全 文 ：林业科学研究　2009, 22 (5) : 630～634
Forest R esearch
　　文章编号 : 100121498 (2009) 0520630205
转多基因杨树中抗生素标记基因
N PT II表达量分析研究
侯英杰 1, 2 , 苏晓华 13 , 张冰玉 1 , 褚延广 1
(1. 中国林业科学研究院林业研究所 ,国家林业局林木培育重点实验室 ,北京　100091;
2. 北京航空航天大学附属中学 ,北京　100191)
摘要 :对转基因库安托杨及银腺杂种杨 (含 1～5个外源基因 )中选择标记基因新霉素磷酸转移酶基因 (N PT II)进行
PCR扩增 ,证实该基因稳定存在于转基因杨树的基因组中。应用酶联免疫吸附测定法 ( EL ISA )对 2种转基因杨树
中 NPTII蛋白的表达量进行定量检测 ,结果显示 : NPTII蛋白的表达量并没有随着目的基因数量的增加而升高 ,说明
与转单个基因杨树相比 ,转多个基因杨树可能由标记基因引起的生物安全问题并不会加剧。
关键词 :转基因杨树 ;新霉素磷酸转移酶基因 ;酶联免疫吸附测定
中图分类号 : S794 文献标识码 : A
收稿日期 : 2008203227
基金项目 : 国家“十一五”科技支撑计划项目 (2006BAD01A15) ;国家“973”项目 (2009CB119107)及“948”创新重大项目 (2006242C01)
作者简介 : 侯英杰 (1978—) ,女 ,山西省代县人 ,博士.3 通讯作者 : suxh@ caf. ac. cn
Expression Ana lysis of N eom ycin Phosphotransfe rase II ( N PT II)
Gene in M ultigenes Tran sgen ic Poplar
HOU Ying2jie1, 2 , SU X iao2hua1 , ZHANG B ing2yu1 , CHU Yan2guang1
(1. Research Institute of Forestry, CAF; Key Laboratory of Tree B reeding and Cultivation, State Forestry Adm inistration,
Beijing　100091, China; 2. The H igh School Affiliated to Beihang University, Beijing　100191, China)
Abstract: PCR amp lification was app lied on selectable marker gene neom ycin phosphotransferase II (N PT II) in two
transgenic pop lar species, P. ×euram ericana‘Guariento’and Populus a lba ×P. g landu losa which contain one to
five foreign genes. The results showed that this gene was stable integrated in the genome of pop lar trees analyzed.
To quantify the exp ression of N PT II gene, enzyme linked immunosorbent assay was performed on both transgenic
pop lar species. The results showed highly significant linear correlation between quantity of NPTII p roteins and their
OD values, while the quantity of NPTII p roteins exp ressed in different transgenic lines did not increase with the
increased number of transgenes in both pop lar species. Our results indicated that the potential biosecurity risk
caused by multip legenes transgenic pop lar was not more serious than that of single gene transgenic pop lar.
Key words: transgenic pop lar; neom ycin phosphotransferase II (N PT II) ; enzyme linked immunosorbent assay
在转基因植物中 ,导入植物体内的外源基因通
常包括 2类 ,一类是目的性状相关基因 ,一类是选择
标记基因。目前最常用的选择标记基因为 N PTII基
因 [ 1 - 2 ] ,该基因编码的新霉素磷酸转移酶能使植物
