全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (12): 1442~14461442
收稿 2013-10-28 修定 2013-11-25
资助 大麦青稞产业技术体系(CARS-05)、上海市种业发展项
目[沪农科种字(2012)第7号]、上海市科委基础重点项目
(12JC1407800)。
* 并列第一作者。
** 共同通讯作者(E-mail: sw1@saas.sh.cn, chliu001@163.com;
Tel: 021-62201032)。
化学诱变剂和60Co处理对大麦小孢子低氮胁迫培养的影响
陆瑞菊1,2,*, 陈志伟1,2,*, 何婷1,2, 徐红卫1,2, 杜志钊1,2, 高润红1,2, 王亦菲1,2, 邹磊1,2, 郭桂梅1,2, 卜姝
明3, 黄亦辰3, 刘成洪1,2,**, 黄剑华1,2,**
1上海市农业科学院生物技术研究所, 上海201106; 2上海市农业遗传育种重点实验室, 上海201106; 3上海海洋大学水产与生
命学院, 上海201306
摘要: 以大麦品种‘花30’为材料, 用不同剂量化学诱变剂(EMS和PYM)处理大麦游离小孢子, 不同剂量60Co辐照处理大麦离
体穗和干种子, 比较其对在低氮胁迫下小孢子培养诱导愈伤组织产量和绿苗分化数量的影响。结果表明, EMS处理离体小
孢子和60Co辐照干种子明显比PYM处理小孢子和60Co辐照离体穗的培养效果好。
关键词: 大麦; 小孢子培养; 诱变
Effects of Chemical Mutagen and 60Co Treatments on Microspore Culture of
Barley under Low-Nitrogen Stress
LU Rui-Ju1,2,*, CHEN Zhi-Wei1,2,*, HE Ting1,2, XU Hong-Wei1,2, DU Zhi-Zhao1,2, GAO Run-Hong1,2, WANG Yi-Fei1,2, ZOU Lei1,2,
GUO Gui-Mei1,2, BU Shu-Ming3, HUANG Yi-Chen3, LIU Cheng-Hong1,2,**, HUANG Jian-Hua1,2,**
1Biotech Research Institute, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201106, China; 2Shanghai Key Laboratory of
Agricultural Genetics and Breeding, Shanghai 201106, China; 3College of Fishery and Life Science, Shanghai Ocean University,
Shanghai 201306, China
Abstract: To investigate the effects of chemical mutagens and 60Co on callus yield and green plantlet
production through microspore culture under low-nitrogen stress, we used the barley (Hordeum vulgare) variety
‘Hua 30’ as the tested material, used two chemical mutagens, ethylmethylsulfone (EMS) and pingyangmycin
(PYM), with different concentrations to treat the microspores, and used 60Co with different doses to treat young
spikes and seeds respectively. The results showed that EMS treatment of microspores or 60Co treatment of seeds
were much better than PYM treatment of microspores or 60Co treatment of young spikes for callus induction
