全 文 ：植物生理学通讯 第 40卷 第 5期，2004年 10月 597
用等电聚焦技术鉴定杂交稻华优桂99的种子纯度
胡群宝* 夏清华 陈森
广东省种子质量监督检测中心, 广州 510500
Identification of Seed Purity from Hybird Rice (Oryza spp.) of Variety Huayougui
99 by Isoelectric Focusing
HU Qun-Bao*, XIA Qing-Hua, CHEN Sen
Seed Quality Supervising and Testing Center of Guangdong Province, Guangzhou 510500
提要 利用等电聚焦技术对杂交稻华优桂99及其亲本种子蛋白进行了分析，发现有一对亲本互补谱带。应用此种互补
谱带，对华优桂99的种子纯度进行了鉴定，与田间小区种植鉴定的结果比较差异较小。表明这一技术在华优桂99种子
纯度的鉴定中是可行的。
关键词 等电聚焦；杂交稻；纯度鉴定
收稿 2003-12-29 修定 　 2004-04-02
* E-mail: huqunbao@126.com, Tel: 020-37288072
华优桂99是用不育系Y华农A与恢复系桂99
配组而成的华南早籼杂交稻，2000年12月~2001
年 5月分别通过了广西、广东和全国农作物品种
审定[1]。该杂交稻米质优良、高产稳产、高抗
稻瘟病、适应性广、制种产量高，且早中晚季
均可种植利用，深受农民欢迎，在两广地区有一
定的种植面积。
目前华优桂99的种子纯度鉴定还只能依靠田
间种植，或在海南加代繁殖来进行，3~4 个月后
才有结果。由于杂交种收获后不能及时获得种子
纯度的信息资料，一直是困扰种子生产单位、用
户和管理部门的难题之一。这些年来，我国农
业科技人员先后提出和应用了海南加代鉴定、
同工酶鉴定、幼苗分子标记鉴定等种子纯度鉴定
技术[2~6]。这些纯度鉴定方法，有的虽然快速，
但技术操作复杂，批量检测困难，准确性不够
高；有的方法准确性虽高，但时效性差。因此，
生产上急需寻找一种更为准确、经济、快速、有
效的种子纯度鉴定新方法。
蛋白质的等电聚焦技术( i s o e l e c t r i c
focusing，IEF)是由Radola[7]开展起来并经不断
改进的常用技术，具有简便、快速、分辨率高
的特点。在鉴定我国水稻种子纯度与真实性中
已有报道[8~11]。但迄今尚未找到稳定、可靠的
亲本互补型种子蛋白谱带。本文以杂交稻品种
华优桂 99 及其亲本为材料，探讨等电聚焦技术
鉴定杂交稻种子的方法。
材料与方法
1 材料
水稻(Oryza sativa)杂交稻华优桂99的种子及
亲本由华南农业大学提供，审定编号为粤审稻
200118。亲本为 Y 华农 A/ 桂 99。
2 种子蛋白的提取
将单粒干种子放入电动种子粉碎机(WD9419
型，北京六一仪器厂)粉碎后倒入0.5 mL塑料离心
管，每管加入100 mL蛋白质提取液(45%的 2- 氯
乙醇)。室温下静置提取1 h，用漩涡混合器混合
15 s后离心(2 500×g) 7 min，备用。
3 电泳方法
聚丙烯酰胺凝胶的制备参照Westermeier[12]方
法并有所修改。将1块涂有Bind-Silane (Pharmacia
Biotech)的玻璃板(厚度<1.5 mm，259 mm×124
mm)与同样大小的U型玻璃(涂有Repel-Silane ES,
Pharmacia Biotech)合拢，形成约0.75 mm厚的胶
室，用注射器注入 6 mL 聚丙烯酰胺母液(T=
6.8%、C=2.5%)，如图 1 所示。6 mL 母液含有
0.44 mL两性电解质(pH 6.0~8.0, Pharmacia)、7 mL
四甲基乙二胺和25 mL 20%(W/V)过硫酸铵、5.5 g
尿素。室温下静置 60 min 即聚合完毕。撬开玻
璃，将点样带放在凝胶靠近正极一侧，取上述制
备好的 20 mL 样品上清液注入点样孔内。
将点好样的凝胶放到电泳系统的冷却板上，
放置被正负极缓冲液均匀湿润的电极条，接通电
植物生理学通讯 第 40卷 第 5期，2004年 10月598
源聚焦(温度 9℃，电压 2 500 V、电流 50 mA、
功率 30 W，90 min)。电泳结束，固定 20 min，
染色 50 min，脱色 20 min 后，干燥，扫描。