产生抗卡那霉素特性 ,因此可以用卡那霉素对转化
植株进行筛选。近年来 ,抗生素标记基因可能产生
的生物安全问题逐渐成为人们争论的焦点 [ 2 - 4 ]。理
论上 ,抗生素标记基因编码产生的蛋白质可改变抗
第 5期 侯英杰等 :转多基因杨树中抗生素标记基因 N PT II表达量分析研究
生素的分子结构 ,使抗生素失效 ,因此 ,人们担心食
用此类转基因植物是否会产生抗生素抗药性 ,并推
测这类基因也可能对动物、微生物及其它植物存在
潜在的危害。转基因林木虽然不涉及到食品安全问
题 ,但鉴于其可能对其它动植物、微生物以及土壤和
地下水产生影响 ,因此有必要对转基因林木 ,特别是
转多基因林木中的选择标记基因 N PTII的表达量进
行检测 ,分析目的基因数量的增加是否导致标记基
因 N PTII表达量的增加 ,从而为评价其生物安全性
提供线索。
目前 ,对转基因植物外源基因表达量进行检测
的方法很多 ,其中对基因编码蛋白含量的检测最能
直观反映该基因的实际表达水平。酶联免疫吸附测
定法 ( EL ISA)具有测定时间短、检测灵敏度高、可定
量分析等诸多优点 ,因而在转基因植物检测中被广
泛应用 , 但目前较多应用于转 B t 基因的研究
中 [ 5 - 9 ]。抗生素标记基因 N PTII表达量的检测最初
依赖于放射性同位素 P32标记 ATP的使用 ,但该方法
存在耗时、稳定性差、受同位素半衰期限制等缺点。
1990年 Baszczynski[ 10 ]首次使用 EL ISA法来定量检
测转基因烟草 (N icotiana tabacum L. )和欧洲油菜
(B rassica napus L. )中 NPTII的含量 ,但仍需要使用
P32标记的 ATP。1992年 Nagel[ 11 ]开始使用无同位
素标记的 EL ISA检测法 ,并开发出检测效果良好的
试剂盒 ;同年 Glen[ 12 ]使用 EL ISA检测法发现 ,在 3
个不同的转基因棉花 ( Gossypium hirsu tum L. )品系
中 ,标记基因 N PTII的表达量为 0. 04% ～0. 044% ,
获得了较好的检测效果。此外 ,McKenzie等 [ 13 ]使用
EL ISA法对 9种转基因植物中的 NPTII含量进行了
检测 , Laura等 [ 14 ]则探讨了不同的提取及纯化程序
对 NPTII含量检测效果的影响。国内对于转基因植
物中的 NPTII含量检测方面的研究尚未见报道 ,特
别是检测植物多基因转化中标记基因 N PTII表达量
方面的研究更是空白。本研究对转多基因杨树中抗
生素标记基因 N PTII表达量进行了检测 ,以期探讨
NPTII蛋白表达量是否随目的基因数量的变化而变
化 ,也为转基因杨树生物安全性评价提供参考。
1　材料与方法
1. 1　试验材料
试验林位于北京昌平韩村河东营苗圃 ,以采用
基因枪转化法对库安托杨 ( P. ×euram ericana‘Guari2
ento’)及银腺杂种杨 ( Populus a lba ×P. g landu losa )
进行遗传转化得到的转基因株系及非转基因对照株
系为试材。所转化的外源基因分别为 : ( 1)透明颤
菌血红蛋白基因 ( vgb) ,编码透明颤菌血红蛋白 ,与
提高植物适应贫氧环境的能力有关 ; ( 2)果聚糖蔗
糖转移酶基因 (SacB ) ,编码果聚糖蔗糖转移酶 ,与
植物细胞渗透调节、提高植物的抗旱能力有关 ; ( 3)
B tC ry3A基因 ,编码 B t杀虫晶体蛋白 ,对杨树天牛所
隶属的鞘翅目具有高度专一的抗性 ; (4) OC2I基因 ,
编码水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂 ,该抑制剂属半胱
氨酸类蛋白酶抑制剂 ,对大部分鞘翅目害虫的生长
具有抑制作用 ; ( 5 ) JER Fs基因 ,编码 AP2 /EREBP
类植物转录因子 ,与植物抗逆性有关。目的基因中
B tC ry3A和 OC2I位于同一载体上形成双价基因。标
记基因为来自大肠杆菌转座子 Tn5的新霉素磷酸转
移酶 Ⅱ型 (N PTII)基因 ,该基因使植株获得对卡那
霉素的抗性。
选取转基因库安托杨 15个株系及 1个非转基
因对照株系 ,这 15个株系含有不同数量的外源基
因 ,其目的基因数量和种类已经过测定 [ 9, 15 ]。选取
转基因银腺杂种杨 18个株系及 1个非转基因对照
株系 ,这 18个株系也含有不同数量的目的基因 ,其
基因数量也已经过测定 [ 15 ]。参试转基因库安托杨
及银腺杂种杨株系编号及其含有目的基因的数目与
种类见表 1。
1. 2　试验方法
1. 2. 1　转基因库安托杨标记基因 N PTII的 PCR检
测 　采用 CTAB法 ,从 16个库安托杨株系及 19个
银腺杂种杨株系叶片中提取基因组 DNA ,根据已知
的 N PTII基因序列设计引物进行 PCR 扩增。 PCR
引物序列为 NF: 5’2GAACAAGATGGATTGCACGC2
3’; NR: 5 ’2GAAGAACTCGTCAAGAAGGC23 ’; PCR
