全 文 ：高温对萝芙木细胞膜、膜脂和抗坏血酸代谢造成的损伤 ?
田学军1 , 龙云惠2 , 张德刚1 , 何 英2
(1 红河学院生物系 , 云南 蒙自 661100; 2 红河学院化学系 , 云南 蒙自 661100)
摘要 : 通过高温胁迫下萝芙木叶片电导率、膜脂过氧化物丙二醛 (MDA)、自由基清除剂抗坏血酸的变化研
究 , 探讨高温对萝芙木组织造成的损伤及自由基清除剂代谢的影响 , 从而揭示高温胁迫下萝芙木生长发育迟
缓的原因。结果表明 , 热胁迫对萝芙木细胞膜造成损伤 , 使膜脂更多地被过氧化 , 抗坏血酸含量下降 , 致使
萝芙木受到热损伤和氧化损伤 , 最终可能使其生长发育放缓 , 开花结果推迟。研究还表明 , 萝芙木经适当
高温 (37℃ ) 热驯 , 能产生较多的抗坏血酸 , 以清除热胁迫诱导产生的氧自由基 , 降低氧化损伤程度。
关键词 : 萝芙木 ; 热胁迫 ; 电导率 ; 丙二醛 ; 抗坏血酸
中图分类号 : Q 945 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700 (2008) 01 - 095 - 04
Effect of High Temperature on the Cell Membrane , Membrane
Lipid , and Ascorbic Acid Metabolism in Rauwolfia
( Rauvolfia vericillata, Apocynaceae)
TIAN Xue-Jun1 , LONG Yun-Hui2 , ZHANG De-Gang1 , HE Ying2
( 1 Department of Biology, HongheUniversity, Mengzi 661100 , China;
2 Department of Chemistry, Honghe University, Mengzi 661100 , China)
Abstract : To explorethemechanismof growth retardation under high temperature in Rauwolfia ( Rauvolfia vericillata) , the
effects of hightemperatureonmembrane integrity, lipid peroxidation, andantioxidant ascorbic acidwereexamined by mea-
suring the electric conductivity, membrane lipid peroxidemalondialdehyde (MDA) , and changes of ascorbic acid in Rau-
wolfia leaves . The results showedthat exposureto high temperature (44℃ and50℃) resulted in increases in electric con-
ductivity and MDA , and decrease in levels of abscorbic acid . Heat acclimation, pretreatment at 37℃ , however, maintains
ascorbic acid at higher levels than that without heat acclimation, which may be helpful for Rauwolfia to resist heat stress .
Key words: Rauvolfia vericillata; Heat stress; Electric conductance; Malondialdehyde (MDA) ; Ascorbic acid
过高的环境温度将对植物造成热胁迫 ( heat
stress, HS) 和热损伤 , 并进一步诱发氧化胁迫 ,
对生物造成氧化损伤。不过 , 当各种生物暴露在
高于其适宜生长温度下 , 它们具有存活的本能
(基本耐热性 ) 及获得抵御致死热胁迫的耐热性
(获得性耐热性 ) 。在热胁迫前经中等高温 ( 能存
活) 短期热驯 ( heat acclimation) 或经其他非致
死胁迫 , 生物可获得获得性耐热性 ( Vierling,
1991; Hong and Vierling, 2000; Larkindale 等 ,
2005) 。许多研究证实 , 热激蛋白 (HSPs)、脱落
酸、水杨酸、乙烯、活性氧中间体 ( reactive oxy-
gen species, ROS) 信号、膜脂成份、抗氧化剂
(抗坏血酸、谷胱甘肽、过氧化氢酶 ) 等途径包
括在植物的耐热性中。其中 , HSPs的产生是获
得性耐热性的显著特征 (Vierling, 1991) 。
隶属于夹竹桃科萝芙木属 ( Rauvolfia L .)
