全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第5期，2006年10月 871
麝香百合LLGLO1 基因的克隆和表达
吴小萍 席梦利 施季森*
南京林业大学国家林业局和江苏省林木遗传与基因工程重点实验室，南京 210037
提要 用 RACE 方法克隆的麝香百合花发育的 GLOBOSA (GLO)类 B 功能基因 LLGLO1，与其他多种单子叶植物的 GLO
类基因高度同源，且 C 区具有典型的 PI 结构基序。通过 RT-PCR 检测，百合不同组织中的 LLGLO1 基因表达模式与郁金
香的GLO 类基因相似。即主要集中在百合第一、二、三轮花器官中表达，心皮和茎中有微量表达，而且随着心皮的成熟，
其在心皮中的表达量逐渐增加，但在百合叶片中则未检测到LLGLO1 的表达，因此认为LLGLO1 在百合花器官中呈特异
性表达。LLGLO1 在百合第一轮花器官中的表达支持了 van Tunen 对 ABC 模型的修正。
关键词 麝香百合；ABC 模型；GLOBOSA；基因表达
Cloning and Expression of A MADS Box Gene LLGLO1 from Lilium longiflorum
Thunb
WU Xiao-Ping, XI Meng-Li, SHI Ji-Sen*
Key Laboratory of Forestry Genetics and Gene Engineering of State Forestry Administration and Jiangsu Province, Nanjing Forestry
University, Nanjing 210037, China
Abstract A MADS box gene named LLGLO1 was cloned from Lilium longiflorum Thunb by rapid amplifica-
tion of cDNA ends (RACE). LLGLO1 was a B function gene homologous to GLOBOSA (GLO) , which had
high protein sequence homology with GLOBOSA family genes of other monocotyledon plants. It also had PI
motif in the C box region, which was conserved sequence in GLO family gene. The expression of LLGLO1 in
different lily tissues was detected by RT-PCR. It was similar to GLO class gene in Tulip, LLGLO1 mainly
expressed in the first, second and third whorls of flower organ. It supported the modified ABC model by van
Tunen. It was also detected faintly expressed in carpel and stem. The expression of LLGLO1 increased with the
carpel development. There was no expression of LLGLO1 in lily leaf, which lead us to consider the LLGLO1
gene specially expressed in lily flower organ.
Key words Lilium longiflorum Thunb; ABC development model; GLOBOSA; gene expression
收稿 2006-05-23 修定 　2006-08-21
资助 上海科技兴农重点攻关项目[沪农科攻字(2004第1-1号)]。
*通讯作者(E-mail：jshi@njfu.edu.cn, Tel: 025-85428948)。
花由四轮器官组成，从外到内分别为萼片、
花瓣、雄蕊群和雌蕊群；而各个器官的发育形成
是多个基因时空调控的最终表现。关于花发育的
分子机制，Coen和Meyerowitz (1991)根据拟南芥
(Arabidopsis thaliana)和金鱼草(Antirrhinum majus)
中的研究成果，曾提出著名的 ABC 模型。该模型
可综合概括为：花器官发育受 A、B、C 类基因
控制；其中，A 类基因在第一、二轮花器官中
表达， B类基因在第二、三轮花器官中表达，而
C 类基因则在第三、四轮花器官中表达；各类基
因差异表达的模式决定了它们的功能不同，A 类