正极缓冲液：0.332% 天冬氨酸、0.368% 谷
氨酸；负极缓冲液：0.472% 精氨酸、0.364% 赖
氨酸、12% 乙二胺；固定液：12%(W/V)三氯乙
酸；染色液：乙酸∶乙醇∶双蒸水 = 1 1∶1 8∶
71 (V∶V∶V)，含 0.015%(W/V)考马斯亮蓝
R250、0.045%(W/V)考马斯亮兰 G250；脱色液：
乙醇∶乙酸∶双蒸水 =30∶5∶6 5 ( V∶V∶V)。
4 种植鉴定
田间小区种植鉴定方法按农作物种子检验规
程(GB/T3453.4-1995)进行。
实验结果
1 华优桂99的IEF图谱
在杂交稻种子和亲本种子中，是否能找到双
亲互补型多态性电泳谱带是进行杂交种子纯度鉴定
的前提。从图 2 可以看出，亲本与杂种种子中有
多条电泳蛋白谱带。其中，A 带和 B 带是 2 条互
补谱带。F1 代从母本遗传有 A 带，而这条 A 带是
父本所没有的；通过杂交，遗传物质的交换，从
父本遗传有 B 带，而此 B 带是母本所没有的。A、
B 2条互补带同时在杂交种中出现，是识别华优桂
99 真假杂种的关键，也是纯度鉴定的依据。
2 应用图谱鉴定杂交稻种子的纯度
应用上述图谱对样品编号为C030013的华优桂
99的种子纯度进行了鉴定，发现100粒种子中有母
本类型的假杂种(只有A带而无B带)3粒，真杂种
(既有 A 带又有B 带)97 粒，纯度为97%；而田间
鉴定结果为96.8%。两者比较，差异较小，表明
用此技术鉴定华优桂 99 种子的纯度是可行的。
讨　　论
亲本与F1代杂种之间表型的差异反映了基因
上的差异，这些差异又是通过各种不同的结构蛋
白与功能蛋白的互相作用而表现出来。寻找亲本
的特征蛋白或标志基因片段是水稻杂交种子的真实
性与纯度鉴定的基础。技术上在 DNA 水平寻找亲
本及杂种相互之间的差异比在蛋白水平上寻找差异
难度要大得多。目前，还没有直接识别亲子间
D N A 差异的方法。
本文通过筛选多种不同的提取液，采用等电
聚焦技术，在杂交稻华优桂99的种子蛋白中找到
了亲本互补型蛋白带，在多次重复试验中互补型
蛋白带能稳定重现。这为杂交稻种子的快速鉴定
奠定了基础。这一方法是否也适用于其它品种的
杂交稻种子鉴定，尚在试验之中。
参考文献
1 蔡善信,何泽华,黄羿铭等. 华南优质杂交早籼华优桂99.杂交
水稻,2001,16(6):57~58
2 陈洪,钱前,朱立煌等. 杂交水稻汕优 63 杂种纯度 RAPD 鉴
定.科学通报,1996,41(9): 833~836
3 钱前,陈洪,孙宗修等. 真假杂交水稻II优63的RAPD鉴定.
中国水稻科学,1996, 10(4):241~242
4 曾大力, 钱前, 何平等. 用分子生物学技术鉴别真、假杂交
稻的研究.中国农业科学,1999,32(2):93~97
5 彭锁堂,庄杰云,颜启传等.我国主要杂交水稻组合及其亲本
SSR标记和纯度鉴定.中国水稻科学, 2003, 17(1):1~5
6 詹庆才.利用微卫星DNA标记进行杂交水稻种子纯度鉴定的
研究.杂交水稻,2002,17(5):46~50
7 Radola BJ. Ultrathin layer isoelectric focusing in 50-100 mm
polyacrylamide gels on silanized glass plates or polyester
files. Electrophoresis, 1980, 1:43~56
8 严敏,王晓峰.杂交玉米、水稻和辣椒种子品种真实性和纯
度的室内快速鉴定. 华南农业大学学报(自然科学版),2003,
24(2): 6~8
9 王晓峰,黄惠玲,Knoblauch R等.超薄等电聚焦电泳技术在水
稻品种鉴定上的运用.种子,2000,(4):6~9
10 王晓峰,赵婷.超薄等电聚焦电泳技术及其在种子纯度鉴定中
的运用.种子,2000,(6):55~57
11 蒋昌华,王和勇,陈润政等.利用等电聚焦技术鉴定杂交水稻
种子纯度.种子世界,2001,224(8): 23~24
12 Westermeier R. Electrophoresis in Practice.3rd ed.
Weinheim,Germany: Wiley-VCH, 2001.171~182
图2 华优桂99的IEF电泳图谱
从左到右依次是：母本、F 1 、父本各 6 条。图1 制胶示意