and green plantlet differentiation.
Key words: Hordeum vulgare; microspore culture; mutation
氮素是植物生长所必需的大量元素之一, 也
是植物需要最多的一种矿质元素。提高作物的氮
素利用率可以减少施肥量, 既提高了作物产量, 又
节约成本, 还能减少环境污染。对啤酒大麦而言,
减少施肥量是提高制啤质量的重要措施之一。因
而作物耐低氮种质创新的相关研究受到了广泛的
关注。
组织培养过程中会产生广泛的变异, 利用这
一技术诱导并筛选变异体的优越性早已被论证并
实现(Winicov和Dhundy 1997; Jain 2001; He等
2009; Patade和Suprasanna 2008; Fatnassi等2011;
Yamaguchi等2009), 通过细胞变异体获取耐逆材料
的研究也有报道(Das等2000; Chen等2011; Predieri
2001; Patade和Suprasanna 2009; Luan等2007; 高玉
红和李云2004; 杨乾等2011)。随着花药培养技术
的发展, 利用理化诱变与花药培养技术相结合定
向筛选变异体的报道很多(Kasha等2001; Chen等
2001; 孙月芳等2005, 2006; 宣朴等2000), 这一技术
具有明显的优点, 即可以迅速固定并纯合发生变
异的性状(Germana 2011; 刘录祥等2009)。利用小
孢子培养技术来诱导并筛选变异体的报道不多,
陆瑞菊等: 化学诱变剂和60Co处理对大麦小孢子低氮胁迫培养的影响 1443
仅有的一些报道集中在油菜上(Barro等2001, 2002;
石淑稳等2007; 和江明等2003), 大麦上仅有1例(陆
瑞菊等2012)。小孢子是真正意义上的细胞培养系
统, 且是单倍体单细胞培养系统; 利用小孢子培养
系统, 给予适当的(逆、病、营养、生长)胁迫压,
可筛选出含相应抗性基因的存活小孢子, 抗性小
孢子分化成苗后, 经过染色体加倍使所携带的基
因一次性加倍, 得到的是完全纯合的植株(黄剑华
2007), 而且小孢子比种子敏感, 有利于增加变异机
率(顾宏辉等2003; 黄剑华2003, 2007)。将诱变技
术与小孢子离体培养技术结合起来不仅可以避免
嵌合体的发生, 而且可以使隐性性状得以较早表
现, 加速纯合过程, 从而大大提高变异和筛选效率
(Das等2000)。陆瑞菊等(2011)利用较为成熟的大
麦小孢子培养技术, 证实了供试品种的耐低氮性
在小孢子水平与植株水平上具有一致性, 揭示可
以在小孢子水平进行耐低氮突变体的筛选。目前
尚未见到大麦小孢子游离后离体诱变、低氮胁迫
培养及筛选的报道。本研究以大麦品种‘花30’为
供试材料, 分别利用辐照处理干种子和离体穗以
及用化学诱变剂浸泡处理游离后的小孢子来研究
不同诱变受体和不同诱变剂对小孢子培养诱导愈
伤组织和绿苗分化的影响, 同时探索利用小孢子
低氮胁迫培养来筛选耐低氮植株的可行性。
材料与方法
1 材料
由本实验室保存的大麦材料‘花30’ (Hordeum
vulgare L. cv. ‘花30’)种植于上海市农科院青浦试
验场内。‘花30’干种子诱变于2010年11月进行,
2011年4月取麦穗进行小孢子培养; 离体穗和小孢
子诱变于2011年4~5月进行, 诱变结束后进行小孢
子培养。
2 小孢子培养方法
从大田选取中部小花小孢子发育处于单核早
期和中期的穗子, 放入5 ℃冰箱冷藏15 d。接种时,
穗子用饱和的漂白粉溶液消毒15 min, 无菌水冲洗
3~4次。每个试管接10个穗子, 倒入15 mL提取液,
用高速分散器超速旋切, 用150目筛网过滤, 滤液
以100×g低速离心5 min, 重复3次, 收集小孢子。小
孢子用预处理液于25 ℃下黑暗预处理2 d。培养前
将小孢子先用21%麦芽糖纯化, 再用培养基洗涤1
次, 然后用培养基将小孢子密度调节至1.0×105
个·mL-1, 取1 mL小孢子悬浮液接种于培养皿(35
mm×15 mm), 用封口膜封口, 25 ℃下暗培养。每个
实验设4个重复。
3 提取液、预处理液及培养基
以添加CaCl2 1.1 g·L
-1和MES 0.976 g·L-1的6%
甘露醇溶液为提取液和预处理液。诱导培养基以
