全 文 ：植物生理学通讯 第41卷 第4期，2005年8月 433
柽柳翻译起始因子(eIF-5A)基因的克隆及原核表达
杨传平 姜静 田梗 王玉成* 刘桂丰
东北林业大学林学院，哈尔滨 150040
提要 根据柽柳 cDNA 文库中获得的 eIF-5A 基因片段，用 RACE 技术克隆出其全长 cDNA 序列。cDNA 长度为 799 bp，
编码 159 个氨基酸。将该 cDNA 序列克隆到原核表达载体 pET28a 中，获得重组质粒 pET28a-eIF5A。不同浓度 NaCl 胁迫
下大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (pET28a-eIF5A)比 E. coli BL21 (pET28a)有明显的抗盐性，前者菌株存活率在 1.0 mol·L-1
NaCl 盐胁迫下是后者的 9.3 倍，据此认为 E. coli BL21 (pET28a-eIF5A)的耐盐性可能与 eIF-5A 基因的表达相关。该基因
的 GenBank 登录号为 AY587771 (基因)、AAT01416 (蛋白)。
关键词 柽柳；RACE；eIF-5A；原核表达；耐盐
Cloning and Expression of Translation Initiation Factor 5A (eIF-5A) Gene
from Tamarix androssowii
YANG Chuan-Ping, JIANG Jing, TIAN Geng, WANG Yu-Cheng*, LIU Gui-Feng
College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
Abstract Based on the partial sequence of eIF-5A gene acquired from Tamarix androssowii cDNA library, the
full length cDNA sequence of eIF-5A was isolated using RACE technology. The cDNA sequence was 799 bp in
length and encoded a deduced amino acid sequence of 159 residues. The gene was cloned into pET28a-vector
and the recombination vector was named pET28a-eIF5A. The salt-tolerance experiment showed Escherichia
coli BL21 (pET28a-eIF5A) had more salt-resistance ability than E. coli BL21 (pET28a) at different NaCl con-
centrations and the former was 9.3 times in survival rate to the later under the stress of 1.0 mol·L-1 NaCl. This
indicated that the high ability of salt-tolerance of E. coli BL21 (pET28a-eIF5A) might be related to the expres-
sion of eIF-5A gene. The eIF-5A gene was accepted by GenBank, the accession numbers are AY587771 (gene)
and AAT01416 (protein).
Key words Tamarix androssowii; RACE; eIF-5A; prokaryotic expression; salt-tolerance
收稿 2004-11-17 修定 　2005-03-15
资助 国家重点基础研究发展规划(“973”)项目(G1999016000)
和国家转基因植物研究与产业化专项(JY03A1802)。
*通讯作者(E-mail: wangyucheng1029@yahoo.com.cn,
Tel: 0451-82191627)。
真核翻译起始因子 5A (eukaryotic translation
initiation factor, eIF-5A)是目前发现的惟一的一个
含hypusine残基的蛋白质，是eIF-5A翻译后第49
位的赖氨酸被修饰成为hypusine的特殊蛋白质[1~3]。
每一成熟的eIF-5A仅含 1个hypusine残基，且eIF-
5A的hypusine修饰是其发挥功能、细胞存活和增
殖所必需的[4]。eIF-5A 在真核细胞的无细胞系统
内可以刺激蛋白质合成的起始，促进第 1 个肽键
的形成[5~7]，eIF-5A 与细胞生长、分化以及增殖
有关[8]。Chou等[9]研究水稻的两种eIF-5A基因发
现，它们的表达受盐、重金属等的诱导，据此
认为它们与环境胁迫相关。
本文根据从 NaHCO3 胁迫后的柽柳(Tamarix
