全 文 ：分子植物育种，2011年，第 9卷，第 4期，第 514-518页
Molecular Plant Breeding, 2011, Vol.9, No.4, 514-518
技术主题
Upgraded Feature
麝香百合花蕾组织原位杂交体系的建立
席梦利 * 潘梅 * 施季森 **
南京林业大学,林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室,南京, 210037
*同等贡献作者
**通讯作者, jsh@njfu.edu.cn
摘 要 本研究以麝香百合未开放的花蕾为实验材料，以百合花发育相关的 B功能基因 LLGLO1的特异片
段为探针，研究了花蕾切离时间对 RNA结构完整性的影响，探讨了蛋白酶 K消化浓度及时间对材料内蛋白
质消化及材料结构完整性的影响。研究结果表明：花蕾离体 1.5 h内 RNA仍然保存完整，花蕾离体 2 h RNA
开始降解，因此，花蕾取材后应在 1.5 h之内完成固定。10 μg/mL的蛋白酶 K在 37℃孵育 30 min可消化百合
花蕾切片中的大部分蛋白质且材料结构完整。原位杂交结果显示 LLGLO1基因在四轮花器官中均有表达。
关键词 麝香百合,花蕾,原位杂交,蛋白酶 K, LLGLO1基因
A In S itu Hybridization Experiment System for the Floral Buds of Lilium
longiflorum
Xi Mengli * Pan Mei * Shi Jisen **
Key Laboratory of Forest Genetics and Biotechnology Ministry of Education, Nanjing Forestry University, Nanjing, 210037
* These authors contributed equally to this paper
** Corresponding author, jsh@njfu.edu.cn
DOI: 10.3969/mpb.009.000514
Abstract Using the floral buds of Lilium longiflorum as materials and the special sequence of LLGLO1 gene as
probe, we studied the effect of sampling time on the RNA structure of the floral buds. We observed the influence
of proteinase K concentration and time on protein and structural integrity of tissue structure. The results indicated
that RNA of 1.5 h sample remained intact, but RNA of 2 h sample began to degrade. Therefore, samples should be
fixed the within 1.5 h. Proteinase K of 10 μg/mL can be used to incubate for 30 min at 37℃ to digest most of the
protein of the floral buds. The in situ hybridization result indicated that LLGLO1 gene was expressed in four whorls
of floral-organ in Lilium longiflorum.
Keywords Lilium longiflorum, Floral bud, In situ hybridization, Proteinase K, LLGLO1 gene
基金项目：本研究由江苏省高校重大基础研究项目(07KJA210019)和国家自然科学基金项目(30972407)共同资助
原位杂交技术(in situ hybridization)是由 Gall和
Pardue两位科学家于 1969年创立的(Gall and Pardue,
1969)，是分子生物学和组织化学、细胞学结合的产物
(John et al., 1969; Buongiorno-nardelli and Amaldi,
1970)。该技术经过四十多年的发展和完善，现已广泛
应用于生物科学的许多研究领域。已成为一种在细
胞水平上研究基因表达调控最直接有效的分子生物