基因调控花萼形成，A 和 B 类基因共同调控花瓣
形成，B 和 C 类基因共同决定雄蕊形成，而 C 类
基因还负责调控心皮形成；此外，A 类与 C 类基
因的功能相互拮抗(Coen和Meyerowitz 1991)。
百合为百合科百合属多年生球根类单子叶植
物，其花的结构与双子叶的拟南芥花颇有不同。
它有两轮花被，每轮三瓣；内部存在两轮雄蕊，
每轮 3 个；最里面的心皮，具三房。以拟南芥、
金鱼草和矮牵牛(Petunia hybrida)等双子叶植物为
依据的 ABC 模型，并不完全适用于单子叶植物。
为此，van Tunen等(1993)根据郁金香的花发育研
究结果，对 A B C 模型进行了修正：认为 B 类基
因不仅在第二、三轮器官中表达，同时也在第一
轮中表达，因而第一轮和第二轮器官有类似的结
构，所以这两轮器官统称之为花被。但 Park 等
植物生理学通讯 第42卷 第5期，2006年10月872
(2004)在研究同属单子叶植物的芦笋(Asparagus
officinalis L.)时发现，虽然具有花被结构，但其
B 类基因并不在第一轮器官中表达，这与 v a n
Tunen 等(1993)修正的 ABC 模型不相符。在百合
花发育过程中，B 类基因的表达模式是怎样的
呢？对此，本文以麝香百合(Lilium longiflorum
Thunb)为材料，分离和克隆 GLO 类 B 功能基因
LLGLO1，并对其在各轮花器官中的表达模式作
了检测。
材料与方法
麝香百合(Lilium longiflorum Thunb)品种‘富
田’和‘雷山’。以其未开放的花蕾为材料，
花蕾大小为 1~3 cm。
百合的总 RNA 用 SDS 方法(Zhou 等 1999)提
取。R N A 的完整性用凝胶电泳检测；用紫外分
光光度计测定波长 260 nm 的 OD 值和 OD260/OD280
的比值，检测总 R N A 的浓度和纯度。
克隆百合 LLG L O 1 基因时，以总 RN A 为模
板，Oligo (dT)17为引物，在Superscript II反转
录酶(Invitrogen公司)作用下合成cDNA第一链。
根据兰花、水稻、玉米、风信子等的 G L O 基因
序列保守区段，设计了2条兼并引物：PDF1, 5
T G T G T T G T C G A C G A T G G G N A G A G G A A A A /
GATNGAG 3； PDR4，5 CCG/TA/GTCA/GATCTCA/
T/CCA/GCTCAG 3。PCR反应程序为：95℃ 2 min；
94℃ 1 min，48℃ 1 min，68℃ 1 min，5个循环；
94℃ 1 min，53℃ 1 min，68℃ 1 min，25个循
环；68℃ 5 min。4℃保存。反应体系为：1×PCR
缓冲液、1 mmol·L-1 MgSO4、0.3 mmol·L-1 dNTPs、
0.3 mmol·L-1 引物、1 mg cDNA 第一链、0.5 U
Taq DNA酶(Invitrogen 公司) ，总体积为50 mL。
PCR产物切胶回收(用大连宝生物公司的凝胶回收
纯化试剂盒)。回收的产物连到 pGEM-T Easy 载
体(Promega 公司)，转化 DH5a 大肠杆菌，蓝白
斑筛选，挑取白斑酶切验证，并测定插入片段的
序 列 。
将测序的结果在 NCBI 上比对，确定与 B 类
基因相似后，再根据此序列设计特异的引物，进
行 5 RACE 和 3 RACE，获得全长 cDNA。所用
RACE试剂盒是Invitrogen公司GeneRacer Kit。5
RACE 特异引物 RGSP：5 TGGGATCCCAGATC-
TTCTTGCCGCA 3，3 RACE 特异引物 FGSP：
5 TCCACCTCTCTACCGAAGATCCTTGA 3。具
体过程参见GeneRacer Kit说明书。序列的拼接、
分析和同源性比对用 D N A M A N 软件完成。
分析组织表达的特异性时，用半定量的 RT-
PCR 方法分析百合花器官中 LLGLO1 基因组织表
达的差异性。分别提取百合叶、茎、外轮花被、
内轮花被、雄蕊和雌蕊的总 RNA。以组成型表达
的 ACTIN 基因的 RT-PCR 扩增产物为总 RNA 模板
定量的内标。ACTIN 的特异引物为：ACT1，5
AT GAA GAT TAA GGT CGT GGC A 3 ；ACT 2，5
TCCGAGTTTGAAGAGGCTAC 3。RT-PCR 扩增
条件为：94℃ 2 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃
1 min，25 个循环；72℃ 5 min。4℃保存。百
合 LLGLO1 基因特异引物为：LF，5 ATGGGCC-
G C G G C A A G A T C G A 3 ；L R，5 G G C T G G -