的萝芙木 [ R. vericillata (Lour .) Bail .] 是国产成
药“降压灵”的原料 ( 陈维新等 , 1979) , 在山地
云 南 植 物 研 究 2008 , 30 (1) : 95～98
Acta Botanica Yunnanica

? ?收稿日期 : 2007 - 04 - 07 , 2007 - 07 - 12 接受发表
作者简介 : 田学军 (1962 - ) 男 , 副教授 , 主要从事植物生理学方面的研究。Tel : (0873) 3699787; E-mail : txj— biology2@126 . com
灌丛、山坡阴湿林下、溪边潮湿肥沃的地方广泛
分布 , 属于半阴性植物 , (管志斌 , 2004 )。为科
研所需 , 本课题引种萝芙木 , 其中 , 一部分植于
大棚内 , 另一部分露天种植。露天定植的植株长
势良好 , 1 年多即开花结果 , 而大棚内的植株长
势较露天的差 , 并且没有开花结果。为探讨其原
因 , 本研究以室内培养的萝芙木扦插苗叶片为材
料 , 测定了经高温胁迫的叶片的电导率、膜脂过
氧化产物丙二醛 (MDA) 和自由基清除剂抗坏血
酸含量。就萝芙木而言 , 这方面的研究尚未见报
道。测定植物组织电解质的电导率已被用于植物
获得性耐热性的定量分析 (Lohmana 等 , 2004 ) ,
MDA 积 累 用作 热 胁 迫 引起 的 脂 过氧 化 标 识
(Smirnoff , 1995) , 抗坏血酸则是植物非酶自由基
清除系统中的重要抗氧化剂 , 在清除氧自由基中
起重要作用 (Xu等 , 2006 )。
1 材料和方法
1 .1 萝芙木种植
原植物 (均为扦插成活的无性繁殖苗 ) 于 2005 年 3
月从绿春县引种 , 分别在红河学院塑料大棚内及露天栽
培 , 所用栽培基质为红壤土和腐熟农家肥。塑料大棚无
空调设备 , 夏季棚内温度有时高达 40℃以上 ; 露天栽培
的春夏季套种高梁。
1 .2 供试萝芙木叶片材料
在培养室 ( 22℃ , 16 h光照?8 h黑暗) 内培育的萝芙
木扦插苗幼嫩叶片 , 同一试验所用叶片叶龄相同。每个
处理 (热胁迫 ) 温度 5 个重复。
1 .3 试剂
三氯乙酸 , 硫脲 , 二硝基苯肼 , 硫酸 , 抗坏血酸 ,
硫代巴比妥酸 , 氢氧化钠。均为分析纯。
1 .4 设备
电导率仪 ( JEY-45001 , Jenway, England) , 高速冷冻离
心机 (Eppendrof Centrifuge 5810 R, Germany) , 双光束紫外可
见分光光度计 (TU-1901 , 北京普析通用仪器有限公司 )。
1 .5 萝芙木叶片热胁迫处理
1 .5 .1 电导率测定 叶片从植株上剪下 , 用去离子水冲
洗干净 , 置于垫有经去离子水饱和的滤纸的平皿内 , 密
封 , 分别放入 44℃、50℃水浴中加热 (热胁迫 ) 2 h。设
对照 (置于 22℃培养室内)。
1 .5 .2 MDA 测定 叶片从植株上剪下 , 立即称重每个
叶片 , 置于垫有经去离子水饱和的滤纸的平皿内 , 密
封 , 分别置于 44℃、50℃水浴中加热 2 h, 其后用于提取
MDA。设对照 (置于 22℃培养室内 )。
1 .5 .3 抗坏血酸测定 叶片剪下 , 每个叶片分别称重 ,
置于垫有经去离子水饱和滤纸的平皿内内 , 分别设定为
对照、热驯、直接高温胁迫 3 组。其中 , 对照组置 22℃
培养室 ; 热驯组置于 37℃水浴热驯 1 h, 转入 22℃培养
室恢复 1 h, 再置于 50℃水浴热胁迫 2 h; 直接高温胁迫
组直接放入 50℃水浴热胁迫 2 h。
