越来越深入 , 啤酒酿造这一有悠久
历史的产业发展前景将更加广阔。
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Construction of diacetyl-low brewer s yeast
LI Tan1 , TIE Cui-juan2 ,WANGZheng-xiang1 , ZHANGBo-run2 , ZHUGE Jian1
(1.The Educational M inistry Key Lab of Industry Biotechnology , Southern Yangtze University ,Wuxi 214036 ,China;
2.Institute of Microbiology , The Chinese Academy of Sciences, Beijing 10080 ,China)
ABSTRACT:Acetohydroxyacid synthase which is encoded by the gene ILV2 , is responsible for the produnction of precursors of diacetyl.ILV2
was cloned by Polymerase China Reaction from brewer s yeast.The recombinant plasmid YIpCE harboring the EcoRI fragments of ILV2 gene
and CUPI-MT1 gene was constructed.The YIpCEwas introduced into the brewer s yeast QY.Brewer s yeast transformants were selected using
copper resistance as slelcted marker.Transformants showed 75% decrease in the AHAS activity and in beer fermentation decrease of about 30%
of diacetyl compared to the control yeast QY.These results demonstrated that YIpCE integrated at the ILV2 locus.
KEY WORDS:brewer s yeast;Acetohydroxyacid synthase;ILV2;gene disruption.
·79·第 6期　　　　　　　　　　李　艳 ,等:低双乙酰啤酒酵母工程菌的构建