全 文 ：中国农业科学　 1998, 31( 4): 26～ 31
Scientia Ag ricultura Sinica
低磷营养胁迫对小麦 -长穗偃麦草附加系
酸性磷酸酶同工酶的影响*
李玉京1　李　滨 1　刘建中 1　李继云 2　李振声1　姚树江 1
( 1中国科学院遗传研究所 ,北京　 100101 ; 2中国科学院生态环境研究中心 )
提要　以中国春 -长穗偃麦草二体异附加系为材料 ,用等电聚焦 ( IEF)方法研究低磷营养胁
迫下叶片与根系组织内酸性磷酸酶 ( AcPh )同工酶的变化。 结果表明 ,与正常生长条件 ( CK)下
相比较 ,低磷营养胁迫导致 AcPh同工酶的显著变化。叶片组织中 ,低磷胁迫诱导出的至少 1条
AcPh同工酶带主要在低 p H范围内 ,高 p H范围内的 AcPh同工酶带则与 CK无明显差异。根系
组织中则与此相反 ,高 pH范围内诱导出至少 3条新酶带 ,而低 p H范围内 ,则主要是酶带的加
强。 此外 ,对低磷胁迫下叶片与根系组织内 AcPh同工酶变化的生理意义进行了讨论。
关键词　二体异附加系 ;低磷营养胁迫 ;酸性磷酸酶 ;同工酶 ;等电聚焦
我国约 2 /3的土壤中可被植物直接吸收利用的有效磷含量很低 ,这种状况已严重影响
了作物生长与产量 ,但土壤全磷量却很高 (平均为有效磷含量的 100～ 600倍 )〔 1〕。研究表明 ,
低磷营养胁迫下 ,植物根系分泌到生长介质中的酸性磷酸酶 ( AcPh ) ( E. C. 3. 1. 3. 2)活性显
著增强〔 2～ 5〕 ,以活化生长介质中的难溶性有机磷成为有效磷便是其机制之一。此外 , AcPh作
为一类水解磷酸单酯键的水解酶〔6, 7〕 ,与细胞的许多生理生化过程有关 ,包括细胞防御、细胞
自身降解、细胞质 PO3-4 库的维持等 ,高等植物中该酶还与细胞壁的转化、果实成熟及种子
发芽等密切相关〔 8～ 10〕。低磷营养胁迫下 ,植物根系分泌到生长介质中的 AcPh活性增强幅度
与植物磷利用效率的关系在玉米〔 11, 12〕和高粱〔 13, 14〕等作物上均有报道。然而 ,缺磷导致植物
组织内 AcPh同工酶的变化特征以及与磷利用效率关系的报道却很少。长穗偃麦草〔A-
gropyron elongatum ( 2n= 2x= 14, EE)〕是普通小麦的野生近缘物种 ,因具有耐盐碱、耐瘠
薄、抗病、抗逆性好等优良性状而倍受遗传育种学者的重视。 为研究并利用控制这些优良性
状的基因 ,前人已将长穗偃麦草的 7对染色体分别附加到普通小麦中国春背景中〔 15, 16〕 ,育成
了一套中国春 -长穗偃麦草二体异附加系 ( 2n= 44)和双二倍体 ( 2n= 8x= 56, AABBDDEE)。
在此基础上 ,利用这 7对染色体分别代换中国春的 21对染色体 (同源群代换 ) ,育成了一套
二体异代换系。本实验以该套附加系及背景亲本为材料 ,研究低磷胁迫下叶片与根系组织内
AcPh同工酶的变化以及这些变化与耐低磷特性之间的关系 ,以期为进一步研究植物耐低
磷胁迫的生理生化机制提供信息。
1　材料与方法
1. 1　植物材料
中国春 -长穗偃麦草二体异附加系由美国加利福尼亚大学 ( UC. Davis) Jan Dvo rak教授
　 收稿日期　 1997-09-30
* 国家自然科学基金重大课题资助项目。
和仲干远博士提供 ,分别标记为 DA1E、 DA2E、…… DA7E( 2n= 44) ;双二倍体 ( 2n= 8x=
56, AABBDDEE)以及背景亲本中国春。
1. 2　方法
1. 2. 1　附加系根尖染色体的细胞学检查　常规压片法 ,醋酸洋红染色。
1. 2. 2　材料的培养　镜检选出 2n= 44的附加系和 2n= 56的双二倍体植株以营养液培养 ,
设置对照 ( CK)与缺磷 (- P)两个处理。对照与缺磷处理的区别仅在有效磷的含量 ,对照为
2mg· kg- 1 ,缺磷为 0. 1mg· kg- 1。4月初至 5月初在室外培养 1个月 ,此时缺磷处理表现出
明显的生长受阻。
1. 2. 3　 AcPh酶液的制备　取营养液培养 30d的植株根系和幼嫩叶片 ,在液氮中研磨 ,加
提取液 ( 0. 1mol /L NaAc pH5. 1) ( 100μl /0. 1g鲜重样品 ) ,室温提取 1h , 15000r /min, 4℃离
心 5min,取上清液 (即为 AcPh粗提液 ) , - 20℃保存备用。
1. 2. 4　叶片与根系组织内 AcPh活性的测定　参考 Tadano和 Sakai〔17〕的方法并加以修
改。 ( 1) AcPh反应混合液的组成: 0. 1mol /L NaAc pH5. 1, 5mmol /L对硝基磷酸苯酚
( NPP) , 5mmol /L CaCl2。 ( 2) AcPh活性测定: 取上述制备的 AcPh酶液 0. 2ml ,用双蒸水稀
释至 6. 0ml,再加入 3ml AcPh反应混合液并摇匀 , 37℃水浴中保温 30min。加 2ml 0. 5mo l /
