全 文 ：植物生理学通讯 第43卷 第1期，2007年2月 57
小金海棠中三价铁螯合物还原酶基因的表达分析
张芸*，王忆*，许雪峰，李天忠，孔瑾，韩振海**
中国农业大学农学与生物技术学院，北京市果树逆境生理与分子生物学实验室，北京 100094
提要：以从铁高效基因型小金海棠中克隆得到的三价铁螯合物还原酶基因片段为探针，对小金海棠进行Southern杂交。
结果显示，三价铁螯合物还原酶基因在小金海棠基因组中为单拷贝。Northern杂交结果表明：在根中，三价铁螯合物还
原酶基因的转录受缺铁胁迫诱导，并随缺铁胁迫时间的延长而增强；在叶中，此种基因的转录水平很高，但不受低铁胁
迫诱导。根中的三价铁螯合物还原酶活性随缺铁胁迫的时间进程而不断增强，动态变化与其转录水平的变化趋势一致。
关键词：三价铁螯合物还原酶；基因表达；小金海棠
Expression Analysis of Ferric-Chelate Reductase Gene of Malus xiaojinensis
Cheng et Jiang
ZHANG Yun*, WANG Yi*, XU Xue-Feng, LI Tian-Zhong, KONG Jin, HAN Zhen-Hai**
Stress Physiology and Molecular Biology Laboratory of Fruit Tree, College of Agriculture and Biotechnology, China Agricultural
University, Beijing 100094, China
Abstract: Ferric-chelate reductase gene in Malus xiaojinensis was investigated by blotting hybridization technique.
Southern blot suggested that the genome of M. xiaojinensis had one copy. The transcription of ferric-chelate
reductase gene was induced and strengthened by iron stress in roots, whereas it was no significant difference
by iron stress in leaves. Ferric-chelate reducase activity was similar to its transcription change.
Key words: ferric-chelate reductase; gene expression; Malus xiaojinensis
收稿 2006-09-29 修定 　2007-01-15
资助 国家转基因植物专项(JY04-B-02)。
*共同第一作者。
** 通讯作者(E-mail：rschan@cau.edu.cn；Tel：010-
62736880)。
铁是植物生长发育中必需的营养元素之一。
但由于受土壤pH值的影响，铁在土壤中经常是以
比较稳定的氧化物形态Fe(III)存在，其在水中的
溶解度非常低，因此能为植物吸收利用的铁只占
很小的比例。一般来说，植物生长所需要的最适
铁浓度为10-9~10-4 mol·L-1，但在碱性土壤(pH 7.4~
8.5)中，可溶性铁的浓度只有10-10 mol·L-1 (Guerinot
和 Yi 1994)，因而植物表现出缺铁失绿症，给农
业生产造成极大的损失。为了应对缺铁胁迫对植
物自身生长的影响，高等植物在长期进化过程中
逐渐形成了不同的适应性机制(Staiger 2002)。
Romheld和Marschner (1986)在总结前人研究工作
以及对120种来源不同植物缺铁反应机制的研究基
础上，提出高等植物适应缺铁胁迫的铁素吸收机
制I和机制 II 系统。最近的研究表明，2种机制
系统植物并没有严格的界限，Bughio等(2002)从
禾本科植物水稻中克隆出Fe(II)载体蛋白相关基因
IsIRT1，证明水稻中存在机制 I 系统；Curie 等
(2001)也从拟南芥中发现了与玉米Fe(III)载体YS1
同族的相关基因。随着研究的深入，后来又发现
可能还存在机制III系统(Mori 1999)。虽然植物各
自有一套吸收铁的机制，但根据植物类型的不
同，它们之间对缺铁的耐受力也有很大差异。有
研究表明，苹果砧木小金海棠是铁高效基因型苹
果种，深入探索其高效抗缺铁机制对解决生产中
的缺铁黄叶病很重要(韩振海和许雪峰1995)。许
多研究中均发现植物根部存在一种特异的三价铁螯
合物还原酶，能将土壤中的三价铁还原为二价铁
(Bienfait 1985；Guerinot和Yi 1994)，因而植物
吸收利用铁的效率得以增加。通过对小金海棠三
价铁螯合物还原酶基因的转录表达情况研究，探