androssowii) cDNA文库中获得的柽柳eIF-5A部分
cDNA 序列，采用 RACE 技术克隆获得 eIF-5A 的
全长 cDNA，构建了 eIF-5A 基因的原核表达载
体，并在大肠杆菌中高效表达，现报道如下。
材料与方法
将盆栽柽柳(Tamarix androssowii)用0.4 mol·L-1
的 NaHCO3 溶液浇灌，进行胁迫处理，在胁迫 60
h 后取柽柳的叶片及嫩茎作为实验试材。
cDNA 文库构建试剂盒为ZAP-cDNAÒ Synthe-
sis Kit和ZAP-cDNAÒ GigapackIIIÒ Gold Cloning
Kit (Stratagene公司产品)，RACE克隆试剂盒为
SmartTM RACE cDNA Amplification Kit(BD
Biosciences)，pMD18-T载体购自宝生物工程大连
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(有限)公司，高保真pfu Taq酶、T4 DNA连接酶、
限制性内切酶均购自 Promega 公司，引物由上海
生工生物技术服务公司合成。
构建cDNA文库和eIF-5A基因的 5 RACE 克
隆 取柽柳cDNA文库的克隆进行随机测序，获得
eI F - 5 A 基因的 ES T 序列(G e n B a n k 登录号：
CF199076)。该克隆经测定，其序列3 完整，而
5约缺编码的90个氨基酸的碱基序列。根据该序
列设计 RACE 引物：5 GTGCCACCAGTCTCAGT-
CAGAAGACTC 3，进行 eIF-5A cDNA 的全长克
隆。5 RACE 的 PCR 反应体系按试剂盒说明书进
行。
eIF-5A基因测序与序列分析 以RACE的 PCR
扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片
段，将回收 DNA 片段与 pMD18-T 克隆载体连接，
以连接产物 pMD-eIF5A 重组质粒转化大肠杆菌
JM109，在含 X-gal和 IPTG的氨苄青霉素的LB固
体培养基上过夜培养，根据蓝白斑选择阳性克
隆，随机挑取 4 个阳性克隆，提取质粒。以质
粒为模板，用 pMD18-T 两端的引物 M13 和 M13-
47 进行 PCR 鉴定插入片段的大小，将插入片段与
预期片段大小相符合的克隆测序。测序由上海博
亚(现为英骏)生物技术有限公司完成。
用NCBI 的 bl2seq 程序进行序列的拼接，拼
接后应用 ORF 查找程序(ORF FOUNDER)寻找其开
放读码框，将开放读码区的推导氨基酸序列用
BLASTP 程序进行氨基酸序列相似性比较，并预
测其保守区。选取与柽柳eIF-5A 同源性较高的9
种植物的 eI F - 5 A 氨基酸序列，用 CL U S T A L X
(1.8)的多序列比较程序(Do complete alignment)进
行多序列比较，用蛋白质家族预测程序( w w w .
pfam.wustl.edu)中的DNA搜索程序(DNA search)进
行蛋白家族预测。
分析NaHCO3 胁迫前后的eIF-5A 基因差异表
达 分别将经NaHCO3 胁迫的柽柳和正常生长的柽
柳(对照)总 RNA 1 mg反转录成cDNA 后，分别稀
释成 100 mL，用作 PCR 模板。以 eIF5A 的编码
区两端序列为引物， P1为：5 TGTCTGACGAGGA-
GCACCATTTC 3，P2 为：5 TTACTTGGGACCAA-
TGTCCTTGAG 3。PCR 反应体系为：10×PCR
缓冲液 2 mL、200 mmol·L-1 dNTP、1.2 U ExTaq、
eIF-5A、引物 P1和 P2 各 1 mmol·L-1、2 mL 反转
录产物。PCR反应程序为：94℃中预变性1 min；
94℃中 30 s，56℃中30 s，72℃中1 min，29个
循环；72℃中保温 7 min。PCR 扩增产物进行琼
脂糖凝胶电泳检测。
构建重组pET28a-eIF5A原核表达载体 取根
据eIF-5A 基因的 cDNA 序列，在开放读码框两端
分别设计上游引物和下游引物，上游引物引入
BamHI 酶切位点，下游引物引入 SacI 酶切位点。
上游引物( P 3 )为：5 C T A G A G G A T C C
(BamHI)ATGTCTGACGAGGAGCACCATTTC 3，
下游引物(P4)为：5 CCCGGGAGCTC (SacI)TTA-
C T T G G G A C C A A T G T C C T T G A G 3 ，用 pM D -
eIF5A 质粒作模板进行 PCR 扩增，在20 mL 反应
体系中加入：10×PCR 缓冲液 2 mL、P3 和 P4 各
50 pmol·L-1、dNTP 200 mmol·L-1、高保真pfu Taq
酶 1 U、模板 60 ng。PCR 反应程序为：94℃中
预变性5 min、94℃中变性45 s，66℃中退火20 s，
72℃中延伸45 s，30个循环；72℃中保温7 min。
基因的PCR产物和 pET28a载体分别进行BamHI和