L Na2 CO3以终止酶促反应 ,提供反应产物 N P显色的碱性环境 ,用 UV-2201 Series分光光
度计测 400nm处的光吸收。 从标准曲线上查出 N P的释放量 ,折算成单位鲜重的叶片和根
系组织内的 AcPh活性。
1. 2. 5　凝胶制备　 30% Acr /Bis( 29∶ 1) 0. 76m l, 16%甘油 4. 9m l; Ampholine pH3～ 9. 5∶
pH4～ 6= 175μl∶ 175μl; TEMED 8μl, 1% APS 200μl。
1. 2. 6　 IEF　用 Pha rmacia /LKB等电聚焦仪 ,终电压 3000V ,电流 80m A,功率 8W ,预电泳
20min,上样量 20μl。电极缓冲液: (+ ) 0. 5mo l /L HAc, ( - ) 1mo l /L NaOH。
1. 2. 7　染色　参照 Tanksley〔 18〕的方法并加以修改。 染色液配方如下:
　　 Na Ac 100mmo l /L pH5. 1 100ml
　　 MgCl2· 2H2O 1mo l /L 1m l
　　 Fast Ga rnet GBC 100mg
　　 1% β-磷酸萘酯 ( 50%丙酮为溶剂 ) 3m l
　　将 Fast Garnet GBC盐溶于 NaAc缓冲液中 ,然后加入 β -磷酸萘酯 ,凝胶在此溶液中染
色 , 30℃保温 1～ 5h ,直到清晰的带出现 ,自来水冲洗 ,立即拍照。
2　结果与分析
2. 1　叶片与根系组织内 AcPh活性
由下表可见: ( 1)低磷胁迫下各附加系、双二倍体及背景亲本中国春的叶片与根系组织
内 AcPh活性均显著高于对照 ; ( 2)低磷胁迫下 ,叶片组织内 AcPh活性升高幅度以 DA7E
和双二倍体为最大 ,其次是 DA6E,其余基因型间差异不显著 ; ( 3)低磷胁迫下 ,基因型之间
根系组织内 AcPh活性升高幅度差异不显著。 因此 ,有必要进一步研究低磷胁迫诱导下 ,
AcPh同工酶的变化。
274期 李玉京等:低磷营养胁迫对小麦 -长穗偃麦草附加系酸性磷酸酶同工酶的影响
表 　中国春 -长穗偃麦草二体异附加系叶片与根系组织内 AcPh活性〔NPμg· ( 30min)- 1· ( g- 1鲜重 )〕
Table　 AcPh activ ity in alien disomic addition lines of Chinese Spring-A gropyron elongatum bo th in lea f
and ro ot tissues〔NPμg· ( 30min)- 1· ( g- 1 FW)〕
材料
Materials
Ac Ph活性 Ac Ph activi ty
叶片组织 Leaf tis su e
CK - P - P /CK(% )
根系组织 Root tis sue
CK - P - P /CK(% )
中国春 Chin es e Spring 283 563 198 364 679 187
DA1E 287 559 195 348 677 194
DA2E 294 546 186 356 691 194
DA3E 302 584 193 361 716 198
DA4E 283 562 198 359 723 201
DA5E 301 540 182 339 674 199
DA6E 289 637 220 372 753 202
DA7E 314 773 246 368 746 203
双二倍体 Amphiploid 306 729 238 355 732 206
2. 2　叶片与根系组织内 AcPh同工酶变化
从叶片与根系组织 AcPh的 IEF图谱 (图 1、图 2)看出: ( 1) AcPh同工酶极其复杂 ,有几
十条酶带; ( 2)叶片与根系组织的 AcPh同工酶 IEF图谱差异甚大 ,叶片组织中的酶带多而细
弱 ,而根系组织中的酶带则较强 ; ( 3)低磷营
养胁迫下 ,无论是叶片还是根系组织内 ,
AcPh同工酶谱均与正常生长条件 (对照 )下
有显著不同 ,即均有酶带的加强或新酶带的
产生 ,但诱导出的新酶带则因植物组织而异。
组织内 AcPh同工酶带的加强表明酶活性的
加强 ,而新的诱导酶带的产生 ,则表明新的酶
蛋白的产生或本来无活性的酶蛋白亚基由于
某些特殊机制而具有活性。
2. 2. 1　叶片组织 AcPh同工酶的变化　从
图 1看出: ( 1)高 pH范围内 ,缺磷与对照条
件下的 AcPh同工酶无显著差异 ; ( 2)低 pH
范围内则普遍表现为缺磷条件下酶带的加强
并且至少产生 1条新酶带 ,但 1E、 3E、 6E、 7E
附加系及双二倍体的诱导酶带较强 ,而 4E、
5E附加系则相对较弱 ; ( 3) 7E附加系在缺磷
条件下出现一条其它附加系及背景亲本中国
春所不具有的诱导酶带 ,这与叶片组织内
AcPh活性的测定结果 ( 7E附加系在缺磷条
件下的活性显著高于其它附加系和背景亲
本 )相吻合。
2. 2. 2　根系组织 AcPh同工酶的变化　与