学技术(陈绍荣和杨弘远, 2000)。根据其所用探针及
所要检测核酸的不同可分为 DNA-DNA、RNA-DNA、
RNA-RNA原位杂交(王如平和马玉银, 2008,江苏农
业科学, (5): 75-77, 95)。RNA-RNA原位杂交技术以
其 RNA探针的标记效率高、通透性强、结合稳定、杂
交信号强等优势，已被广泛应用于植物和动物组织
的基因时空表达研究(Koltunow et al., 1990)。Coen等
通过原位杂交发现，调控金鱼草花序与花芽转型分
生组织的 flo基因，短暂地表达于花芽发育的很早时
期(Coen et al., 1990)。高雅君和杨玉荣通过原位杂交
检测了 lin-4基因在野生型和突变体中的区域性表
达(高雅君和杨玉荣, 2007)。高雪梅用原位杂交的方
法检测了钙调素基因在花器官中的时空表达模式(高
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
雪梅, 2005)。
原位杂交技术实验周期比较长，实验程序也比
较繁杂，实验步骤主要包括：探针标记、组织固定、包
埋、切片、粘片、脱蜡、蛋白酶消化、乙酰化、预杂交、
杂交、洗片、免疫检测、封片、观察拍照等步骤(刘宏
等, 2006)。蛋白酶消化是整个组织原位杂交中最关
键的步骤，蛋白酶 K是一种比较有效的去除杂蛋白
的强力酶制剂(Cox et al., 1984)。该步骤不仅要消化
RNA上结合的蛋白质和细胞膜上部分蛋白质以增
加探针渗透入细胞和靶序列互补结合的效率，而且
又不能破坏组织的完整性。因此，在原位杂交中蛋白
酶 K是用于消化蛋白质的关键步骤，其浓度及孵育
时间因组织种类、应用固定剂种类、切片的厚度而不
同(刘宏等, 2006)。本研究以麝香百合品种‘雷山’的
花蕾为材料，以本研究组吴小萍等克隆的百合花发
育相关的 B功能基因 LLGLO1特异片段为探针(吴
小萍等, 2006a; Wu et al., 2010)，对离体花蕾冰浴时
间及蛋白酶 K的消化条件进行了探索，建立了麝香
百合花蕾组织原位杂交体系，为进一步研究该基因
在麝香百合花蕾中的时空表达奠定了基础。
1结果与分析
1.1离体花蕾冰浴时间对 RNA的影响
采用改进的 SDS法提取不同离体时间的百合
花蕾总 RNA (吴小萍等, 2006b)，研究 RNA 在百合
花蕾中的降解速度，为整个实验的取材速度提供了
依据。提取的总 RNA在 1%琼脂糖凝胶中的电泳结
果如图 1所示，离体 30 min、1 h、1.5 h的花蕾 RNA
保存完整，28S、18S、5.8S条带均清晰可见，并且 28S
的荧光亮度是 18S的两倍；离体 2 h的花蕾 RNA开
始降解，28S和 18S出现拖带。因此，为保证花蕾中
RNA的结构完整性，花蕾应在切离 1.5 h之内开始
固定处理。
图 1不同材料的总 RNA电泳图
注:放置时间: 1: 30 min; 2: 1 h; 3: 1.5 h; 4: 2 h
Figure 1 1% agarose gel electrophoresis of total RNA from
different sample
Note: Represented time: 1: 30 min; 2: 1 h; 3: 1.5 h; 4: 2 h
1.2蛋白酶 K浓度
切片在不同浓度蛋白酶 K 溶液中，37℃消化
30 min，显色结果表明，随着蛋白酶 K浓度的升高，
组织细胞内的蛋白质含量减少(图 2)。在 1 μg/mL蛋
图 2蛋白酶 K消化浓度的比较
注: A1~A3: 对照; 蛋白酶 K 浓度: B1~B3: 1 μg/mL; C1~C3:
10 μg/mL; D1~D3: 20 μg/mL; E1~E3: 40 μg/mL; F1~F3:
60 μg/mL; G1~G3: 80 μg/Ml; te:瓣状被片; st:雄蕊; ca:心皮
Figure 2 The comparison of digesting by proteinase K which
have different concentration
Note: A1~A3: Control; Concentration of proteinase K: B1~B3:
1μg/mL;C1~C3: 10μg/mL;D1~D3: 20μg/mL;E1~E3: 40μg/mL;
F1~F3:60μg/mL;G1~G3:80μg/mL;te:Tepal;st:Stamen;ca:Carpel
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麝香百合花蕾组织原位杂交体系的建立
