全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 3期，2007年 6月 413
农杆菌介导转AtNHX1基因杨树的获得
徐文君 1，刘兆普 1,*，隆小华 1，周玮 2
南京农业大学 1资源与环境科学学院，2生命科学学院，南京 210095
提要：采用根癌农杆菌介导法，将拟南芥Na+/H+逆向转运蛋白(Na+/H+ antiporter)基因(AtNHX1)转入杨树。建立了杨树的
继代及高频再生系统。经抗生素筛选，对再生植株进行PCR检测、PCR产物基因测序和杨树基因组DNA的 Southern检
测，证实已获得 126株转AtNHX1基因的杨树植株。
关键词：转基因杨树；杨树‘尼娃 107’；根癌农杆菌；AtNHX1
Transformation of Populus×euramericana with AtNHX1 Gene Mediated by
Agrobacterium tumefaciens
XU Wen-Jun1, LIU Zhao-Pu1,*, LONG Xiao-Hua1, ZHOU Wei2
1College of Resource and Environmental Sciences; 2College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095,
China
Abstract: Na+/H+ antiporter gene of Arabidopsis thaliana (AtNHX1) was transferred into poplar by Agrobacterium
tumefaciens transferring system. A subculture system and a high frequency regeneration system were established.
126 AtNHX1 transgenic plants were obtained, verified by PCR test, sequencing of PCR product and Southern
blot analysis of genomic DNA of poplar.
Key words: transgenic poplar; Populus×euramericana ‘Neva 107’; Agrobacterium tumefaciens; AtNHX1
1986年Minocha等获得了第1个杨树转基因植
株，十几年来，杨树转基因技术进展很快，已
有近20个杨树种或杂种获得了转基因植株(饶红宇
和黄敏仁1999)。一些重要的目的基因包括抗虫基
因、降低木质素基因、抗除草剂基因等已被转入
杨树(张峰等 2002)，打破了木本植物传统的基因
改良进程，杨树已经成为木本植物在遗传学和分
子生物学方面的模式植物(Massim等 1998)。大量
研究表明，位于植物质膜和液泡膜上的Na+/H+ 逆
向转运蛋白与植物耐盐性密切相关(Blumwald和
Poole 1985；RauschT等 1996；Barkla和 Pantoja
1996)。本研究选用的拟南芥液泡膜上Na+/H+逆向
转运蛋白(Na+/H+ antiporter)基因 AtNHX1，已在许
多植物中转化成功(如番茄、小麦、柠檬、蓝
莓)，但在杨树中还未见报道。本试验采用农杆
菌介导法将 AtNHX1高效表达载体转入杨树，获
得Kan抗性植株，并进行分子检测，以期获得抗
盐性杨树，为盐碱地的利用提供一个可能途径。
材料与方法
实验所用菌种是含 AtNHX1植物双元表达载
体(pBISN1)的根癌农杆菌(LBA4404)，菌种和质粒
均由中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态
研究所张宏霞教授提供，含 AtNHX1植物双元表
达载体(pBISN1)的结构如图 1所示。
酶和生化试剂购自上海英骏生物技术有限
公司。
杨树(美洲黑杨 × 欧美杨)品种‘尼娃 107’
(Populus×euramericana ‘Neva 107’)，是欧美
杨无性系，速生，材质好，抗寒，尤其是抗风
折能力强，采自本校资源与环境学院莱州基地。
收稿 2006-11-13 修定 　2007-04-05
资助 国家支撑项目计划(2006BAD09A04-05 和 2006BAD-
0 9A0 8-0 3-0 1)。
* 通讯作者( E -m a i l：s e a @ n j a u . e d u . c n；T e l：0 2 5 -
8 4 3 9 6 6 7 8 )。
研究报告 Original Papers
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取新鲜采摘的杨树叶片和茎段为外植体消毒
后，置于以MS为基本培养基，添加蔗糖 30 g·L-1，
琼脂 7.5 g·L-1以及不同比例的激素和抗生素的培养
基上，置于 25 ℃培养室，光强 30~40 µmol·m-2·s-1，
光周期 16 h·d-1，3~4周后，根据试管苗的生长情
况筛选最佳培养基，即(1)分化培养基：MS+0.5
mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA；(2)生根培养基：1/2
MS+0.8 mg·L-1 IBA。含 AtNHX1基因的菌液活化
与培养时，在超净台上，从保存在 –70 ℃的菌种
保存管中取少量LBA4404 (具有利福平Rif抗性)农
杆菌菌液，用涂布的方法均匀的涂在含有相应抗
生素[Npt II，卡那霉素(Kan)抗性基因]的固体培养
基YEB (YEB+50 mg·L-1 Kan+50 mg·L-1 Rif )平板
上，28 ℃倒置培养 48 h，挑单菌落到含同样抗
生素的液体YEB培养基(YEB+50 mg·L-1 Kan+50
mg·L-1 Rif )中，180~200 r·min-1振荡过夜培养至
对数生长期，取 1 mL菌液到 20 mL YEB液体培
养基中继续振荡培养 5~6 h，加入 10倍体积MS，
振荡培养至OD600 = 0.5~0.6，作为转化侵染的菌
液备用。
以农杆菌侵染法转化，为了提高转化频率，
首先取生长3~4周的无菌苗茎段切割成5 mm左右
大小，置于分化培养基上预培养 2 d，取出经过
预培养的茎段置于备好的菌液中侵染 13 min，侵
染后用无菌滤纸吸干外植体表面多余的菌液，然
后再次放入分化培养基中，置于暗处，25 ℃共
培养 2~3 d，待出现肉眼可见的菌斑，立即将茎
段转入筛选培养基(MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1
NAA+70 mg·L-1 Kan+500 mg·L-1 Carb)，在 25 ℃、
光强 30~40 µmol·m-2·s-1和光周期 16 h·d-1下培养，
同时以未侵染的茎段作为对照。10 d后，有抗性
芽产生。待抗性芽长到 2 cm高度，将其切割分
开后转入添加了 500 mg·L-1 Carb的生根培养基，
诱导生根。
根据已知 AtNHX1基因的序列用 Primer Pre-
mi e r 5 . 0 软件设计特异引物，上游引物：5 -
TCACCTAAACCACGAAGC-3，下游引物：5-
GACCACCAAATCACAACC-3， 参照SDS法(王关
林和方宏筠2002)，小量提取转化植株和非转化植
株的DNA，以 pBISN1质粒DNA作为对照，进
行 PCR扩增。PCR扩增条件为：94 ℃ 4 min，
1循环；94 ℃ 30 s，55.5 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，
30个循环；72 ℃ 7 min，1个循环。取 PCR产
物 5 µL，1.5%的琼脂糖凝胶电泳，检测是否有
AtNHX1基因片段。
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯
下切下可见条带，利用DNA小量回收试剂盒(上
海华舜生物工程有限公司)，纯化回收 DNA；然
后将纯化产物酶连(5 µL ligation+1 µL T-vector
[pmd-19]+4 µL纯化产物，16 ℃保温 8 h) ；酶连
产物转化到大肠杆菌中，获得大肠杆菌菌液，委
托上海英骏生物技术有限公司进行DNA测序，核
对扩增片断是否与 AtNHX1基因的序列一致(李少
骞 2002)。
随机抽取 3株 PCR阳性植株进行 Southern 杂
交，用BamHI酶切对照植株和PCR阳性植株的基
因组DNA10 µg，在 0.9%琼脂糖凝胶上 50 V缓
慢电泳 10~15 h，转移到 H-bond TM-N+尼龙膜
上，以 32P 为探针，按照《分子克隆实验指南》
方法进行探针杂交和检测。
实验结果
1 杨树继代和高频再生体系的建立
幼苗继代和高频再生系统的建立，是利用
农杆菌介导法基因转化的基础。结果表明，
‘尼娃 107’速生杨的组培生长状况和激素比例
图 1 含 AtNHX1 基因的植物双元表达载体(pBISN1)结构
Fig.1 The construction of binary vector (pBISN1) containing AtNHX1 gene
LB 和 RB：Ti 质粒左右边区；Npt Ⅱ：卡那霉素抗性基因；(Aocs) 3 Pma s Amas：链接在启动子上的 Aocs 三聚体复核物；
At NH X 1：目的基因 N a +/H + 逆向转运蛋白基因；P-no s 和 Po ly A-no s：终止子。
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以及外植体的选择关系密切。叶面积过小，叶
片容易褐化而死，面积过大，叶片主要表现出
膨大的趋势，发黄，变脆，不易吸取培养基中
养分，导致再生芽个数下降，因此从表 1 看，
选择切割 0.1 cm×0.1 cm的叶片比较合适。6-BA
和NAA对再生芽的诱导有明显差异，添加 6-BA，
再生芽比较紧密，不容易褐化，当浓度过高，再
生芽叶片会发红，发脆，叶片狭长；同时添加
NAA，也能够提高诱导率，当浓度过高，生根比
较严重，再生芽变得稀疏，不利于再生芽的诱导。
同样的问题也存在于茎段的分化中(表 1)。所以我
们选用的浓度为 0.5 mg·L-1 6-BA和 0.1 mg·L-1 NAA，
再生芽紧密，长势旺。茎段和叶片分化培养基同
为MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA，但比起
叶片，茎段的再生芽更加紧密，叶面宽而平整，
在之后的高选择压的筛选中能保持良好的生长状
态，所以本实验选取茎段作为遗传转化的最佳外
植体。
2 杨树的转化和植株的再生
本实验所选用的表达载体含有卡那霉素抗性
基因(Npt II)序列，所以我们选用卡那霉素作为筛
选抗性苗试剂。为了确定‘尼娃 107’速生杨对
Kan的本底抗性，将生长一致的无菌苗接种于含
有不同浓度Kan的分化培养基上，2周后观察它们
的生长情况(表 2)，最终确定添加 70 mg·L-1 Kan
的培养基作为筛选培养基。经农杆菌侵染的杨树
茎段，在筛选培养基上，10 d左右出现芽点，开
始分化出芽；而未经侵染的茎段没有芽点出现，
逐渐褐化死亡。待不定芽长到 2 cm高度，将其
切割分开转入含 500 mg·L-1 Carb生根培养基，诱
导生根。生根后转入温室中培养。总共遗传转化
外殖体 227个，产生卡那霉素抗性不定芽 339个，
317个在生根培养基中生根并长大。
3 PCR检测结果
以未转化杨树植株叶片DNA作对照，在检测
的 200株转化再生小苗中，126株呈 PCR阳性(阳
性转化率达 60%以上)，扩增出一条 555 bp DNA
片段，与 AtNHX1基因大小相符，未转化植株没
有条带出现(图 2)，初步说明 AtNHX1基因整合到
杨树基因组中。
4 PCR产物的基因测序
委托生物公司进行 PCR产物基因测序结果，
经过 gene tool软件的比对，与已知的 AtNHX1基
因序列完全一致。
5 Southern杂交
杂交膜通过 Typhoon扫描仪扫描结果见图 3。
未转化植株没有杂交信号，随机抽取的 3株 PCR
阳性植株有明显信号，说明 AtNHX1基因已经整
表 1 不同比例 6-BA 和NAA对不同大小茎段和叶片再生芽形成的影响
Table 1 Effects of different proportion between 6-BA and NAA on regeneration buds of different area leaves
茎长度 /cm 叶面积 /cm2 6-BA浓度 /mg·L-1 NAA浓度 /mg·L-1 叶生芽数 /个 茎生芽数 /个
0.02 0.05 0 0 3.7 4.5
0.5 0.1 6.3 6.1
1.0 0.1 4.2 3.8
0.5 0.10 0 0 3.3 4.7
0.5 0.1 13.5 18.7
1.0 0.1 8.6 12.9
0.8 0.15 0 0 3.4 8.5
0.5 0.1 4.1 7.3
1.0 0.1 2.5 4.1
每种培养基上培养的叶片和茎段均为 5 0 片。
表 2 不同浓度Kan对杨树再生芽分化的影响
Table 2 Effects of different concentrations of Kan on
regeneration of poplar
Kan浓度 /mg·L-1 分化率 /% 死亡率 /%
0 100.00 0
1 0 95.30 4.70
3 0 23.22 75.78
5 0 16.33 83.67
70 0 100
接种数均为 1 0 0 个。
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合到杨树基因组中去。转基因植株中外源基因插
入的拷贝数不同，单拷贝之外还有部分双拷贝的
存在。
讨　　论
本实验研究通过 PCR检测、PCR产物的测序
以及 Southern blot杂交结果表明，根癌农杆菌能
够成功介导AtNHX1基因整合到杨树染色体基因组
中，也是首次将 AtNHX1基因导入‘尼娃 107’
速生杨中。选用杨树茎段作为外植体建立的高频
再生体系是高效转化率的保证。本实验共检测出
126个阳性植株，阳性转化率达到 60%以上。有
研究表明预培养的时间和菌液浓度都影响着转化结
果，预培养可以促进细胞分裂，易于整合外源
DNA，但是时间过长也会使得伤口愈合而影响转
化，2 d较为适宜；菌液浓度过低将无法达到侵
染效果，浓度过高又会导致农杆菌的过量繁殖，
使得抗生素无法达到抑菌效果，外植体最终会褐
化而死，OD600 = 0.5~0.6较为适宜。杨树是多年
生木本植物，生命周期较长，因此对其耐盐性的
鉴定需要较长一段时间才能获得肯定结果。此外
外源基因表达受到多因素控制，杨树植株幼年和
成年对盐胁迫的抗性也未必一致，所以杨树的田
间实验还需要经过多年观察，本实验的后续工作
正在进行中。
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图 2 转AtNHX1基因的PCR检测
Fig.2 PCR amplification results of AtNHX1 gene in the transformed plants
1 ~ 5 为转化植株；6 为非转化植株；7 和 8 为阳性质粒；9 为 Ma k er D L2 0 0 0。
图 3 转 AtNHX1基因的 Southern blot检测
Fig.3 Southern blot analysis of AtNHX1 gene
in the transformed plants
1 ~ 3 为转化植株；4 为非转化植株；5 为阳性质粒。