索分析其受缺铁诱导的时空表达特异性，以及今
后与其他不耐缺铁胁迫苹果砧木基因表达情况相比
较，对深入研究小金海棠高效抗缺铁胁迫的分子
制来说是重要的。
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材料与方法
将小金海棠(Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)
生根组培苗转移到营养液中进行培养，长到 5~6
片真叶时进行缺铁胁迫(4 mmol·L-1 EDTA-Fe2+)和正
常供铁(40 mmol·L-1 EDTA-Fe2+)处理，其他元素与
完全营养液相同(Hoagland营养液，初始pH值用
1.0 mol·L-1 KOH调至6.0)。
提取小金海棠根系总RNA (刘彦华1999)，用
RQI RNase Free DNase 除去混合在 RNA 中的
DNA，以电泳及紫外分光光度计检测其完整性和
纯度。根据GenBank 中三价铁螯合物还原酶基因
氨基酸保守序列设计简并引物，以总 RNA 的反转
录产物为模板进行 RT-PCR 扩增。
提取叶中DNA分别进行EcoRI和HindIII (上
海生工有限公司)单酶切后电泳转膜。处理后不同
天数(1、3、5、7 d)分别提取叶片和根系的总
RNA 进行等量甲醛变性胶电泳和转膜，具体步骤
参考分子克隆实验指南(Sambrook 等 1989)。
提取含有小金海棠三价铁螯合物还原酶基因
片段菌株的质粒，以EcoRI和 PstI进行双酶切并
回收，参照随机引物标记试剂盒(博大泰克公司)
说明书制备[a-32P]dCTP(亚辉生物公司)标记的探
针，进行Southern 和 Northern 杂交。
定量和定性测定三价铁螯合物还原酶活性
时，将待测植株的根系放入饱和 CaSO4 溶液中浸
泡 5 min，以去离子水冲洗干净后，将每一处理
的3株植株根系置于60 mL 0.1 mmol·L-1 Fe(III)-
EDTA和0.4 mmol·L-1 2,2-联吡啶、不含Fe(II)的
营养液中。光照下连续通气，反应2 h。结束后，
取反应液于波长520 nm处比色(宋亚娜等1999)。
将含有0.25 g琼脂、50 mL正常浓度的缺铁
营养液和 39 mL 去离子水的混合液加热煮沸，并
充分搅拌混匀后，冷却到50 ℃左右，加入1 mL
10 mmol·L-1 Fe-EDTA、10 mL 5 mmol·L-1 Ferro-
zine，调节 pH至 6.0。将活体根系在饱和硫酸钙
溶液中浸洗 3~5 min，再用去离子水洗 3~4 次，
然后将根系平铺在平皿内，倒入琼脂 - 指示剂，
黑暗中显色30~90 min 后观察根系周围的颜色变
化 。
实验结果
1 小金海棠三价铁螯合物还原酶基因片段的获得
如图 1 所示，小金海棠总 RNA 中 18 S 和 28
S 泳带清晰，并未出现降解，检测后证明其符合
作为反转录模板的要求。设计引物 P1：G A T C -
G G T A C C T T C G G T T T C T T C A T，P 2：T G G G C C -
T T A A G G A C C T T C C A C T G A，以总 RN A 反转录产
物为模板进行PCR扩增，得到300 bp的单一特异
性条带(图 2)。将 PCR 产物纯化回收后与 pMD18-
T载体连接，转化大肠杆菌(Escherichia coli)，挑
选阳性克隆进行测序。测序结果在 GenBank 中进
行 Blast 分析，发现该片段与豌豆、苜蓿和番茄
中已知的三价铁螯合物还原酶基因同源性达到
80% 以上，结果显示扩增出的 cDNA 片段为小金
海棠三价铁螯合物还原酶家族的基因片段。
图1 小金海棠总RNA
Fig.1 The total RNA of M. xiaojinensis
图2 小金海棠三价铁螯合物还原酶基因片段RT-PCR
Fig.2 RT-PCR for ferric-chelate reductase gene
of M. xiaojinensis
1：DNA marker (DL2000); 2: RT-PCR产物。
2 小金海棠三价铁螯合物还原酶基因的Southern
杂交
基因组 DNA 进行充分酶切后电泳产生均匀的
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弥散条带，转膜进行Southern杂交。由图3可以
看出，2 种单酶切均明显有唯一的杂交信号，由
此推测三价铁螯合物还原酶在小金海棠基因组中是
以单拷贝存在的。
3 小金海棠三价铁螯合物还原酶基因的Northern
杂交
分别提取正常供铁和缺铁生长 1、3、5 和 7
d的小金海棠根系和叶片中总RNA (图4-c)，等量
甲醛变性胶电泳后转膜后进行Northern杂交的结
果表明：无论是在正常供铁还是在缺铁条件下，