SacI 双酶切、回收纯化。用 T4 DNA 连接酶对两
者进行连接，连接产物转化至宿主菌E. coli BL21，
将构建的重组质粒命名为pET28a-eIF5A。经 PCR
和酶切法对重组质粒进行筛选鉴定，并对重组质
粒进行测序。
eIF-5A基因在E. coli BL21中的诱导表达 取
重组质粒pET28a-eIF5A转化表达宿主菌E. coli
BL21感受态细胞。在Kanr平板上挑取单菌落，接
种于LB/Kan液体培养基，37℃振荡过夜培养，次
日按1%比例接种到LB/Kan培养基中，培养至A600=
0.5时，加诱导剂IPTG至终浓度分别为0.1、0.5
和1.0 mmol·L-1诱导4 h。4 000×g离心5 min收集
菌体，用 4% 的 SDS 溶液处理 4 min，100℃变
性 10 min，12 000×g 离心 10 min，取上清溶液
进行12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白的表
达，用 U V P 凝胶成像系统分析目的蛋白含量。
重组菌BL21 (pET28a-eIF5A)的耐盐性分析
取BL21 (pET28a-eIF5A)过夜培养物，按1%比例
接种到LB/Kan液体培养基中，培养至A600=0.5时，
加诱导剂IPTG至终浓度为0.5 mmol·L-1，继续培
养4 h，用于耐盐实验，同时以 BL21 (pET28a)
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菌株作为对照。取上述培养物于无菌试管中，每
支试管中加5 mL，再加入无菌NaCl溶液，使管中
的NaCl终浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8 和
1.0 mol·L-1，37℃振荡培养1 h后，以 1∶10 000
稀释后，各取 100 mL 涂 LB 平板。每个处理均设
置 3 个重复，37℃过夜培养并统计菌落数，按公
式：菌株存活率＝(加NaCl的培养基中菌落数/未
加NaCl的培养基中菌落数)×100%计算各处理的菌
株存活率。
结果与讨论
1 柽柳cDNA文库的建立及eIF-5A基因的克隆
获得的柽柳初始 cDNA 文库滴度为 5.7×105，
其插入片段的大小在0.3~3.0 kb之间，对扩增后
的文库克隆进行随机测序，获得了1个长度为482
bp 的 eIF-5A 基因部分序列。 BLASTX 分析表明，
该序列与水稻(Oryza sativa)和橡胶 (Hevea
brasiliensis)的eIF-5A的E值分别为5e-63和1e-62，
说明序列相似性非常高。因此，推断该序列为
eIF-5A 的部分序列。
通过5 RACE PCR 获得了1个长440 bp的特
异性扩增条带，对其进行测序，BLASTX 分析显
示该序列为eIF-5A基因片段，应用NCBI的bl2seq
程序将 5 RACE获得的序列与文库中获得eIF-5A
序列进行拼接，获得该基因完整的 cD N A 序列。
用 NCBI 网站的 ORF FOUNDER 寻找其开放读码
框。最终获得长度为 799 bp 的完整 cDNA 序列，
编码159 个氨基酸(图 1)。
2 eIF-5A基因的保守区查找及蛋白家族预测
对获得的基因推导氨基酸序列用 BLASTP 程
序查找蛋白保守区的结果表明，其含有eIF-5A蛋
白的保守序列(图 2)，说明该基因属于eIF-5A 家
图2 eIF-5A基因推导的氨基酸序列的保守区预测
Fig.2 Search for conserved domains in deduced amino acid sequence of eIF-5A gene
图1 柽柳eIF-5A全长cDNA序列及由此推导的氨基酸序列
Fig.1 The full length of cDNA sequence and deduced amino acid sequences of eIF-5A from T. androssowii
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图4 9种植物的eIF-5A编码的氨基酸序列比对
Fig.4 The amino acid sequence alignment of eIF-5A from 9 plants
柽柳(Tamarix androssowii) AY587771；木薯(Manihot esculenta) AF266464；橡胶树(Hevea brasiliensis) AF516357；烟草
(Nicotiana plumbaginifolia) CAA45104；千里光(Senecio vernalis) AJ238624；马铃薯(Solanum tuberosum) AB004826；番茄
(Lycopersicon esculentum) AF296083；紫花苜蓿(Medicago sativa) AF416338；乳浆大戟(Euphorbia esula) AF225297。
图3 Pfam中的蛋白质搜索程序对eIF-5A基因的蛋白家族预测
