全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 2期，2007年 4月 303
扶芳藤茎尖的玻璃化法超低温保存及其植株再生
王贞，高健洲，刘燕 *
北京林业大学园林学院，国家花卉工程技术中心，北京 100083
收稿 2007-01-18 修定　 2007-02-14
* 通讯作者( E -m a i l：c h b l y @ so h u . c o m；T e l：01 0 -
82 37 60 17 -6 01 )。
扶芳藤属卫矛科卫矛属常绿藤本灌木，我国
拥有丰富的扶芳藤资源，目前已经引起了专家学
者的注意，扶芳藤的资源和变异研究(潘青华等
2004)、叶片粗蛋白和氨基酸成分分析(潘青华等
2005)、组织培养(王茂良等 2004；金万梅等 2005)
以及抗寒性(赵黎芳等2004)等方面已有一些报道。
研究发现，在田间管理条件完全一致的资源圃
中，扶芳藤的攀援特性、叶形、叶色、冬季叶
色变化、花序形态以及种子性状等的种内变异类
型很多(潘青华等 2004)，这说明常规保存扶芳藤
种质资源的方法不仅需要大量的人力与财力，而
且难以长期保存，保存过程中会发生变异。液氮
超低温保存是目前植物种质资源长期稳定保存的最
好方法，其中玻璃化法以其独特的优势备受人们
推崇。
本文研究圆瓣扶芳藤[Euonymus fortunei
(Turcz.) Hand.-Mazz. cv.‘Yuanban’]组织培养苗
茎尖的超低温保存和保存茎尖的再生。2003年 3
月，从北京北林科技苗圃取圆瓣扶芳藤实生苗的
带芽茎段，截成 1.5 cm的小段，用消毒液处理
15 min，在自来水下流水冲洗 30 min后，于超
净工作台上，将带芽茎段用 75%酒精消毒 30 s，
再用 0.1%的HgCl2消毒 7 min，然后用无菌水冲
洗 10遍，接种于添加 1.0 mg·L-1 6-BA和 0.1 mg·L-1
NAA的MS固体培养基上。5 d后芽开始萌动，45 d
后进行继代培养，以继代培养 30 d生长健壮的组
织培养苗为材料进行超低温保存。培养条件：光
照为 40~60 µmol·m-2·s-1，温度为 23~25 ℃。
在超净工作台上，以继代 30 d生长健壮的扶
芳藤组织培养苗进行如下试验：( 1 )切取茎尖
1~2、2~3、3~5 mm，放入 1.8 mL冷冻管中(10
个 ·管 -1)，先用 Loading溶液(2 mol·L-1甘油 +0.4
mol·L-1蔗糖)处理 20 min，再经 100% PVS2 (300
g·L-1甘油 +150 g·L-1乙二醇 +150 g·L-1 DMSO，以
含 0.4 mol·L-1蔗糖的MS液体培养基配制)于 0 ℃
条件下处理 50 min；(2)切取茎尖 2~3 mm，经
Loading溶液分别预处理 0、10、20、30、40、
50、60 min后，在 0 ℃条件下用 100% PVS2处
理 50 min；(3)切取茎尖 2~3 mm，经 Loading溶
液处理 20 min后，在 0 ℃条件下用 100% PVS2
分别处理 0、10、20、30、40、50、60 min。
然后更换新的PVS2溶液，迅速将冷冻管浸入液氮
中，冻存 1 d后取出茎尖，于 40 ℃水浴中化冻
70 s，再转到室温下用MS 液体培养液(含 1 .2
mol·L-1蔗糖，pH 5.8)洗涤 2次，每次 10 min，
然后接种在MS+2.0 mg·L-1 6-BA+30 g·L-1蔗糖的固
体培养基(琼脂 6 g·L-1，pH 5.8)上暗培养，7 d后
转到正常光照条件下恢复培养，30 d后检测茎尖
成活率(存活茎尖数占冻存茎尖总数的百分比)。每