A In Situ Hybridization Experiment System for the Floral Buds of Lilium longiflorum
白酶 K的消化条件下(图 2B)，组织显色程度与对照
(图 2A)几乎没有差别，经 10 μg/mL的蛋白酶 K消化
后(图 2C)，组织的显色略变浅，经 20 μg/mL的蛋白酶
K消化后(图 2D)，组织显色与对照有较大的变化，细
胞质中的蛋白质几乎已经消化完全，只能看到细胞
核中的蛋白质染色，经 40~80 μg/mL的蛋白酶 K消
化后(图 2E; 图 2F; 图 2G)，细胞核中的蛋白染色也
非常少，并且细胞的边缘破碎，说明浓度为 40 μg/mL
的蛋白酶 K在 37℃消化 30 min基本可将组织细胞
内的蛋白质消化完全。然而，本实验的要求是消化
RNA上和细胞膜上少量的蛋白，并且不能破坏组织
的完整性，因而选择较低浓度的蛋白酶 K进行消化。
本实验选择 10 μg/mL的蛋白酶 K进一步对消化时
间进行探索。
1.3蛋白酶 K消化时间
切片在 10 μg/mL的蛋白酶 K溶液中，37℃消化
0~120 min，显色结果表明，随着消化时间的延长，组
织细胞内的蛋白质越来越少(图 3)。在蛋白酶 K溶液
中消化 0~40 min，组织中的蛋白质染色逐渐变浅(图
3A;图 3B;图 3C;图 3D)，消化 40 min之后，细胞质
中的蛋白质基本消化干净，只能看到细胞核中的蛋
白质染色，随着时间的继续增加，细胞核中的染色也
逐渐变浅(图 3E;图3F;图 3G;图 3H)。
1.4原位杂交结果
原位杂交过程中探针需穿过细胞膜进入细胞内
与靶 RNA进行互补配对，只需消化少量的膜蛋白和
RNA结合蛋白，根据以上蛋白酶消化浓度和时间的
探索，本研究原位杂交选用 10 μg/mL 蛋白酶 K，
37℃消化 30 min。原位杂交结果显示(图 4)，切片组
织及细胞结构完整，箭头所示明显的蓝紫色沉淀物
是百合花发育相关的 B功能基因 LLGLO1较强的表
达信号，LLGLO1基因在外花被、内花被、雄蕊及心皮
四轮花器官中均有表达。
2讨论
RNA原位杂交试验周期较长，实验程序比较复
杂，技术要求高，实际操作中遇到的问题较多。
首先，RNA原位杂交需要保证材料 RNA 的完
整性，在操作过程中保持无 RNase环境是保证实验
成功的关键(刘庆法等, 1998)。自然界中 RNA酶广泛
存在且稳定性很高，组织中的 mRNA极易被 RNA
酶污染而降解，从而得出阴性结果。因此为了排除
RNA酶的干扰，从取材、固定、浸蜡、包埋、切片到原
图 3蛋白酶 K消化时间的比较
注 : A1~A3: 对照 ; B1~B3: 10 min; C1~C3: 20 min; D1~D3:
30 min; E1~E3: 40 min; F1~F3: 50 min; G1~G3: 60 min; H1~
H3: 120 min; te:瓣状被片; st:雄蕊; ca:心皮
Figure 3 The comparison of digesting by proteinase K which use
different time
Note: A1~A3: Control; B1~B3: 10 min; C1~C3: 20 min; D1~D3:
30 min; E1~E3: 40 min; F1~F3: 50 min; G1~G3: 60 min; H1~
H3: 120 min; te: Tepal; st: Stamen; ca: Carpel
位杂交一系列过程中，需要做很多工作，包括所有实
验器具、溶液的无 RNA酶处理，操作的规范和小心，
在这众多的操作中，任何一个环节的疏忽都可能造
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分子植物育种
Molecular Plant Breeding
图 4原位杂交结果
注:箭头所示为原位杂交信号; te:瓣状被片; st:雄蕊; ca:心皮
Figure 4 The result of in situ hybridization
Note: The arrows demonstrated in situ hybridization signal; te:
Tepal; st: Stamen; ca: Carpel
成最终实验的失败。杂交后洗涤，加抗体和显色等步
骤无需去 RNA酶处理。
其次，增强组织通透性以利于探针进入细胞。增
强组织通透性有多种方法，如用稀释的酸洗涤、清洗
剂 Triton X-100、某些消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、
蛋白酶 K等处理。最常用的是进行蛋白酶消化处理，