反应体系如下 : 10 ×PCR buffer 2. 5μL, dNTPs 0. 5
μL; NF 0. 5μL, NR 0. 5μL, rTaq 0. 25μL,模板 DNA
1μL,加去离子水至 25μL。反应程序如下 : 94 ℃
5 m in; 94 ℃ 30 s, 54 ℃ 30 s, 72 ℃ 50 s; 72 ℃
7 m in,共 36个循环。
1. 2. 2　NPTII蛋白表达量的 EL ISA检测 　分别以
当年生库安托杨 16个株系及银腺杂种杨 19个株系
的叶片为材料 ,每个株系选取 3株 ,尽量在相同位置
取 3片叶 ,使用美国 Agdia公司生产的 PathoScreen
kit for neomycin phosphotransferase II试剂盒进行
NPTII蛋白含量的测定。测定方法如下 : 在 3 mL
PEB1溶液中加入 0. 1 g叶片 ,即样品和 buffer的比
136
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 22卷
例为 1∶30 (质量 /体积 ) ,用研棒充分研磨后 , 1 000
r·m in - 1离心 1 m in。用 1 mL PEB1溶解阳性对照
粉 ,充分混匀 ,并用 PEB1进行稀释后使用。按照设
表 1　参试杨树株系及其所含外源基因数目与种类
树种 株系 目的基因数 /个 目的基因种类
库安托杨 D520 0 -
D525 1 JERFs
D5211 1 vgb
D5225 2 vgb, JERFs
D5238 2 vgb, JERFs
D527 3 vgb, B tCry3A +OC2I
D5210 3 vgb, B tCry3A +OC2I
D5213 3 vgb, B tCry3A +OC2I
D5214 3 vgb, B tCry3A +OC2I
D529 5 vgb, SacB , JER Fs, B tC ry3A +OC2I
D5218 5 vgb, SacB , JER Fs, B tC ry3A +OC2I
D5219 5 vgb, SacB , JERFs, B tCry3A +OC2I
D5220 5 vgb, SacB , JER Fs, B tC ry3A +OC2I
D5221 5 vgb, SacB JERFs, B tCry3A +OC2I
D5224 5 vgb, SacB , JER Fs, B tC ry3A +OC2I
D5226 5 vgb, SacB , JER Fs, B tC ry3A +OC2I
银腺杂种杨 D1320 0 -
D13214 1 SacB
D13230 1 vgb
D13240 1 SacB
D13229 2 vgb, JERFs
D1323 3 SacB , B tCry3A +OC2I
D13239 3 SacB , B tCry3A +OC2I
D13248 3 SacB , B tCry3A +OC2I
D13255 3 SacB , B tCry3A +OC2I
D13260 3 SacB , B tCry3A +OC2I
D13235 4 SacB , JERFs, B tCry3A +OC2I
D13247 4 SacB , JERFs, B tCry3A +OC2I
D13253 4 SacB , JERFs, B tCry3A +OC2I
D13254 4 SacB , JERFs, B tCry3A +OC2I
D13210 5 vgb, SacB , JER Fs, B tC ry3A +OC2I
D13225 5 vgb, SacB , JER Fs, B tC ry3A +OC2I
D13226 5 vgb, SacB , JER Fs, B tC ry3A +OC2I
D13236 5 vgb, SacB , JER Fs, B tC ry3A +OC2I
D13242 5 vgb, SacB , JER Fs, B tC ry3A +OC2I
计 ,在酶标板每孔中加入 100μL标准样品、待测样
品和空白对照 ( PEB1溶液 ) ,反应停止后用 Model
680 M icrop lat Reader(B io2Rad)仪测定其 OD450值 ,该
试剂盒可检测浓度范围为 4 ng·mL - 1 ～125 Pg
·mL - 1。
2　结果与分析
2. 1　转基因杨树 N PT II基因的 PCR检测
对扩增的 PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析 ,
电泳结果显示 :库安托杨 15个转基因株系和银腺杂
种杨 18个转基因株系均有 N PT II基因的扩增片断 ,
产物长度为 786 bp,证明 N PT II基因仍稳定存在于
各转基因株系的基因组中 (图 1、2)。
(CK +为阳性对照 , 0为未转基因阴性对照 ,
M为 DL2000 Marker,其它泳道为检测样品 )
图 1　转基因库安托杨 N PT II基因的 PCR扩增
2. 2　转基因杨树 NPT II蛋白的 EL ISA检测
