全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 2期，2007年 4月 359
碧桃(Prunus persica L.)叶中 β-葡萄糖苷酶的分离纯化和某些特性分析
李志强，廖祥儒 *，陆芳
江南大学教育部工业生物技术重点实验室，江苏无锡 214036
Purification and Some Properties of β-glucosidase from Leaves of Prunus
persica L.
LI Zhi-Qiang, LIAO Xiang-Ru*, LU Fang
The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, The Ministry of Education, Southern Yangtze University, Wuxi, Jiangsu 214036,
China
提要：碧桃叶经过破碎、硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-100凝胶过滤、DEAE-纤维素 52阴离子交换色谱分离纯化后，得
到一个新的电泳纯的 β-葡萄糖苷酶。此酶的最适 pH值为 5.5；最适反应温度为 60 ℃，温度低于 60 ℃时该酶较为稳定，
温度高于65 ℃时酶易失活。
关键词：β -葡萄糖苷酶；碧桃；纯化
收稿 2006-11-20 修定　 2007-02-05
资助　 江南大学人才引进基金(0 0 66 2 6 )。
* 通讯作者(E-mail：liaoxiangru@163.com；Tel：0510-
8 5 8 7 9 7 8 1 )。
β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC 3.2.1.21)催
化纤维二糖水解成葡萄糖(Beguin和Aubert 1994)，
也水解由其他物质与葡萄糖形成的 β - 葡萄糖苷
键，因此它既是纤维素酶复合酶系中 3种酶的组
成酶(阎伯旭和高培基 1995)，同时也参与催化生
物次生产物糖苷的水解，从而有利于次生产物生
物学功能的发挥。β - 葡萄糖苷酶广泛分布于植
物、真菌、细菌和动物体中( W o o d w a r d 和
Wiseman 1982)，生氰糖苷(Conn 1981)、异羟氧
酸 β-葡萄糖苷(Niemeyer 1988)和细胞壁纤维素水
解产生的寡聚糖(Leah等 1995)是植物 β-葡萄糖苷
酶的主要底物。植物体中的许多生理活性物质也
多形成糖苷后运输和贮存，因此 β-葡萄糖苷酶在
植物防御和生长发育的调控中也起作用。已知木
薯、橡胶、高粱、核果类植物都含有生氰糖苷
(Poulton 1989)和相应的 β-葡萄糖苷酶，但有关桃
树叶中 β-葡萄糖苷酶的研究尚未见报道。本文检
测出桃树叶中有较高的 β-葡萄糖苷酶活性，并对
此酶作了分离纯化，同时对其部分性质作了分
析。
材料与方法
碧桃(Prunus persica L.)叶采自本校校园内。
于 2006年 5~6月期间，采自六年生桃树，采摘
时取每枝顶端生桃叶，采摘后用蒸馏水洗净、擦
干，储存于 -70 ℃的超低温冰箱内备用。
提取酶粗提液时，称取 200 g桃叶，加入 400
mL 40 mmol·L-1柠檬酸三钠 -柠檬酸缓冲液(pH
5.5)，内含 2% (W/V) EDTA和 1% (W/V)聚乙烯吡
咯烷酮(PVP)，匀浆机打碎后以 8 000×g于 4 ℃下
离心 20 min，取上清液进行硫酸铵沉淀(江昌俊等
2000；廖祥儒等 2002)。上清液经硫酸铵分级沉
淀，取有 β-葡萄糖苷酶活性部分用 40 mmol·L-1柠
檬酸三钠 -柠檬酸(pH 5.5)溶解，透析过夜，冻
干后备用(汪家政和范明 2000)。
酶纯化时，取冻干的样品用少量Sephadex G-
100柱(长度 40 cm，直径 10 mm)平衡缓冲液(100
mmol·L-1的柠檬酸三钠 -柠檬酸缓冲液，pH 5.5)
溶解，经 Sephadex G-100分子筛层析(流速为 0.8
mL·min-1)，收集有 β-葡萄糖苷酶活性部分，在
DEAE-纤维素 52阴离子交换柱(长度 15 cm，直
径15 mm)平衡液中透析过夜后又经DEAE-纤维素
52阴离子交换层析纯化(Marshak等 1996)，以 1
mol·L-1 NaCl溶液梯度洗脱(1 mL·min-1)，收集到
的有活性的部分置于缓冲液中透析过夜后冷冻干
燥，即为纯化的 β - 葡萄糖苷酶(汪家政和范明
2000)。
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测定酶的最适温度时，取 10 µL酶液，加入
到含有 40 mmol·L-1的柠檬酸三钠 -柠檬酸缓冲液
(pH 6.0)和100 mmol·L-1的对硝基β-D-葡萄糖苷(p-
nitrophenyl β-D-glucopyranoside，p-NPG)的缓冲
体系中，测定 40、50、60、70、80、90 ℃下
的酶活性，反应 5 min后，加入冰中预冷的 500
µL 500 mmol·L-1的NaOH以终止反应(Phimchanok