改良的N6为基本培养基, 附加KT 0.5 mg·L-1、
2,4-D 1.0 mg·L-1、麦芽糖90 g·L-1, 并添加不同浓度
的谷氨酰胺(Gln)和水解干酪素(CH), 以Gln和CH各
2 000 mg·L-1为正常含量。分化培养基以MS为基本
培养基, 其中加有6-BA 0.5 mg·L-1、KT 1.5 mg·L-1、
NAA 0.05 mg·L-1和麦芽糖30 g·L-1, 用6 g·L-1琼脂粉
固化。低氮胁迫的诱导和分化培养基中无机氮为
正常量的1/10, Gln和CH含量均为400 mg·L-1。提
取液、预处理液及诱导培养基均采用过滤灭菌,
分化培养基在0.11 Mpa、121 ℃下高温高压灭菌
15 min。
4 诱变处理
小孢子处理: 以甲基磺酸乙酯(ethylmethylsulfone,
EMS)和平阳霉素(pingyangmycin, PYM)作为化学
诱变剂, 剂量均为3和5 mg·L-1。小孢子提取后用含
有诱变剂的提取液于25 ℃、黑暗下浸泡48 h。
穗子处理 : 5 ℃低温预处理15 d后用钴60
(60Co)进行辐照, 剂量率1 Gy·min-1, 剂量分别为10
和15 Gy。
种子处理: 播种前干种子用60Co进行辐照, 剂
量率1 Gy·min-1, 剂量分别为400和500 Gy。
5 数据处理
愈伤组织产量: 25 ℃暗培养21 d时称取每个
培养皿中愈伤组织的重量, 即1.0×105个小孢子形
成的愈伤组织产量。绿苗数量: 单个培养皿愈伤
组织分化出绿苗的株数, 即培养1.0×105个小孢子
最后获得的绿苗数量。采用Microsoft Office Excel
2003软件对数据进行统计分析。
实验结果
1 EMS和PYM对愈伤组织产量和绿苗分化的影响
表1显示, 分别以3和5 mg·L-1的EMS为诱变剂
处理‘花30’离体小孢子后进行小孢子低氮培养, 所
植物生理学报1444
获得的愈伤组织产量以3 mg·L-1 EMS处理的略高,
而绿苗分化数量则是5 mg·L-1 EMS处理的较高, 但
差异不显著。另外, 用3 mg·L-1的PYM处理‘花30’
离体小孢子所获得的愈伤组织产量和绿苗数都高
于5 mg·L-1 PYM处理的, 差异也不显著。说明这两
种浓度的EMS或PYM处理对愈伤组织产量和绿苗
数量均没有明显差异。但比较两种化学诱变剂处
理的结果可见, 愈伤组织产量相差不大, 而PYM处
理所获得的绿苗数量要远远低于EMS处理的, 表
明PYM对于绿苗分化的伤害要大于EMS。
3 60Co辐照种子对愈伤组织产量和绿苗分化的
影响
‘花30’干种子经400和500 Gy剂量的60Co辐照
后进行小孢子低氮培养, 所得到的愈伤组织产量
相差不大, 而绿苗数量则是后者显著低于前者(表
3), 说明辐照剂量的高低对绿苗分化的影响较大。
另外, 与幼穗的辐照剂量(10和15 Gy)相比, 种子辐
照所采用的剂量高很多, 但培养后得到的愈伤组
织产量和绿苗数均高于前者, 可见辐照对幼穗的
伤害要远远大于对种子的。
表1 EMS和PYM诱变后小孢子培养的
愈伤组织产量和绿苗分化数量
Table 1 The yield of calli and production of green plantlets
through microspore culture after EMS and PYM treatments
诱变剂
愈伤组织产量/mg 绿苗数量/株
种类 浓度/mg·L-1
EMS 3 78.0±5.3 108.3±4.2
5 72.5±2.7 132.3±11.3
PYM 3 75.6±3.3 13.0±2.0
5 57.0±7.7 9.5±2.4
2 60Co辐照离体穗对愈伤组织产量和绿苗分化的
影响
以两种剂量的60Co辐照大麦离体穗后进行小
孢子低氮胁迫培养, 结果显示, 15 Gy剂量辐照所
得到的愈伤组织产量明显高于10 Gy辐照的, 而绿
苗分化数则低于10 Gy辐照的(表2)。可见, 高剂量
辐照有利于愈伤组织产生, 而低剂量辐照则有利
于绿苗分化, 表明虽然高剂量辐照得到了较高的
愈伤组织产量, 但可能其质量并不好, 因而得到绿
苗数量较少。
表2 离体穗经60Co辐照后小孢子培养的愈伤组织
产量和绿苗分化数量
Table 2 The yield of calli and production of green plantlets