图 3中酶标板样品孔内显色的深浅代表 NPTII
蛋白含量的高低 ,颜色越深说明检测样品的 NPTII
蛋白含量越高 ,颜色越浅则表示含量越低。图中采
用数字 1～19标出的样品孔内检测出 NPTII蛋白 ,
随数字的增大样品颜色越深 , NPTII蛋白含量也越
高。通过酶标仪对反应板每个样品孔的检测 ,获得
了每个样品相应的 OD450值。
(CK +为阳性对照 , 0为未转基因阴性对照 ,M为 DL2000 Marker,其它泳道为检测样品 )
图 2　转基因银腺杂种杨 N PTII基因的 PCR扩增
236
第 5期 侯英杰等 :转多基因杨树中抗生素标记基因 N PT II表达量分析研究
图 3　NPTII蛋白的 EL ISA反应
2. 3　转基因库安托杨 NPT II蛋白的 EL ISA检测及
分析
以标准 NPTII蛋白质量浓度为纵坐标 ,以经
EL ISA法测定的相对应 OD450值为横坐标绘制标准
曲线。由图 4可知 :随着标准品质量浓度的增加 ,其
OD450值也逐渐增加。相关性分析表明 ,标准 NPTII
蛋白相关系数为 0. 999 3,线性回归方程为 :
y = 12. 841x - 1. 286 5
标准 NPTII蛋白质量浓度与相对应测得的
OD450值有良好的线性关系。
图 4　转基因库安托杨 NPTII蛋白标准曲线
以酶标仪原始读值减去空白对照读值作为
OD450的最后读值。将各株系 OD450值进行统计分
析 ,算出含有相同目的基因数量株系的平均值 ,然后
代入线性回归方程 ,即可得出待测样品的 NPTII蛋
白含量。从表 2可知 :转 1个目的基因的株系 NPTII
蛋白质量浓度最高 ,但是转不同数量目的基因株系
的 NPTII蛋白含量并没有随着目的基因数量的增加
而增加。
2. 4　转基因银腺杂种杨 NPT II蛋白的 EL ISA检测
及分析
以标准 NPTII蛋白质量浓度为纵坐标 ,以经 EL ISA
表 2　库安托杨 OD450值及 NPT II蛋白含量
目的基因数量 /个 OD450值 鲜叶蛋白含量 / ( ng·g - 1 )
1 0. 171 5 27. 47
2 0. 149 5 19. 00
3 0. 151 3 19. 69
4 - -
5 0. 143 6 16. 72
法测定的相对应 OD450值为横坐标绘制标准曲线。
由图 5可知 :随着标准品质量浓度的增加 ,其 OD450
值也逐渐增加。相关性分析表明 ,标准 NPTII蛋白
相关系数为 0. 999 6,线性回归方程为 :
y = 10. 433x - 0. 884 7
标准 NPTII蛋白质量浓度和相对应测得的
OD450值有良好的线性关系。
图 5　转基因银腺杂种杨 NPTII蛋白标准曲线
以酶标仪原始读值减去空白对照读值作为
OD450的最后读值。将各株系 OD450值进行统计分
析 ,计算出含有相同数量目的基因株系的平均值 ,然
后代入线性回归方程 ,得出待测样的 NPTII蛋白含
量。由表 3可知 :在含有 1、2、3、4个外源基因的株
系中 ,其 NPTII蛋白含量的平均值随着目的基因数
量的增加而增加 ,但是 ,有 5 个外源基因株系的
NPTII蛋白含量的平均值最低 ,未表现出标记基因
NPTII蛋白的表达量随外源基因数量的增加而增加
的趋势。
表 3　银腺杂种杨 OD450值及 NPT II蛋白含量
目的基因数量 /个 OD450值 鲜叶蛋白含量 / ( ng·g - 1 )
1 0. 092 6 2. 44
2 0. 096 0 3. 51
3 0. 097 0 3. 82
4 0. 108 9 7. 54
5 0. 102 7 5. 60
336
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 22卷
3　讨论
EL ISA方法是直接检测转基因植物外源基因蛋
白表达量的手段之一 ,该方法有诸多优点 ,但也容易
受检测环境的湿度和温度等条件的影响。本实验在
相同环境条件下进行 ,并对每次实验同时进行了标
准曲线分析 ,对每个样品进行了平行检测 ,同时设立
空白对照 ,从而保证了所得试验数据的真实可靠。
目前 ,国外采用 EL ISA方法对转基因植物中的
抗生素标记基因 N PT II的表达量进行了一些研究 ,
但无转基因林木中的相关研究报道 ,而国内对转基
因植物 NPTII蛋白表达量方面的研究仍是空白。鉴
于抗生素标记基因 N PT II可能产生的生物安全问
题 [ 16 ] ,作者认为有必要对其表达量进行检测 ,特别
是对于转多基因植物 ,抗生素标记基因 N PT II的表
达量是否会随着目的基因的增加而增加 ,从而是否
可能增加其生物安全的危险性尚不可知。
本研究以含有不同数量目的基因的 16个库安
托杨株系及 19个银腺杂种杨株系为试验材料 ,对标
记基因 N PT II进行 PCR检测 ,证明其仍稳定存在于
杨树基因组中。应用 EL ISA吸附检测法对其中的标
记基因 NPTII蛋白含量进行检测 ,结果发现 ,在参试
的 2种不同杨树中 ,含不同数量目的基因 (0～5个 )
的各株系叶片中 NPTII蛋白含量并没有随着目的基