叶片组织 AcPh同工酶的变化相反 ,高 pH
范围内 ( p H8～ 9. 5) ,低磷胁迫下均有至少 3
1、 2. 1E附加系 ; 3、 4. 2E附加系 ; 5、 6. 3E附加系 ; 7、 8. 4E附
加系 ; 9、 10. 5E附加系 ; 11、 12. 6E附加系 ; 13、 14. 7E附加
系 ; 15、 16.双二倍体 ; 17、 18.中国春
单号为对照 ,双号为低磷营养胁迫
1, 2. DA1E; 3, 4. DA2E; 5, 6. DA3E; 7, 8. DA4E; 9,
10. DA5E; 11, 12. DA6E; 13, 14. DA7E; 15, 16. Am-
phiplo id; 17, 18. Chinese Spring
The even numbers mean phospho rus deficiency
stress, and the odd num ber s represent no rmal
g r ow th condition( CK )
图 1　中国春 -长穗偃麦草二体异附加系叶片组织
AcPh同工酶的 IEF图谱
Fig . 1　 IEF diag ram of AcPh iso zyme in lea f tissue
o f alien disomic addition lines betw een Chi-
nese Spring and Agropy ron elongatum
28 中　国　农　业　科　学 31卷
条新的诱导酶带产生 (对照在该区域的极微弱的颜色是因样品条在此而造成的拖尾 ) ,而低
pH范围内 ( p H3～ 5)主要表现为酶带的加强 ,并未发现新的诱导酶带 (图 2)。 DA1E、 DA2E、
DA3E均与背景亲本无显著差异 ,而且根系组织内 AcPh活性的测定结果也表明这 3个附
加系与中国春之间无明显差异 ,因此对根系组织 AcPh同工酶变化的研究中未包括这 3个
附加系。
综上所述 ,低磷胁迫下 ,这两种植物组织中 AcPh的诱导表达差异甚大。因此 ,根系与叶
片组织内的 AcPh同工酶的诱导表达可能受两套不同的遗传系统调控。
1、 2. 4E附加系 ; 3、 4. 5E附加系 ; 5、 6. 6E附加系 ; 7、 8. 7E附
加系 ; 9、 10.双二倍体 ; 11、 12.中国春
单号为对照条件下的 AcPh ,双号为缺磷条件下的 AcPh
1, 2. DA4E; 3, 4. DA5E; 5, 6. DA6E; 7, 8. DA7E; 9, 10. Am-
phiploid; 11, 12. Chin ese Spring
The ev en num bers represent phosphorus d eficiency s tress ,
and th e odd num bers mean th e no rmal g row th condi tion
( CK)
图 2　中国春 -长穗偃麦草二体异附加系根系组织 AcPh同工酶的 IEF 图谱
Fig. 2　 IEF diag ram o f AcPh iso zyme in r oo t tissue o f alien disomic addition lines betw een Chinese Spring
and Agropyron elongatum
3　讨论
实验结果表明 ,低磷胁迫导致植物叶片与根系组织内 AcPh酶带加强或诱导产生新酶
带 ,其生理意义尚不完全清楚 ,可能与胁迫条件下体内 PO3-4 的应急供应有关。 因为许多与
耐低磷胁迫有关的生化过程 (胁迫状态诱导某种或某些特定抗逆物质的大量合成等 ) ,都涉
及到有关基因的转录与转译水平的加强 ,而转录水平的加强对 PO3-4 的需求量增大。即适于
这些特定生化过程对 PO3-4 的急需 ,体内 AcPh活性升高或产生新的同工酶以水解体内的有
机磷释放 PO3-4 。例如 ,低磷营养胁迫下 ,根系分泌有机酸 (柠檬酸、琥珀酸、苹果酸等 )的量增
加 ,以活化土壤中的难溶性磷 ,而根系分泌物来自地上部光合作用的产物 ,磷酸烯醇式丙酮
酸羧化酶 ( PEPC)起到重要作用〔19〕 ; AcPh的分泌量增加对于活化土壤中的无效态有机磷具
有重要意义 ;对磷有高度亲和力的质膜转运蛋白〔20〕的合成量增加 ,使植物在低磷胁迫条件
下能有效吸收与转运磷素。 适于 PEPC、 AcPh等酶蛋白 ,以及质膜转运蛋白等的大量合成 ,
其相应 m RNA的合成量剧增 ,对 PO3-4 的需求量增加。因此 ,低磷胁迫下组织内 AcPh活性
的加强对于增强 PO3-4 在体内的流动性和再利用 ,保证低磷胁迫诱导的特异 mRNA的优先
合成 ,充分利用体内有限的磷源可能具有重要意义。
尽管不同附加系之间耐低磷胁迫特性差异显著 ,如 4E与 6E附加系比其背景亲本中国
春表现出明显的耐低磷特性 ,而 5E附加系则显著差于中国春 (待发表 ) ,但低磷胁迫导致的
