全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 6期，2007年 12月 1015
大麦铁蛋白基因(HvFer1) cDNA的克隆和表达
牛洪斌 1，尹钧 1,*，邓德志 1，李巧云 1,2，任江萍 1，李永春 1
1河南农业大学农学院，国家小麦工程技术研究中心，郑州 450002；2山西大学生命科学与技术学院，太原 030006
提要：根据玉米铁蛋白 ZmFer1的氨基酸序列，采用同源序列法进行序列拼接和引物设计，RT-PCR扩增获得了 1个源
自二叶期大麦叶片mRNA的大麦铁蛋白基因 cDNA片段，HvFer1 (GenBank登录号为 EF440353)。HvFer1全长 1 023 bp，
5非翻译区 56 bp，3非翻译区 202 bp，开放阅读框编码 254个氨基酸。序列分析表明，此蛋白与已知植物铁蛋白高度同
源，相似性介于 56.7%~83.7%之间，N端具27个氨基酸的信号肽，C端(84~247)具有 1个类似铁蛋白的功能域。RT-PCR
表达谱分析显示，HvFer1在大麦的茎、叶、幼穗和幼根均能表达，茎和幼穗中表达量略高些。此外，HvFer1受 PEG和
盐胁迫的强烈诱导表达，中度铁胁迫也可不同程度地增加HvFer1的表达量。
关键词：大麦；铁蛋白基因；克隆；表达分析
Clone and Expression of HvFer1 cDNA from Barley
NIU Hong-Bin1, YIN Jun1, *, DENG De-Zhi1, LI Qiao-Yun1, 2, REN Jiang-Ping1, LI Yong-Chun1
1National Engineering Research Center for Wheat, College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002,
China; 2 School of Life Science & Technology, Shanxi University, Taiyuan 030006, China
Abstract: Using maize ferritin ZmFer1 (GenBank accession No. CAA58146) amino acid sequence as a query-
ing probe, many highly homologous EST sequences were obtained from GenBank and a putative cDNA se-
quence of barley ferritin was assembled. Futhermore, a barley ferritin gene cDNA, named HvFer1 (GenBank
accession number EF4403530) was cloned. HvFer1 was 1 023 bp in full length, including 5 untranslated region
of 56 bp, 3 untranslated region of 202 bp with Poly A, and an open reading frame (ORF) encoding 254 amino
acid. Sequence analysis indicated that the protein contained characteristic features of typical ferritin iron-
binding regions signature, a ferritin-like diiron domain at the C-terminus. Signal peptide prediction with soft-
ware found that HvFer1 included a 27-residue signal peptide with the cleavage site between glycine and serine.
Homology analysis showed that the deduced amino acid sequence of HvFer1 shared 56.7%~83.7% identity
with ferritins from other plants. Semi-quantity RT-PCR analysis showed that the HvFer1 was expressed univer-
sally in barley stems, leaves, immature spikes and roots. The expression profiling also showed that HvFer1
mRNA was up-regulated by drought, salt and iron in barley seedling.
Key words: barley (Hordeum vulgare); HvFer1 (Hordeum vulgare ferritin1); gene cloning; expression analysis
收稿 2007-06-26 修定 　2007-11-10
资助 国家自然科学基金 (30370877)和河南省科技成果转化
项目(0 63 60 00 00 5)。
* 通讯作者(E-m a i：xmzxyj@1 2 6 .com；T el：0 3 7 1 -
6 3 5 5 8 2 0 3 )。
铁蛋白是一类广泛存在于动植物体内的铁贮
藏结合蛋白(Paolo和 Sonia 2002)。生物体内的铁
蛋白是由24个亚基组成的巨大复合体, 可结合多达
4 500个铁原子(Harrison和Arosio 1996)。植物铁
蛋白广泛存在于前质体和白色质体等非绿色质体
中，主要分布于植物的种子、幼苗和根尖
(Lobreaux和 Briat 1991)，以及豆科植物年幼根瘤
等组织中(Ragland和 Theil 1993)。此外，线粒体、
叶绿体、植物导管细胞、维管形成层、生殖细
胞和衰老细胞中也有铁蛋白的存在(Zancani 等
2004；Briat等 1999)。
铁蛋白能够结合贮藏大量的铁原子，并参与
多种植物逆境胁迫应答反应。其在植物体中的主
要功能之一就是贮存铁原子(Laulhere 和 Br ia t
1993；Briat等 1999)，为植物光合作用和生物固
研究报告 Original Papers
植物生理学通讯 第 43卷 第 6期，2007年 12月1016
氮提供铁源(Paolo和 Sonia 2002；Petit等 2001)。
此外，作为胁迫反应蛋白，铁蛋白广泛参与清除
由于过量铁(Gaymard等 1996；Savino等 1997)、
H2O2 (Balla等 1992)、光抑制(Murgia等 2001)和除
草剂(Arnaud等 2006)等逆境因子诱导产生的活性
氧，缓解活性氧对植物体的危害，以及参与抵制
病原菌侵染(Dellagi等2005)和ABA胁迫应答(Petit
等 2001；Lobreaux等 1993)。
植物铁蛋白由 1 个小的基因家族编码合成
(Petit等 2001)。1991年，Lescure等首次报道获
得大豆铁蛋白编码基因，此后陆续从豇豆(Vigna
sesquipedalis)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine
max)、油菜(Brassica napus)、马铃薯(Solanum
tuberosum)、豌豆(Vicia venosa)、苜蓿 (Medicago
truncatula)(vanWuytswinkel等 1995；习阳等
2003)，以及水稻(Oryza sativa) (International Rice
Genome Sequencing Project 2005) 、加拿大蓬
(Conyza canadensis)(Soos等 2006)和拟南芥
(Arabidopsis thaliana) (Petit等 2001)等植物中克隆
到铁蛋白基因。本文根据已知植物铁蛋白的氨基
酸序列，借助生物信息学技术和 RT-PCR方法从
大麦中获得 1个铁蛋白编码基因 cDNA序列，并
对该基因的时空表达特性和逆境应答模式作了检
测，以期能为深入研究铁蛋白的生物功能和挖掘
优异基因资源建立基础资料。
材料与方法
大麦品种‘豫啤’(Hordeum vulgare subsp.