此种基因在小金海棠根系和叶片中均得以转录；
与正常供铁处理相比，此种基因在根中缺铁第 3
天表达开始加强，随着处理时间的增加而不断加
强(图4-a)，而在叶片中表达无显著增加(图4-b)。
这说明在小金海棠中，此种基因在根中的转录受
缺铁胁迫诱导，并随着缺铁胁迫处理天数的增加
而加强，但 7 d 以内在植株叶中的转录基本上不
受缺铁胁迫的诱导。
4 小金海棠三价铁螯合物还原酶的活性变化
小金海棠根系三价铁螯合物还原酶活性的定
性试验结果表明，正常供铁小金海棠根系出现非
常微弱的浅红色，而在缺铁 1 周时根系却出现了
紫红色，其范围和颜色明显强于正常供铁小金海
棠，结果显示缺铁胁迫可增强小金海棠根部三价
铁螯合物还原酶的活性(图未示)。
从图5中可以看出，缺铁(4 mmol·L-1 Fe2+)与
正常供铁(40 mmol·L-1 Fe2＋)的小金海棠根中三价铁
螯合物还原酶活性变化之间有明显差异。在正常
供铁条件下，小金海棠根中三价铁螯合物还原酶
活性始终保持在较低水平上[约75.84 nmol·g-1 (FW)·
h-1]。而在缺铁时，从处理的第 3 天起根中三价
铁螯合物还原酶活性不断增强，在处理后第 7 天
达到364.69 nmol·g-1 (FW)·h-1，为正常供铁的5.1
倍。根中三价铁螯合物还原酶活性变化动态和此
种基因的转录有相同的变化趋势(图 4-a、图 5)。
讨 论
作为一种膜蛋白的三价铁螯合物还原酶，在
双子叶和非禾本科单子叶植物吸收铁的过程中起关
键作用。此种基因最早是在酵母中发现的(Dancis
等 1990)，近些年在植物中也有发现，并通过功
能互补方法验证了其功能(Eide 等 2002；Li 等
2002)。但在不同植物的不同组织中其表达情况有
图3 小金海棠三价铁螯合物还原酶基因的Southern杂交
Fig.3 Southern blot of ferric-chelate reductase gene
in M. xiaojinensis
1：基因组 DNA 的 EcoRI 酶切；2：基因组 DNA 的 HindIII
酶切。
图5 不同供铁水平下根系三价铁螯合物还原酶的活性变化
Fig.5 The changes of ferric-chelate reducase activity
in roots with different Fe supply
图4 小金海棠三价铁螯合物还原酶基因的Northern杂交
Fig.4 Northern blot of ferric-chelate reductase gene
in M. xiaojinensis
a：根系 Northern 杂交；b：叶片 Northern 杂交；c：
总 R N A 。1 ：缺铁 0 d ；2 ：缺铁 1 d ；3 ：缺铁 3 d ；4 ：
缺铁 5 d；5：缺铁 7 d。
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所不同。如在拟南芥、蚕豆和番茄的根中三价铁
螯合物还原酶基因的转录受缺铁胁迫诱导而加强表
达，但在叶片中三价铁螯合物还原酶的表达情况
差异则很大，在拟南芥叶中表达量非常低
(Robinson等1999)，在蚕豆叶片中可受缺铁胁迫
而诱导表达(Eide等2002)，在番茄叶片中基因表
达不受缺铁胁迫的诱导而表现为高转录水平的组成
型表达(Li等 2004)。本文结果表明：小金海棠三
价铁螯合物还原酶基因在根中受缺铁胁迫的诱导加
强表达，但在叶中的转录则几乎不受缺铁胁迫的
诱导，与番茄中该基因家族基因表达情况相类
似。且随着缺铁处理时间的增加，根中三价铁螯
合物还原酶的活性不断增强，这一变化趋势与此
种基因在转录水平上的变化趋势相吻合。据此我
们认为，在缺铁胁迫下，小金海棠的根是通过提
高三价铁螯合物还原酶的转录水平，翻译出更多
的三价铁螯合物还原酶蛋白，即是通过转录水平
的调控来应对缺铁胁迫的。这些结果支持了
Robinson等(1999)的结论：三价铁螯合物还原酶
活性的调控发生在转录水平上。三价铁螯合物还
原酶将根际中的三价铁还原为二价铁，并转运到
植物内部以满足生长需要。铁在植物体中通常是
以三价铁的形式运输到达地上部后，又通过三价
铁进一步还原为二价铁以供植物生长需要。但是
在叶中三价铁螯合物还原酶的表达未见到明显受缺
铁胁迫诱导，我们推测其原因可能有3个：(1)叶
中有足够的还原能力将经过长距离运输到达叶片的
三价铁还原为二价铁以供叶肉细胞生理生化反应所
需；(2)叶中此种基因的调控不仅限于转录水平，
可能还存在着转录后水平的调节；(3)根部缺铁直
接导致根部基因表达量上升，但植株体内贮藏铁
的二次利用在初期导致叶片受缺铁胁迫可能并不
明显。因此，进一步研究缺铁胁迫下三价铁螯合
物还原酶基因和其他与缺铁相关基因的调控方
式，对于小金海棠高效抗缺铁机制来说是值得考
虑的。
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