through microspore culture after 60Co
treatment of young spikes
辐照剂量/Gy 愈伤组织产量/mg 绿苗数量/株
10 24.9±2.4 5.3±1.7
15 37.8±1.5* 0.3±0.3*
*在5%水平上差异显著。
表3 干种子经60Co辐照后小孢子培养的愈伤组织
产量和绿苗分化数量
Table 3 The yield of callus and production of green plantlets
through microspore culture after 60Co treatment of seeds
辐照剂量/Gy 愈伤组织产量/mg 绿苗数量/株
400 71.9±2.9 82.8±3.7
500 68.7±2.7 39.0±0.4*
*在5%水平上差异显著。
4 诱变处理对低氮胁迫下大麦小孢子培养的影响
从图1可以看出, ‘花30’的离体小孢子经EMS
或PYM浸泡48 h后, 在低氮胁迫下, 1.0×105个小孢
子分别产生75.2和66.3 mg愈伤组织, 并在胁迫分
化培养基上分化出120.3和11.3株绿苗。由此可见,
经EMS诱变后的小孢子培养效果优于PYM诱
变的。
‘花30’离体穗或干种子经60Co辐照后小孢子
在低氮胁迫下的愈伤组织产量分别为31.3和70.3
mg, 在胁迫分化培养基上绿苗数量为2.8和60.9株,
表明干种子经辐照诱变后小孢子在低氮胁迫下的
培养效果优于离体穗诱变的(图1)。
讨 论
在长期的诱变育种实践中, 辐照的试验材料
大多是多细胞的种子、器官、组织和植株等, 产
生的突变体常出现嵌合现象, 诱发的隐性基因突
变在当代不能表达, 虽也有直接对花粉进行辐照
的, 但授粉后产生的后代仍是杂合体, 必须经过分
离纯合, 才能进行选择, 从而降低了选择效率。采
用游离小孢子培养结合辐射诱变的方法不仅可以
克服以上不足之处, 而且避免了花药培养过程中
陆瑞菊等: 化学诱变剂和60Co处理对大麦小孢子低氮胁迫培养的影响 1445
二倍体花药壁细胞的干扰, 使发生突变的单倍体
在自然加倍后, 即成为稳定的突变材料(Germana
2011)。此外, 这一方法还能够提高变异效率, 使变
异既有来源于诱变和小孢子培养过程, 也有二者
的叠加效应, 可能导致优良基因的重组和累加, 从
而创造出性状优良的突变体。
本研究表明, 诱变处理影响供试材料小孢子
低氮胁迫下的愈伤组织生成, 60Co γ-射线辐照离体
穗明显比辐照种子的愈伤组织产量低。谢嘉华等
(1995)也观察到大麦穗子经500 rad γ-射线辐照, 不
仅延缓了小孢子出愈时间, 而且严重降低了小孢
子分裂启动的比率。推测这可能与穗辐照后小孢
子活力受到影响有关。PYM与EMS处理小孢子后
愈伤组织产量差异不明显, 但绿苗数量相差很大,
可能的原因一是小孢子活力存在差异, 二是诱变
剂对小孢子有损伤。另外, 选择合适的诱变剂和
诱变方法(EMS诱变小孢子和60Co γ-射线辐照干种
子)处理后, 确定适宜的胁迫筛选压对所获得的再
生植株数量至关重要, 本试验采用的低氮胁迫诱
导培养基的胁迫压效果总体较好, 但分化培养基
中正常量1/10的氮含量可能还是太高, 导致获得的
绿苗数量较多, 从而增加了植株鉴定的工作量。
从本研究的结果还可以看出, 低氮胁迫下的小孢
子培养效果与诱变剂的剂量没有呈现出有规律的
负相关性, 这或许是因为诱变剂处理后发生的变
异是随机的、不定向的, 导致不同批次间在低氮
胁迫下的培养效果有所不同, 也可能是经较大诱
变剂量处理后存活小孢子的分化潜力提高, 或是
其形成的愈伤组织耐低氮胁迫能力有所增加。利
用花药培养获得的植株中存在源于药壁细胞的二
倍体再生植株(宣朴等2000), 而小孢子培养的再生
植株全部为单倍体或加倍单倍体, 单倍体细胞水
平诱变产生的耐低氮性发生变异的存活细胞, 经
过染色体加倍后, 突变基因和其他基因一次性纯
合, 其所携性状的遗传稳定性较好。本研究为进
一步优化大麦诱变结合小孢子低氮胁迫培养技术
提供了有价值的实验数据, 并且, 这些研究结果可
以为其他谷类作物小孢子水平诱变和胁迫筛选方
法的建立提供参考。获得的再生植株正在用于耐
低氮性评价。
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