ATTGGCTGCACACGAAAG 3 。RT-PCR 扩增条
件是：94℃ 2 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃
1 min，分别 20、25、30 个循环；72℃ 5 min。
4℃保存。扩增产物经 1 % 琼脂糖凝胶电泳分离
后，根据扩增产物的荧光强度，即可粗略定量分
析 LLGLO1 组织表达的差异性。
实验结果
1 总 RNA的提取和质量检测
1 % 琼脂糖电泳检测总 R N A，由图 1 可见，
总RNA 没有降解，28S、18S、5.8S 都清晰可见，
28S 荧光亮度约是18S 的 2倍。并且，OD260/OD280
的比值为 2.1 5，说明总 RNA 纯度高，杂质少。
图1 百合的总RNA琼脂糖凝胶电泳
Fig.1 Agrose gel electrophoresis of total RNA of lily
2 LLGLO1 基因的克隆
以 cDNA 第一链为模板，用兼并引物 PDF 1
和 PDR4 扩增，得到预期 260 bp 左右的片段(图
2)。经凝胶回收纯化后插入 pGEM-T Easy 载体，
植物生理学通讯 第42卷 第5期，2006年10月 873
转化大肠杆菌 D H 5 a，从中挑选白斑，抽提质
粒，并进行 EcoRI 酶切鉴定，挑选 2 个克隆子测
序。测序结果在 NCBI 上进行 BLAST 分析的结果
表明，其与水稻、玉米、郁金香等的 G L O 类基
因同源性较高，初步确定该片段属 B 类基因中的
G L O 亚类群。
根据此段序列设计特异性引物 F G S P 和
RGSP，按照Invitrogen公司的GeneRacer Kit进行
3 RACE和 5 RACE。3 RACE产物约750 bp (图
3)，5 RACE产物约 300 bp (图 4)，割胶纯化目
的片段并与载体连接，转化大肠杆菌 DH5a，得
到的克隆子进行测序鉴定。最终获得一全长
cDNA 序列 LLGLO1，长 804 bp，在 GenBank 中
的登录号为 DQ437527。
3 LLGLO1 序列分析
用 DNAMAN 生物软件将 LLGLO1 cDNA 序列
翻译成蛋白质序列，LLGLO1 cDNA 全长 804 bp，
包括210个氨基酸的阅读框(ORF)区和159 bp 的3
非翻译区及13 bp 的 5非翻译区。BLAST分析的
结果表明，LLGLO1 cDNA 与多种单子叶植物的
GLO 类基因同源性较高。其中 LLGLO1 蛋白质序
列与拟南芥的PI (GenBank D30807)、玉米ZMM18
(GenBank AJ292960)、水稻 OSMADS2 (GenBank
L37526)、风信子HPI1 (GenBank AF134114)、兰
花 ORCPI (GenBank AB094985)和郁金香 TGGLO
(GenBank AB094967)的 GLO类蛋白质序列相似性
分别为 50.91%、64.55%、64.55%、60.09%、
72.73% 和 80.57%。通过多重比对分析，表明
LLGLO1 蛋白具有典型的 MIKC 结构，在 C 区还
具有 PI 结构基序，即 MPFxFRVPxQPNLQE (图
5)。此外，LLGLO1 还与 Winter 等(2002)报道的
王百合 LRGLOA (GenBank AB071379)的 cDNA 序
列相似性高达 97.83%，仅有 12 个碱基的变异，
并主要是嘧啶和嘌呤的颠换(资料未列出); 对于编
码区的蛋白序列则更是高达99.52%的相似性，唯
有 190 位的氨基酸发生了替换(图 5 中箭头所示
处)。用系统重建的方法构建了 LLGLO1 和其他物
种中已知的 B 类 M A D S b o x 基因系统发生树，
LLGLO1 包含在 GLO 亚类群中(图 6)。
4 LLGLO1 基因在百合不同组织中的差异性表达
根据LLGLO1 cDNA序列中保守性相对较低的
C 区设计一对引物，以百合不同组织的 RNA 为模
板进行 RT-PCR 半定量分析的结果显示，该基因
主要集中在百合内、外轮花被及雄蕊中表达，心
皮和茎中有微量的表达而叶片中不表达(图7)。而
作为对照的 ACTIN 基因则在百合不同组织中表达
量比较一致(图7-d)。从图7-a中可以看出，经过
20 个扩增循环数后，只在外、内轮花被，雄蕊
和花蕾中有 LLGLO1 扩增产物；当 25 个循环后，
茎与发育早期的心皮扩增条带亮度相当，而发育
晚期的心皮则比早期的要亮得多(图7-b)。由此提
示 LLGLO1 在心皮中表达量是随着其发育的成熟
而逐步升高的。本文结果与经典的 ABC 模型并不
完全符合，而经典模型认为 B 类基因只在花瓣和
图2 兼并引物PDF1和PDR4扩增出目的条带(箭头所示)