蛋白酶处理不仅可以消化 RNA结合蛋白质暴露出
靶 RNA序列，而且可以消化细胞膜的部分蛋白增
强组织通透性利于探针的穿透，但是，蛋白酶处理不
能过度，否则在之后一系列洗涤步骤中会造成组织
内 mRNA丢失或 RNA-RNA杂交体丢失(刘庆法等,
1998)。因此，蛋白酶处理可以看作是 RNA原位杂交
最关键的步骤，消化程度不够就不能暴露出靶序列或
造成探针不能进入细胞，而消化过度则会破坏组织
结构的完整性或造成 mRNA或杂交信号的丢失，如
何把握好这个度是一个难点。本实验选用 10 μg/mL
蛋白酶 K于杂交前在 37℃孵育 30 min处理组织，取
得了较好的效果。
3材料与方法
3.1实验材料
实验材料为麝香百合杂种系品种‘雷山’的花
蕾，基因探针为本研究组吴小萍等克隆的百合花发
育相关的 B功能基因 LLGLO1的特异片段(吴小萍
等, 2006a; Wu et al., 2010)。
3.2花蕾冰浴时间对 RNA的影响
用手术刀片将花蕾从基部切下，置于冰上，分别
放置 30 min、1 h、1.5 h后进行 RNA提取。RNA提取
方法参考吴小萍等的方法进行(吴小萍等, 2006b)。
3.3 FAA固定材料和石蜡切片
装有 FAA的小瓶置于冰上，将花蕾浸泡于 FAA
固定液中，用抽气泵抽至花蕾沉于固定瓶底，无气
泡。换新鲜固定液，4℃过夜。材料经脱水、透明、浸蜡
及包埋后进行石蜡切片，切片厚度 10 μm。
3.4蛋白酶消化条件
蛋白酶K水溶液的浓度分别为 1μg/mL、10μg/mL、
20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL及 80μg/mL，切片在
37℃消化 30 min，以探讨最佳蛋白酶 K浓度；切片
在 10 μg/mL的蛋白酶 K溶液中分别消化 10 min、
20 min、30 min、40 min、50 min、60 min及 120 min，以
探讨最佳消化时间。
将已切好并粘片过夜的石蜡切片脱蜡复水；切
片浸入蛋白酶 K溶液中，37℃孵育，另将 2片切片浸
入水中作为对照；蛋白酶 K消化后，将切片浸入甘氨
酸 /PBS溶液 2 min，以终止蛋白酶反应；然后将切片
浸入 1 L纯水中，反复漂洗几次，以彻底去除蛋白
酶；考马斯亮蓝染色 15 min，甘油封片，立即拍照。
3.5 RNA探针的制备
通过 NCBI网站搜索多个百合 MADS-box基因
的蛋白序列，通过 DNAMAN软件比对蛋白序列的
同源性。根据比对结果选取同源性较低的区域作为
探针转录的模板。根据 LLGLO1基因序列设计特异
性引物，进行 PCR扩增，获得长 340 bp的片段。切胶
回收目的片段，将目的片段与 pGEM-T Easy Vector
连接并转化大肠杆菌 DH5α，对菌液进行 PCR验证，
将验证后的菌液送金思特公司测序，测序结果与克
隆的 LLGLO1基因序列比对，比对正确的作为制备
探针的转录模板。使用 Roche 公司的 DIG-labeling
Kit标记 RNA探针。
3.6原位杂交
石蜡切片经过脱蜡和复水后，进行蛋白酶处
理、用甘氨酸溶液终止蛋白酶反应，并进行组织再
固定；乙酸酐处理切片，然后洗涤和脱水。脱水后将
玻片平铺于密封的盒中，盒内底层放无水乙醇，严
格保持切片脱水状态，置于 4℃中 3~4 h；然后再将
玻片平铺于湿盒中，盒底加入适量 2×SSC、50%甲
酰胺，湿盒用 parafilm 密封后，恒温箱中 52℃杂交
过夜；杂交后洗去多余探针，经封闭、洗涤、显色、封
片后显微镜下观察拍照，细胞组织中有蓝紫色沉淀
物为阳性反应。
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871-876)
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基金项目更正启事
分子植物育种，2011年，第 9卷，第 3期，第 343页
文章题目：转 IPT基因油菜提高抗蚜虫能力
原基金项目为：
基金项目：本研究由国际科技合作项目(2007DFA31260)、科技部国家科技支撑计划项目(2007BAD59B06)和
科技部国家科技支撑计划项目(2008ZX08010-003)共同资助
更正为：
基金项目：本研究由科技部国际科技合作项目 ( 2007DFA31260 )、科技部国家科技支撑计划项目
(2007BAD59B06)和国家转基因新品种培育重大专项子项目(2008ZX08010-003)共同资助
麝香百合花蕾组织原位杂交体系的建立
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