因数量的增加而增加 ,表明与转单个目的基因杨树
相比 ,由标记基因引起的生物安全问题并不会随着
外源基因数量的增加而加剧。
参考文献 :
[ 1 ] Gay P B, Gillesp ie S H. Antibiotic resistance markers in genetically
modified p lants: a risk to human health [ J ]. Lancet Infect D is,
2005, 5 (10) : 637 - 646
[ 2 ] 王紫萱 , 易自力. 卡那霉素在植物转基因中的应用及其抗性基
因的生物安全性评价 [ J ]. 中国生物工程杂志 , 2003, 23 ( 6 ) :
9 - 13
[ 3 ] 司家钢. 转基因植物中的卡那霉素抗性 [ J ]. 生物技术通报 ,
1998, 14 (1) : 29 - 31
[ 4 ] 徐茂军. 转基因植物中卡那霉素抗性 ( Kanr)标记基因的生物安
全性 [ J ]. 生物学通报 , 2001, 36 (2) : 18 - 19
[ 5 ] 崔林开 , 叶华智. 3种 EL ISA法检测 B t杀虫蛋白的比较研究
[ J ]. 安徽农业科学 , 2005, 33 (11) : 2056 - 2057
[ 6 ] 刘光明 , 苏文金. 应用间接 EL ISA方法定量检测转基因抗虫玉
米 [ J ]. 无锡轻工大学学报 , 2003, 22 (1) : 49 - 52
[ 7 ] 严吉明 , 叶华智 , 伍光庆. 转 B t抗虫基因植物中杀虫蛋白的酶
联免疫检测技术研究Ⅲ. 酶联免疫 ( EL ISA ) 间接法检测 B t杀
虫蛋白研究 [ J ]. 四川农业大学学报 , 2005, 23 (3) : 280 - 284
[ 8 ] 李葱葱 ,刘　娜 ,康岭生 , 等. 转基因抗虫玉米 B t蛋白表达量的
研究 [ J ]. 玉米科学 , 2006, 14 (3) : 40 - 41
[ 9 ] 王建革 , 苏晓华 , 纪丽丽 , 等. 基因枪转多基因库安托杨的获得
[ J ]. 科学通报 , 2006, 51 (23) : 2755 - 2760
[ 10 ] Baszczynski C L. A rap id immunop recip itation assay for neomycin
phosphotransferase II exp ression in transformed bacteria and p lant
tissues[ J ]. B iochem Cell B iol, 1990, 68 (6) : 983 - 987
[ 11 ] Nagel R J, Manners J M, B irch R G. Evaluation of an EL ISA assay
for rap id detection and quantification of neomycin phosphotrans2
ferase II in transgenic p lants [ J ]. Plant Mol B iol Rep, 1992, 10
(3) : 263 - 272
[ 12 ] Rogan G J, Ream J E, Berberich S A, et al. Enzyme2linked immu2
nosorbent assay for quantitation of neomycin phosphotransferase II in
genetically modified cotton tissue extracts[ J ]. J Agric Food chem,
1992, 40 (8) : 1453 - 1458
[ 13 ] McKenzie M J, Mett V, Jameson P E. Modified EL ISA for the de2
tection of neomycin phosphotransferase Ⅱ in transformed p lant spe2
cies[ J ]. Plant Cell Rep, 2000, 19 (3) : 286 - 289
[ 14 ] Anfossi L , Tozzi C, Giraudi G, et al. Evaluation of p rocedures for
the extraction and purification of neomycin phosphotransferase II
from a genetically modified A grobacterium [ J ]. Annali di Chim ica,
2004, 94 (1 - 2) : 93 - 99
[ 15 ] 王建革. 基因枪转多基因杨树的获得 [ D ]. 北京 :中国林业科
学研究院 , 2006: 40 - 44
[ 16 ] 邓　欣 , 赵廷昌 , 高必达. 转基因抗虫棉叶围卡那霉素抗性细
菌种群动态及 N PT II基因漂移研究 [ J ]. 中国农业科学 , 2007,
40 (11) : 2488 - 2494
436