和Dietmar 2006)。β-葡萄糖苷酶活性以每分钟催
化生成 1 µmol对硝基苯酚的酶量为 1个酶活单位
(U)，比活用每毫克蛋白所具有的酶活性表示，即
U·mg- 1。
测定酶的最适 pH值时，配制 pH 3.5~8.0的
缓冲液(pH 3.5~6.6为柠檬酸三钠 -柠檬酸缓冲液；
pH 6.6~8.0为柠檬酸 -磷酸氢二钠缓冲液)，取 10
µL酶液，加入到含有 40 mmol·L-1的缓冲液和 100
mmol·L-1的 p-NPG的缓冲体系中，于 60 ℃下反应
5 min后，加入冰中预冷的 500 µL 500 mmol·L-1
的NaOH以终止反应(苟萍等 2004)。
测定酶活性时，取 10 µL酶液，加入到 60 ℃
水浴中的缓冲体系中，缓冲体系为：440 µL 40
mmol·L-1的柠檬酸三钠 -柠檬酸(pH 5.5)和 50 µL
100 mmol·L-1的 p-NPG，反应 5 min后，加入经
在冰中预冷的 500 µL 500 mmol·L-1的NaOH以终
止反应(江昌俊和李叶云 1999；Luan等 2006)。
蛋白质分子量测定采用 12% SDS-聚丙烯酰
胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，12% 的分离胶，5%
的浓缩胶，0.025 mol·L-1 Tris-甘氨酸缓冲液(pH
8.3)，以考马斯亮蓝 R-250染色，甲醇、冰醋酸、
蒸馏水(1:1:8)脱色(汪家政和范明 2000；刘艳如等
2003)。标准蛋白为：β-半乳糖苷酶(来源大肠杆
菌)，分子量为 116.0 kDa；牛血清蛋白(来源牛
血浆)，分子量为 66.2 kDa；卵清蛋白(来源鸡蛋
清)，分子量为 45.0 kDa；乳酸脱氢酶(来源猪肌
肉)，分子量为 35.0 kDa；限制性核酸内切酶(来
源大肠杆菌)，分子量为 25.0 kDa；β-乳球蛋白
(来源牛奶)，分子量为 18.4 kDa；溶菌酶(来源鸡
蛋清)，分子量为 14.4 kDa (Fermentas公司生产)。
蛋白质含量测定采用 Bradford法(Bradford
1976)。
结果与讨论
1 酶的纯化和鉴定
如图 1所示，经 Sephadex G-100分子筛层析
可得到 3个蛋白峰。经检测，b和 c峰为杂蛋白
峰，a峰有 β-葡萄糖苷酶活性，因此收集 a峰并
以之进行下一步纯化。
经 Sephadex G-100分子筛层析后，具有β-葡
萄糖苷酶活性的组分经透析后上样到DEAE-纤维
素 52阴离子交换柱中，用 0~1 mol·L-1 NaCl进行
梯度洗脱，共得到 3 个蛋白峰(图 2 )。经检测，
b和 c峰为杂蛋白峰，而 a峰具有 β-葡萄糖苷酶
活性，将收集到的酶液透析冻干，分别用少量缓
冲液溶解后进行 SDS-PAGE (汪家政和范明 2000)
或凝胶过滤层析，确认其纯度。
经过几步纯化，β-葡萄糖苷酶纯化程度提高
5.57倍，酶的比活性由 1.17 U·mg-1提高到 91.56
图 1 Sephadex G-100柱层析图谱
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表 1 β-葡萄糖苷酶的纯化倍数和得率
纯化步骤 总酶活 /U 总蛋白含量 /mg 酶比活性 /U·mg-1 纯化倍数 得率 /%
酶粗提液 737.86 629.57 1.17 1.00 100.00
30%~60%盐沉淀 124.60 65.80 1.89 1.62 16.90
Sephadex G-100柱层析 60.26 22.87 2.63 2.25 8.17
DEAE-纤维素 52 阴离子交换柱层析 61.68 0.67 91.56 52.08 5.57
图 3 β-葡萄糖苷酶的 12% SDS-PAGE图谱
U·mg-1，但得率只有 5.57% (表 1)。
2 酶的几种性质
图 3~7显示：(1)用 SDS-PAGE方法测得此酶
的分子量约为 64.5 kDa (图 3) ；(2)先在 pH 6.0条
件下改变反应温度测定酶活性，得出此酶反应的
最适温度为 60 ℃ (图 4)，再在 60 ℃时测定不同
pH条件下β-葡萄糖苷酶的活性，得到此酶反应的
最适 pH值为 5.5 (图 5) ；(3)将纯酶液在 40、50、
60、65、70、80 ℃温度下分别保温 0、10、20、
图 2 DEAE-纤维素 52阴离子交换柱层析图谱
图 5 不同 pH下的酶活性
图 4 不同温度下的酶活性
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30、40、50、60 min后在 60 ℃下测定 β-葡萄
糖苷酶活性的结果表明，温度小于 60 ℃，1 h内
的碧桃叶β-葡萄糖苷酶活性不变，温度高于70 ℃
时此酶极不稳定(图 6 )；( 4 )改变反应液中底物
p-NPG的浓度，测定不同底物浓度下的酶活性，
用双倒数作图法得出碧桃叶β-葡萄糖苷酶的Km为
6 .032 mmol · L- 1，最大反应速度 V max为 0 .360
µmol·min-1 (图 7)。
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