1 .6 电导率测定
仿 Lohmann等 (2004) 方法并适当改进。经去离子
水洗净的 1 个叶片放入盛有 5 ml 去离子水的具塞试管
内 , 置于 25℃ , 120 r?min摇床振荡 1 h, 然后测定初电导
率 (EC i ) ; 测毕 , 试管转入 100℃沸水浴中加热 10 min,
彻底破坏细胞结构 , 测定终电导率 (EC t) ; 以 ECi?EC t
表示相对电导率 ( R) , 然后根据下列公式 ( Thomas等 ,
1992) , 计算损伤指数 (Ⅰd) :
Ⅰd= 100 ( R t - Ro) ? ( l - Ro)
R t和 Ro分别为热胁迫叶片和对照 (非胁迫 ) 叶片之相
对电导率。
1 .7 丙二醛测定
仿 Dhindsa等 (1981) 硫代巴比妥酸法 , 并适当改进。
1 .7 .1 MDA 提取 1 个叶片 (约 0 .2500 g, 精确称重 )
在盛有 2 ml 0 .6% (V?V ) 硫代巴比妥酸 (TBA ) 三氯乙
酸 (TCA , 20% V?V) 提取剂的研钵中研磨 2 min, 转入离
心管 ; 研钵再用 3 ml 提取剂冲洗 3 次 , 转入离心管内混
合 ; 在 4℃ , 6 000 r?min离心 15 min; 移取上清液 , 添加
提取溶剂定容至 5 ml ; 取 1 ml 上清液与 1 ml 0 .6% TBA 混
合 , 在 100℃沸水浴加热 10 min, 随后在冰浴中冷却 , 然
后在 532、450、600 nm测定吸光值 (Abs)。
1 .7 .2 MDA 含量计算
MDA 摩尔浓度(μmol?L) = 6.45×(A532 - A600) - 0.56×A450
MDA 质量摩尔浓度 (μmol?g) = MDA 摩尔浓度×N×W- 1
N———提取液体积 (L) W———鲜重 (g)
1 . 8 抗坏血酸测定
仿 Xu等 (2006 ) 方法并作适当改进。
1 .8 .1 抗坏血酸标准曲线和回归方程制作 精确称取抗
坏血酸 10 mg→加 2 ml 10 %盐酸→加去离子水定容至 100
ml (母液 , 浓度为 100μg?ml) →分别取 0 , 1 , 2 , 4 , 5 , 8 ,
10 , 12 ml 母液 , 分别定容为 100 ml (浓度分别为 0 , 1 , 2 ,
4 , 5 , 8 , 10 , 12μg?ml ) →分别取以上标准液 2 ml→加 1 滴
10%硫脲 , 1 ml 2%二硝基苯肼→混合→100℃水浴中煮
沸 20 min→冷至室温→冰浴中加入 5 ml 80 % (V?V) 硫酸
(1 min 内加完 , 边加边摇动 ) →混合→室温下反应 30
min→20℃、4 000 r?min离心 10 min→取上清液于 530 nm
测定吸光值 (Abs) →以抗坏血酸含量为横座标 , Abs为
纵座标绘制标准曲线 , 并求出回归方程。
1 .8 .2 抗坏血酸提取 精称 1 个叶片 (约 0 .1500 g) →
加 2 ml 6 %三氯乙酸 ( TCA) →研钵中研磨 2 min→转入
69 云 南 植 物 研 究 30 卷
15 ml 离心管→研钵用 3 ml TCA 冲洗 3 次 , 转入离心管混
合→4℃ , 4 000 r?min离心 10 min。
1 .8 .3 显色反应 取 2 ml 样液→加 1 滴 10 %硫脲 , 1 ml
2 %二硝基苯肼→混合→100℃水浴中煮沸 20 min→冷至
室温→冰浴中加入 5 ml 80% (V?V) 硫酸 (1 min内加完 ,
边加边摇动 ) →混合→室温下反应 30 min→20℃ , 4 000 r?