Fig.2 PCR product by primer PDF1 and PDR4
M: DNA 分子量标记; 1~7: PCR 产物。
图3 LLGLO1 基因的3 RACE 产物(箭头所示)
Fig.3 3 RACE product of LLGLO1
M: DNA 分子量标记; 1~4: 3 RACE PCR 产物。
图4 LLGLO1 基因的5 RACE产物(箭头所示)
Fig.4 5 RACE product of LLGLO1
M: DNA 分子量标记; 1~5: 5 RACE PCR 产物。
植物生理学通讯 第42卷 第5期，2006年10月874
雄蕊中表达。为了排除交叉污染，在所有实验中
我们对材料严格控制，并且完全独立重复 3 次，
所得到的结果完全一样。可见百合 B 类基因
LLGLO1不同于拟南芥等模式植物B类基因的表达
图5 LLGLO1蛋白质序列多重比对
Fig.5 The multiple alignment of protein sequence of LLGLO1
　　P I ：拟南芥；Z M M 1 8 ：玉米；O S M A D S 2 ：水稻；H P I 1 ：风信子；O R C P I ：兰花；T G G L O ：郁金香；L R G L O A ：
岷江百合；L L G L O 1：麝香百合。图中的实线黑框为 M A D S b o x 区，长虚线框为 K 区，点虚线框为 P I 结构基序。
植物生理学通讯 第42卷 第5期，2006年10月 875
图7 LLGLO1基因在百合不同组织中表达的RT-PCR检测
Fig.7 RT-PCR detection of LLGLO1
expression in different tissues of lily
　　a：扩增条件为 20 个循环；b：扩增条件为 25 个循环；
c：扩增条件为 30 个循环；d：AC T I N R T - P C R。1：外轮
花被；2 ：内轮花被；3 ：雄蕊；4 ：心皮( 花发育的第七阶
段前)；5：心皮(花发育的第七阶段后)；6：叶片；7：茎；
8 ：花蕾；M ：D N A 分子量标记。
模式：LL G L O 1 在花发育的早期主要集中在内、
外轮花被及雄蕊中表达；当花慢慢成熟时，该基
因的表达区域逐渐扩展到雌蕊中。LLGLO1 基因
在百合最外轮花器官(第一轮)中表达，这与 van
Tunen 等(1993)修正的 ABC 发育模型是相似的。
讨　　论
随着应用模式生物研究生命现象工作的深
入，发现了在生物体“编程式”发育过程中起
调节作用的同源异型基因，此类基因都含有高度
保守的同源异型盒(孟征和许智宏1997)。对开花
植物而言，MADS box 就是调节花器官发育的同
源异型盒。同源基因具有高度保守序列的特点，
使得我们可以很容易借助模式生物的基因组信息来
克隆其他物种中的同类基因。因此，克隆我们感
兴趣植物的花器官发育相关基因，可以根据
MADS box 盒提供的保守序列信息进行。本文克
隆的 LLGLO1 就是一个采用水稻、拟南芥等模式
植物的基因信息成功进行同源基因克隆的实例。
GLO 类同源基因在不同植物中表达的时间和
空间不同。在拟南芥中，花发育到第三阶段时，
图6 系统重建构建几种植物的GLO类基因系统树
Fig.6 Phylogeny reconstruction of plant MADS box genes which belong to the GLO subfamily
植物生理学通讯 第42卷 第5期，2006年10月876
PI基因主要在花瓣(第二轮)和雄蕊原基(第三轮)中
表达，心皮原基(第四轮)中也有少量表达；但进
入花发育的第六阶段时，PI基因只在花瓣、雄蕊
原基中表达(Krizek和Fletcher 2005)。金鱼草的
GLO 基因与拟南芥的PI基因表达模式相似，在花
瓣和雄蕊原基中表达，在心皮原基中也有少量表
达(Krizek和Fletcher 2005)。并且，单子叶植物
玉米(Munster等2001)、水稻(Chung等1995)的GLO
同源基因表达模式与拟南芥、金鱼草也极为相
似。但郁金香 TGGLO 的表达模式则与上述植物的
GLO类同源基因都不同，它不仅在内轮花被(第二
轮)和雄蕊(第三轮)中表达，在外轮花被(第一轮)
中也有较高水平的表达，同时在心皮、苞片、叶
和茎中有低量表达(Kanno等2003)。此种表达模式
解释了郁金香花被形成的原因，并支持了 v a n
Tunen 等(1993)修正的 ABC 模型。本文所克隆的
百合 LLGLO1 与郁金香的 TGGLO 基因表达模式相
似，也主要集中在第一、二、三轮器官中表达，
而且表达量相当高。Tzeng和Yang (2001)在研究
麝香百合另一种 B 类基因 L M A D S 1 时，发现
LMADS1 在第一、二、三轮器官中均有表达，只
是在第一轮器官的表达量低于其他两轮。因此百
合花被的形成与郁金香花被形成的原因相同，主