AcPh同工酶变化却与此无明显的关系。原因可能有两方面: ( 1)植物高效利用土壤磷元素
特性是许多性状的综合表现 ,包括对土壤难溶性磷的活化 ,对低浓度有效磷的吸收 ,磷在体
内的分配、转运及再利用等的代谢过程 ,其中每一过程又包括许多生化代谢过程 ,而根系与
294期 李玉京等:低磷营养胁迫对小麦 -长穗偃麦草附加系酸性磷酸酶同工酶的影响
叶片组织内 AcPh酶带加强或诱导产生新酶带可能主要与有效利用体内有限的磷源有关 ,
而不能全面地反映耐低磷胁迫特性 ; ( 2)改进后的 IEF的分辨率虽然高于常规的淀粉胶、非
变性聚丙烯酰胺胶电泳 ( ND-PAGE)以及 Fast Gel的 IEF等电泳技术 ,但对于分辨极其复
杂的 AcPh同工酶而言 ,仍然不够高。因此 ,有待于通过提高电泳分辨率而深入研究低磷胁
迫下 AcPh同工酶的变化与耐低磷特性的关系。
实验结果还表明 ,低磷胁迫下 AcPh酶带加强或诱导产生的新酶带因植物组织而异。叶
片组织中 ,缺磷胁迫诱导出的至少 1条 AcPh同工酶带主要在低 pH范围内 ,高 pH范围内
的 AcPh同工酶带则与对照无明显差异。根系组织中则与此相反 ,高 pH范围内诱导出至少
3条新酶带 ,而低 pH范围内则主要是酶带的加强。这种组织之间 AcPh同工酶诱导的差异
的生理意义有待于进一步研究。
参　考　文　献
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Influence of Phosphorus Deficiency Stress on Acid
Phosphatase Isozymes in Addition Lines Between Common
Wheat and Agropyron elongatum
Li Yujing
1　 Li Bin1　 Liu Jianzhong1　 Li Jiyun2　 Li Zhensheng1　 Yao Shujiang1
(1 I nstitute of Genetics,Chinese Academy of Sciences, Beijing　100101 ;
　 2Research Center for Eco-environment, Chinese Academy of Sciences)
Abstract　 Using a set o f alien disomic addition lines of Chinese Spring-Agropyron e-
longatum ( 2n= 2x= 14, EE) as materials, the influence of phosphorus deficiency st ress on
acid phosphatase ( AcPh) iso zymes was studied by IEF analysis. The results indicated tha t
AcPh iso zymes signi ficant ly changed ( th e bands o r new induced bands) in both leaf and
root ti ssues under phosphorus deficiency st ress in compa rison wi th that under no rmal
g row th condi tion ( CK) . In leaf tissue, at least 1 band induced by the st ress appeared wi th-
in low pH ranges. In contrast to that , no significant dif ferences appeared in AcPh isozymes
under both CK and the st ress conditions wi thin high pH ranges. How ever, a t least 3 in-
duced bands w ere found wi thin the range of high pH, and only the enhancement o f the
bands w as perfo rmed w ithin the low pH ranges in roo t ti ssue. In addition, the phy siological
signi ficance o f these changes o f AcPh iso zymes under the st ress w as discussed.
Key words　 Alien disomic addi tion lines; Phospho rus deficiency st ress; Acid pho s-
pha tase; Iso zymes; IEF
314期 李玉京等:低磷营养胁迫对小麦 -长穗偃麦草附加系酸性磷酸酶同工酶的影响