min离心 10 min→取上清液于 530 nm测定吸光值 (Abs)
1 . 9 统计分析 采用 SPSS10 .0 统计软件进行分析。
2 结果
(1 ) 露天栽培并套种高粱 ( 起适当遮阴作
用 ) 的萝芙木于 2006 年 9～10 月 (从定植到开
花约 18 个月 ) 即开花结果 , 而种植在无空调大
棚内的萝芙木没有开花 ( 图 1 )。结果表明 , 种
植在大棚内的萝芙木 , 可能由于高温胁迫 , 使得
生长发育缓慢 , 开花结果推迟。
(2) 高温热胁迫后 , 萝芙木叶片电导率升
高 , 且热胁迫温度越高 , 电导率越高 ( 表 1 )。
(3) 受高温热胁迫后 , 叶片细胞膜脂过氧化
加剧 , 丙二醛含量升高 ( 表 2) 。统计分析表明 ,
44℃、50℃热胁迫 2 h产生的 MDA 含量与对照组
含量差异显著 ( P < 0 .050) , 两个高温组差异不
显著 ( P > 0 .050)。
(4) 抗坏血酸回归方程 : Abs530 = 0 .041 +
0 .051 * C, 式中 C 为抗坏血酸含量 (μg?g)。
叶片直接 50℃高温胁迫 2 h后 , 抗坏血酸含
量比对照组下降 ; 经 37℃热驯 1 h, 又在 22℃恢
复 1 h, 再在 50℃高温胁迫 2 h (37℃?50℃ ) , 其
抗坏血酸含量比对照组和 50℃直接高温胁迫组
高 ( 表 3 )。另一个试验 (表 4) 亦与本试验结果
基本吻合 , 即经热驯、恢复 , 再高温胁迫 , 较对
照抗坏血酸含量高 ( 注 : 两个试验所用叶片叶龄
不相同 )。
表 1 萝芙木热胁迫 2 h 后的电导率 ( mean±SD, 5 个重复 )
Table 1 The electric conductance in rauwolfia leaves
underheat stress for 2 h ( mean±SD, 5 replicates)
处理 相对电导率 ( R) 损伤指数 ( Id)
对照 0 ?. 06±0 .02
44 ?℃ HS 0 .13±0 .03 7 .85±2 . 78
50 ?℃ HS 0 .14±0 .03 8 .71±3 . 67
图 1 大棚内与露天种植萝芙木生长发育比较 A . 露天栽培 ; B . 大棚内栽培
Fig . 1 The comparision between rauwolfias planted in the open air and greenhouse
A . planted in theopen air; B . planted in greenhouse
表 2 萝芙木叶片热胁迫 2 h MDA 含量
测定结果 ( mean±SD, 5 个重复 )
Table 2 The content of MDA in rauwolfia
leaves underheat stress for 2 h
( mean±SD, 5 replicates)
处理 MDA 含量 (μmol?g)
对照 0 ?. 007±0 .001
44 ?℃ HS 0 .010±0 .001
50 ?℃ HS 0 .011±0 .003
表 3 萝芙木叶片热胁迫后抗坏血酸
含量 ( mean±SD, 5 个重复 )
Table 3 The content of ascorbic ackd in
rauwolfia leaves under heat stress
( mean±SD, 5 replicates)
处理 抗坏血酸含量 (μg?g)
对照 997 .6±58 i. 6
37℃?50℃ 1034 .9±29 |. 7
50℃ 982±77 D. 5
表 4 萝芙木叶片热胁迫后抗坏血酸
含量 ( mean±SD, 5 个重复 )
Table 4 The content of ascorbic ackd in
rauwolfia leaves under heat stress
( mean±SD, 5 replicates)
处理 抗坏血酸含量 (μg?g)
对照 1436 ?. 7±153 ?. 1
37 ?℃?44℃ 1515 .1±277 .1
791 期 田学军等 : 高温对萝芙木细胞膜、膜脂和抗坏血酸代谢造成的损伤
3 讨论
热胁迫期间产生的超氧自由基 (O2 - )、过
氧化氢 ( H2 O2 ) 等活性氧中间体 ( ROS) 损伤
脂、蛋 白质、碳 水化合物、核酸等 细胞成 分
(Monk等 , 1989) , 氧化胁迫导致植物光合作用和
蒸腾作用受阻 , 进而抑制植物生长 ( J iang and
Huang, 2001 )。本研究表明 , 萝芙木经 44℃以上
高温胁迫后 , 细胞膜严重受损 ( 电导率升高 ) ,
膜脂过氧化加剧 (MDA 含量升高 ) , 自由基清除
剂抗坏血酸含量下降 , 其结果将使萝芙木组织受
损 , 导致生长发育减慢 , 开花结果推迟。本研究
还证实 , 萝芙木通过适当 亚高温 ( 本 研究为
37℃ ) 热驯 , 其抗坏血酸含量有一定提高 , 增强
了抵抗高温诱发的氧化胁迫的能力。本研究与其
他学者用其他植物材料研究的结果基本一致。
萝芙木原生境为灌丛、林下、溪边 , 属半阴
性植物。管志斌 ( 2004 ) 指出 , 温度在 21～30℃
时萝芙木生长良好 , 可与橡胶、果树等经济作物
间作。本研究栽培表明 , 露天种植 , 并套种高粱
的萝芙木 , 由于高粱起遮阴作用 , 长势较好 , 提
早开花结果。因此 , 发展萝芙木生产进行扦插育
苗和生产时 , 作适当遮阴是必要的 , 这样可避免