‘Yupi’)由周口市农科所提供；菌种为本实验室
保存；pBS-T载体由 TIANGENE (北京)公司提
供；各种酶、试剂盒购自 TaKaRa (大连)公司；
所用引物自行设计并由Invitrogen (北京)公司合成。
选取籽粒饱满的大麦种子，以 0.1% HgCl2 表
面消毒 10 min，无菌水充分冲洗后于 25 ℃培养
箱中暗发芽，发芽后选择芽长一致的种子，用
Hoagland营养液置于光照培养箱中水培，温度为
(2 0±1) ℃，每天光照 12 h，光照强度为 300
µmol·m- 2·s-1，相对湿度为 60%。幼苗长至两叶一
心时分别用浓度为 200 mmol·L-1 NaCl、20% 聚乙
二醇(PEG6000)和50 µmol·L-1柠檬酸铁进行胁迫处
理，处理后分 0、4、8、16、32和 64 h取样，
重复3次。所有处理试剂均于处理前加入Hoagland
溶液中，每天更换处理液，以Hoagland培养液培
养的为对照。取样立即于液氮中速冻，再置于-80 ℃
超低温冰箱中保存备用。
RNA 的抽提采用大连宝生物公司的Trizol 试
剂，2 µg 的总 RNA 用于 cDNA 第 1链的合成，
并用 RNase 消化 cDNA 产物。
根据玉米铁蛋白 ZmFer1 (GenBank录用号
CAA58146)的氨基酸序列，采用同源序列法模拟
拼接了 1个大麦铁蛋白基因的 cDNA序列，并根
据此序列设计 P C R 引物 H v F 1 f ： 5
GACCAAATCCCGCTCCCACA 3，HvF1r：5
TTTGACAAGATTAGAGCAGAATA 3。PCR 扩增
条件为 94 ℃ 5 min 预变性后；94 ℃ 30 s，55 ℃
1 min，72 ℃ 2 min，35个循环；最后 72 ℃延
伸 10 min。PCR扩增产物经 1%琼脂糖凝胶检测、
回收目的条带，与 pBST 载体(TIANGENE)连接，
1 6 ℃过夜。连接产物转化至大肠杆菌菌株
JM109，在Xgal/IPTG琼脂糖平板上挑选白色克
隆，由大连宝生公司完成序列测定。采用
Megalign和Clustal×1.83软件进行序列联配和聚类
分析，信号肽预测采用 Signa l P 3 .0 (Pa r k等
2004)。
采用半定量RT-PCR法检测HvFer1的转录表
达水平，所用引物和 PCR反应条件同上述基因克
隆，循环次数降为 28 个。以肌动蛋白基因作为
内部参照，肌动蛋白基因 PCR 引物为：A1：5
GGAACTGGTATGGTCAAGGC 3，A2：5
AGTCTCATGGATAACCGCAG 3，PCR 扩增程序
如下： 94 ℃ 5 min 预变性后；94 ℃ 30 s，56 ℃
40 s，72 ℃ 50 s，共 28个循环；最后 72 ℃延
伸 10 min。
结果与讨论
1 大麦HvFer1基因的cDNA 克隆和序列分析
以玉米ZmFer1的氨基酸序列为信息探针搜索
GenBank数据库，获得许多与之相匹配的大麦
EST，采用软件对高度同源的 EST序列模拟拼
接，获得 1个含有完整编码框的大麦铁蛋白基因
的 cDNA序列HvFer1。根据拼接序列设计引物，
其中正向引物序列产生于序列CK125836，反向引
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物产生于序列 BJ467072，PCR产物测序结果证实
所得序列为目的片段。序列分析显示HvFer1全长
1 023 bp，5非翻译区 56 bp，3非翻译区 202 bp，
包含1个典型的加尾信号AATAAA (图1 阴影处)，
开放阅读框编码 254 个氨基酸，分子量约为 28
k D a。此序列已提交到 G e n B a n k，登录号为
EF440353。
氨基酸序列分析结果显示(图 1)，HvFer1 N
端含有 27个氨基酸的信号肽，C端(84~247)含有
1个类铁蛋白功能域(ferritin-like diiron domain)，
其间(204~224)具有21个氨基酸组成的铁结合序列
(DPQLTDFVESEFLQEQVDAIK)。此外，该蛋白
还存在 4个 N- 豆蔻酰化位点(17~22、21~26、
23~28、33~38和 40~45)，3个酪蛋白激酶 II磷
酸化位点(132~135、133~136、164~167)，以及