要是 B 类基因表达区域延伸到第一轮花器官中所
致。因此，该实例也支持了van Tunen 等(1993)
对 ABC 模型的修正。LLGLO1 在茎和心皮中也有
微量表达，在叶片中则不表达；另外还有一种有
趣的现象，即当心皮逐渐成熟时 LLGLO1 在其中
的表达量有增加的趋势。除了拟南芥的 AP3 基因
在花发育后期的胚珠及珠被中有表达，此现象在
其它植物中还未发现。为何 LLGLO1 可在百合心
皮和茎中表达呢？其具体原因还不清楚，尚待进
一步探讨。
参考文献
孟征, 许智宏(1997). 高等植物的同源异型基因. 植物生理学通
讯, 33 (3): 233~239
Chung YY, Kim SR, Kang HG, Noh YS, Park MC, Finkel D, An G
(1995). Characterization of two rice MADS box genes ho-
mologous to GLOBOSA. Plant Sci, 109: 45~46
Coen ES, Meyerowitz EM (1991). The war of the whorls: genetic
interactions controlling flower development. Nature, 353:
31~37
Kanno A, Saeki H, Kameya T, Saedler H, Theissen G (2003).
Heterotopic expression of class B floral homeotic genes
supports a modified ABC model for tulip (Tulipa gesneriana).
Plant Mol Biol, 52: 831~841
Krizek BA, Fletcher JC (2005). Molecular mechanisms of flower
development: an armchair guide. Nature Rev Genet, 6:
688~698
Munster T, Wingen LU, Faigl W, Werth S, Saedler H, Theissen G
(2001). Characterization of three GLOBOSA-like MADS-
box genes from maize: evidence for ancient paralogy in one
class of floral homeotic B-function genes of grasses. Gene,
262: 1~13
Park JH, Ishikawa Y, Ochiai T, Kanno A, Kameya T (2004). Two
GLOBOSA-like genes are expressed in second and third whorls
of homochlamydeous flowers in Asparagus officinalis L..
Plant Cell Physiol, 45 (3): 325~332
van Tunen AJ, Eikelboom W, Angenent GC (1993). Floral orga-
nogenesis in Tulipa. Flowering Newsl, 16: 33~38
Tzeng TY, Yang CH (2001). A MADS box gene from lily (Lilium
longiflorum) is sufficient to generate dominate negative
mutation by interacting with PISTILLATA (PI) in
Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol, 42 (10): 1156~
1168
Winter KU, Weiser C, Kaufmann K, Bohne A, Kirchner C, Kanno
A, Saedler H, Theiben G (2002). Evolution of class B floral
homeotic proteins: obligate heterodimerization originated
from homodimerization. Mol Biol Evol, 19 (5): 587~
596
Zhou JH, Pesacreta TC, Brown RC (1999). RNA isolation with-
out gel formation from oligosaccharide rich onion epidermis.
Plant Mol Biol Rep, 17: 397~407