高温对萝芙木造成热损伤。
致谢 中国科学院昆明植物研究所李唯奇博士对本研究
给予指导 , 并帮助修改英文摘要。
〔参 考 文 献〕
Chen ?WX ( 陈维新 ) , Bai YC (白永成 ) , 1979 . The Alkaloids of Rau-
volfia yunnanensis Tsiang [ J ] . Acta Bot Yunnan ( 云南 植 物研
究 ) , 1 (2) : 37—40
Dhin ?dsa RS, Plumb-Dhindsa P, Thorpe TA , 1981 . Leaf senescence:
Correlated with increased leaves of membrane permeability and lipid
peroxidation and decreased levels of superoxide dismutase and cata-
lase [ J ] . J Exp Bot, 32 : 93—101
Guan ?ZB (管志斌 ) , 2004 . Cultivaion and exploitation of south Chinese
medicine Rauvolfia [ J ] . Chin Wild Plant Resour (中国野生植物
资源 ) , 23 ( 5) : 54—56
Hong ?SW, Vierling E, 2000 .Mutantsof Arabidopsis thaliana defective in
the acquisition of tolerance to high temperature stress [ J ] . Proc
Natl Acad Sci USA , 97 : 4392—4397
J ian ?g Y , Huang B, 2001 . Drought and heat stress injury to two cool-sea-
son Turfgrasses in relationto antioxidantmetabolism and lipid peroxida-
tion [ J ] . Crop Sci , 41 : 436—442
Lark ?indale J , Hall JD, Knight MR et al., 2005 . Heat stress phenotypes
of Arabidopsis mutants implicate multiple signaling pathways in the
acquisition of Thermotolerance [ J ] . Plant Physiol , 138: 882—897
Lohm ?ann C, Eggers-Schumacher G, Wunderlich M, 2004 . Two different
heat shock transcription factors regulate immediate early expression of
stress genes in Arabidopsis [ J ] . Mol Gen Genomics, 271: 11—21
Monk LS, Fagerstedt KV , Crawford RMM , 1989 . Oxygen toxicity and su-
peroxide dismutase as an antioxidant in physiological stress [ J ] .
Physiol Plant, 76 : 456—459
Smir ?noff N , 1995 . Antioxidant Systems and Plant Response to the Envir-
onment [ A ] . In: Smirnoff N ed . Environment and Plant Metabolism:
Flexibility and Acclimation [M ] . Oxford: Bios Scientific Publishers,
217—243
Thom ?as HW, Nina LB , Thomas GR et al. , 1992 . An improved method
for using electrolyte leakage to assess membrane competence in plant
tissues [ J ] . Plant Physiol , 98 : 198—205
Vier ?ling E , 1991 . The roles of heat shock proteins in plants [ J ] . Annu
Rev Plant Physiol Plant Mol , 42 : 579—620
Xu S ?, Li J , Zhang X et al. , 2006 . Effects of heat acclimation pretreat-
ment on changes of membrane lipid peroxidation, antioxidant metab-
olites, and ultrastructureof chloroplasts in two cool-season turfgrass
species under heat stress [ J ] . Environ Exp Bot, 56 : 274—285
89 云 南 植 物 研 究 30 卷