个处理有 10个茎尖，重复 3次。得到如下结果。
1. 茎尖长度对其在超低温保存后的成活率影
响很大，2~3 mm的茎尖液氮保存后的成活率最
高(为 74.3%)，而 1~2和 3~5 mm的茎尖保存后成
活率分别为 14.3%和 24%。茎尖过小，再生能力
较差，茎尖过大会导致茎尖玻璃化程度不够而影
响成活率，这与已有报道(王子成和邓秀新 2001)
一致。
2. Loading溶液处理时间对茎尖液氮保存的成
活率也有影响，其成活率随着处理时间的延长而
提高，处理 20 min以上的差异不显著(表 1)。
表 1 PVS2和 Loading溶液处理时间对超低温
保存后扶芳藤茎尖成活率的影响
处理时间 /min
处理液
0 10 20 30 40 50 60
PVS2 0 10.0 22.0 40.0 47.1 74.3 75.0
Loading 10.5 36.1 74.3 75.6 74.3 75.7 77.6
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3. 扶芳藤茎尖保存成活率与PVS2的脱水时间
也有关系：时间短，脱水效果不充分，影响成
活率；脱水时间过长，细胞组织受到伤害后的恢
复能力差。最佳的处理是 0 ℃条件下处理 50~60
min (表 1)。
4. 经液氮保存的茎尖再生培养基与继代增殖
培养基的效果不同：在添加 1.0 mg·L-1 6-BA和
0.1 mg·L-1 NAA的MS固体培养基上的茎尖，不
能直接生成幼苗而形成愈伤组织；而在只添加
6-BA的MS培养基上的茎尖，则可直接成苗，这
与 6-BA的浓度也有关系，茎尖在添加 2.0 mg·L-1
6 -BA 的再生培养基上的生长速度优于添加 1.0
mg·L-1 6-BA的。
5. 液氮再生苗生根后 40 d，移栽到穴盘上栽
培，基质为草碳:珍珠岩 =3:1。开始覆盖塑料膜，
喷水以保持湿度，15 d时，幼苗恢复生长后去掉
覆盖膜，正常肥水管理，移栽成活率高达 100%。
穴盘中幼苗生长时间过长会导致营养不良和根系出
现盘根现象，所以生长 50 d左右需要换盆，盆
径 16 cm×16 cm，基质为草碳:沙:园土 =1:1:1。于
2006年 4月中旬，将液氮再生苗移栽到苗圃露地
栽培。移栽初期遮荫，避免阳光直射，移栽后
1个月，幼苗恢复生长，去掉遮荫网，正常肥水
管理，再生苗长势良好。移栽 3 个月后，苗高
可达 50 cm (图 1)。
参考文献
金万梅, 尹淑萍, 鲁韧强, 潘清华, 白金(2005). 扶芳藤组织培养再
生体系的建立. 植物生理学通讯, 41 (1): 27~29
潘青华, 宋婉, 鲁韧强, 续久如(2004). 扶芳藤种质资源及变异研
究. 北京林业大学学报, 26 (2): 58~62
潘青华, 张维海, 鲁韧强(2005). 扶芳藤叶片粗蛋白和氨基酸成分
分析. 中国农学通报, 21 (8): 204~207
王茂良, 赵梁军, 任桂芳, 王建红, 冯慧(2004). 扶芳藤再生体系的
建立. 园艺学报, 31 (2): 241~244
王子成, 邓秀新(2001). 玻璃化法超低温保存柑桔茎尖及植株再
生. 园艺学报, 28 (4): 301~306
赵黎芳, 张金政, 张启翔, 石雷, 鲁韧强(2004). 盐和水分预处理对
扶芳藤幼苗抗寒性的影响. 植物研究, 24 (7): 213~316
图 1 液氮保存后扶芳藤茎尖培养和植株再生
　　a：液氮保存后的茎尖；b：液氮保存 3 0 d 后茎尖直接成苗；c：液氮保存 3 0 d 后茎尖形成的愈伤组织；d：超低温再生
苗生根；e：超低温再生苗移栽到穴盘；f：超低温再生苗移栽入花盆；g：超低温再生苗移栽入露地；h：移栽 3 个月后露
地生长情况。