1个蛋白激酶 C I磷酸化位点(28~30)，1个N-糖
基化位点(103~106)和 1个 cAMP-cGMP依赖的蛋
白激酶磷酸化位点，表明在HvFer1的生物合成过
程中需要多种翻译后加工修饰作用才能成为具有天
然功能的成熟多肽。
聚类分析显示(图 2)，HvFer1与其他已知植
物来源铁蛋白的氨基酸序列同源性介于56.7%~83.7%
之间，与水稻OsFer1同源性最高(83.7%)，与拟
南芥AtFer1同源性最低(56.7%)，显示出植物铁蛋
白基因的演变发生于单双子叶植物分化的早期。
进一步分析显示，铁蛋白成熟多肽，尤其是功能
域之间高度同源，表明植物铁蛋白基因在遗传进
化过程中具有较高的保守性。
2 HvFer1基因转录表达的时空特异性
组织表达谱分析显示(图 3-a)，在花后 12 d大
麦植株的根、茎、叶中均能检测到相应的目的条
带。其中，茎和未成熟穗部表达量显著高于根和
叶，表明HvFer1在大麦的不同组织中的表达有差
异，具有较强的组织特异性。进一步检测大麦麦
穗成熟期HvFer1基因表达特性的结果显示(图 3-
b)，随着麦穗的发育进程，HvFer1的转录本含量
逐渐增加，花后 5 d表达量达最大值，此后开始
下降，表明HvFer1基因在大麦穗部表达有较强的
时间特异性。
3 逆境胁迫诱导的HvFer1表达
图 4显示：(1) 50 µmol·L-1醋酸铁可以诱导
HvFer1的转录表达，胁迫后 4 h起，此基因表达
水平即高于未作胁迫处理的对照，胁迫 8 h表达
达到高峰，此后一直维持在该水平直至 64 h，并
有延续该水平表达的趋势，由于胁迫处理时采用
中等程度的醋酸铁浓度，图中所示曲线未能反映
出HvFer1基因的完整表达模式，需进一步研究；
(2)在 200 mmol·L-1 NaCl胁迫条件下，大麦幼苗
图 1 大麦铁蛋白HvFer1 cDNA的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列
Fig.1 cDNA and deduced protein sequence of HvFer1
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图 2 大麦HvFer1与其他已知植物铁蛋白基因氨基酸序列相似性的比较
Fig.2 Alignment of full amino acid sequences from HvFer1 and other plant ferritin proteins
图 3 大麦HvFer1转录表达的半定量RT-PCR分析
Fig.3 Semi-quantitative RT-PCR expression analysis of HvFer1 gene from barley
　　a：花后 1 2 d 大麦 H v Fe r 1 转录表达；S P：未成熟穗子；R：根；S：茎；L：叶片；b：大麦麦穗成熟期 H v Fe r 1 转录
表达；1：半穗期穗子(half-heading spikes) ；2：完全抽穗期穗子(fu ll-heading spikes) ；3：花后 5 d穗子；4：花后 12 d穗子。
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叶中HvFer1的表达水平随着胁迫时间的延长而上
升，胁迫 32 h时达到高峰，此后迅速下降；(3)
20% PEG 胁迫条件下HvFer1基因的表达模式与盐
胁迫条件下十分类似，只是表达高峰提前，胁迫
8 h时即达到高峰，此后基因表达量逐渐下降，胁
迫 64 h时已见不到相应的转录本，这可能是胁迫
64 h后大麦植株已经受到严重的破坏，逆境应答
系统崩溃的结果。铁蛋白基因作为应答基因广泛
参与多种逆境胁迫已在多种作物中得到验证，本
文结果显示 HvFer1基因也有上述典型的应答模
式，表明植物铁蛋白功能的保守性。
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图 4 逆境胁迫下大麦幼苗期叶中HvFer1转录
表达的半定量RT-PCR分析
Fig.4 The RT-PCR assay of HvFer1 mRNA in barley
seedlings under iron citrate, NaCl or PEG6000 stress