Fig.3 Predict of protein family of eIF-5A gene using protein search procedure of Pfam
植物生理学通讯 第41卷 第4期，2005年8月 437
表1 不同NaCl浓度下E. coli菌株存活率
Table 1 The survival rate of E. coli under different
concentrations of salt stress
NaCl浓度/ 菌株存活率/%
mol·L
-1
BL21 (pET28a-eIF5A) BL21 (pET28a)
0 100.00 100.00
0.4 59.37 31.47
0.6 38.00 9.48
0.8 9.08 4.98
1.0 0.31 0.03
族基因。
用蛋白质家族预测程序(www.pfam.wustl.edu)
中的 DNA搜索程序(DNA search)对该基因的cDNA
序列进行蛋白家族预测表明，该基因编码产物属
于eIF-5A蛋白家族(图 3)。
3 eIF-5A基因的序列分析
对该序列进行 CLUSTALX 分析的结果表明，
该基因与GenBank中其他物种的eIF-5A基因序列
相似性在 88%~93% 之间。选取与柽柳 eIF-5A 相
近9个物种的eIF-5A序列，进行多序列比对分析，
结果见图 4。
4 NaHCO3 胁迫前后的eIF-5A 基因差异表达
分别以 NaHCO3 胁迫处理的柽柳和非胁迫处
理的柽柳(对照)cDNA为模板，eIF-5A的编码区两
端序列为引物进行 PCR 扩增，RT-PCR 扩增产物
经琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，480 bp处的扩
增谱带明显不同，经NaHCO3 胁迫的 eIF-5A 基因
扩增亮度高于未作胁迫处理的扩增亮度(图5)，表
明胁迫前后该基因的表达存在差异。
导表达后，SDS - P A G E 电泳显示，在分子量 17
kD 左右处有特异的条带出现，未经 IPTG 诱导的
BL21 (pET28a-eIF5A)只见非常浅的条带，而BL21
(pET28a)则无此条带。经过UVP 凝胶成像系统分
析的结果表明，所表达的融合蛋白分子量为17.3
k D，表达量约占总蛋白的 5 3 %，不同诱导剂浓
度对表达无明显影响(图 6)。
5 pET28a-eIF5A 原核表达载体的鉴定及eIF-5A
在E. coli中的表达
随机选取 4 个重组质粒 pET28a-eIF5A 进行
PCR 扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，均获得480 bp
的阳性谱带。进而对pET28a-eIF5A的插入序列测
序表明，eIF-5A基因已经克隆到原核表达载体中。
重组转化菌BL21 (pET28a-eIF5A)经 IPTG诱
6 重组菌BL21 (pET28a-eIF5A)的耐盐性分析
重组菌 BL21 (pET28a-eIF5A)和对照 BL21
(pET28a)在不同浓度 NaCl 平板上培养的结果表
明，重组菌 BL21 (pET28a-eIF5A)比对照 BL21
(pET28a)具有一定的耐盐能力，当NaCl浓度达到
图5 NaHCO3胁迫前后柽柳eIF-5A基因
表达的 RT-PCR 电泳分析
Fig.5 Analysis of the expression of eIF-5A in T. androssowii
before and after NaHCO3 stress by RT-PCR methods
1：分子量标准 DL 2000(自上而下为 2 000、1 500、750、
500、250、100 bp); 2：非胁迫处理 RT-PCR 产物；3：胁
迫处理 R T - P C R 产物。
图6 pET28a-eIF5A在E. coli BL21中
表达的 SDS-PAGE 分析
Fig.6 SDS-PAGE analysis of pET28a-eIF5A
expressing in E. coli BL21
1：标准分子量蛋白；2：BL21(pET28a-eIF5A)经 1.0
mmol·L-1 IPTG 诱导；3：BL21(pET28a-eIF5A)经 0.5 mmol·L-1
IPTG 诱导；4：BL21(pET28a-eIF5A)经 0.1 mmol·L-1 IPTG
诱导；5：经 0.5 mmol·L-1 IPTG 诱导 BL21(pET28a); 6：未
经 IPTG 诱导的 BL21(pET28a-eIF5A)。
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1.0 mol·L-1时，重组菌BL21 (pET28a-eIF5A)的存
活率明显高于对照BL21 (pET28a)菌株，约是对照
的9.3 倍。由表1可见，eIF-5A 基因的表达增强
了宿主菌的抗盐能力，从而也初步证明该基因可
赋予宿主菌一定的耐盐能力。
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