全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 3期，2008年 6月 409
转入甜椒热激蛋白基因CaHSP18提高番茄的耐冷性
郭鹏 1，隋娜 1，于超 1，郭尚敬 3，董新纯 1,2,*，孟庆伟 1,2
山东农业大学 1生命科学学院，2作物生物学国家重点实验室，山东泰安 271018；3聊城大学生命科学学院，山东聊城
252000
提要：利用农杆菌介导法将甜椒热激蛋白基因转化番茄，Northern和Western杂交表明CaHSP18在番茄植株中表达，获
得转 CaHSP18的番茄植株。Northern杂交显示，CaHSP18基因受低温诱导，表达量随低温处理时间的延长而增加，6 h
时表达量最高。低温胁迫导致野生型和转基因番茄植株的相对电导率升高，光系统II (PSII)最大光化学效率(Fv/Fm)和放氧
速率下降，但转基因番茄植物维持较低的膜透性，较高的Fv/Fm和放氧速率。这些显示，在番茄植株中CaHSP18表达后耐
冷性有提高。
关键词：甜椒细胞质小分子量热激蛋白；转基因；番茄；低温胁迫
CaHSP18 of Sweet Pepper Enhanced Chilling Tolerance of Transgenic Tomato Plants
GUO Peng1, SUI Na1, YU Chao1, GUO Shang-Jing3, DONG Xin-Chun1,2,*, MENG Qing-Wei1,2
1College of Life Sciences, 2State Key Laboratory of Crop Biology, Shandong Agricultural University, Tai’an, Shandong 271018,
China; 3College of Life Sciences, Liaocheng University, Liaocheng, Shandong 252000, China
Abstract: Sweet pepper CaHSP18 was introduced into tomato by the A. tumefaciens-mediated method. North-
ern and Western blot showed that CaHSP18 gene was recombined into the genome of tomato in some tomato
transgenic lines. Northern blot showed that the expression of CaHSP18 was induced by low temperature stress,
and the highest mRNA level was observed after 6 h under chilling stress. Chilling stress caused the increase in
relative electronic conductance of membrane, and the decrease in maximal fluorescence efficiency of PSII (Fv/
Fm) and oxygen evolution rate of both transgenic and wild tomato plants. However, transgenic tomato plants
with expression of CaHSP18 could maintain the low relative conductance of membranes, higher Fv/Fm and
oxygen evolution rate. It indicated that expression of CaHSP18 enhanced the tolerance of transgentic tomato to
chilling stress.
Key words: CaHSP18; transformation; tomato; chilling stress
收稿 2007-09-10 修定 2008-04-22
资助 山东省自然科学基金(Y 20 07 D5 0)。
* 通讯作者(E-mai l：sspp@sdau.edu.cn；Tel：053 8-
8 2 4 2 0 4 2 )。
植物在遭受非致死高温胁迫时会产生一定的
耐性。在此过程中，植物体内一些正常的基因表
达受到抑制而一些新的基因表达却得到加强，其
中植物合成的温度响应蛋白——热激蛋白(HSP)便
是其中的一种(Carrasco等 1997；Downs等 1999；
Friedrich等 2004；Haslbeck等 1999)。根据其分
子量大小，HSP有 HSP110、HSP90、HSP70、
HSP60和小分子量热激蛋白(sHSP，15~30 kDa)等
多种(Heckathorn等 2002)，其中 sHSP是高等植物
中最为丰富的热激蛋白。
迄今植物小分子量热激蛋白在体内的功能所
知较少。在离体条件下sHSP的一些成员具有分子
伴侣功能(Buchner 1996；Lurie和Klein 1991)，其
分子机制可能是协助蛋白质跨膜运输，防止蛋白
质前体积累并协助蛋白质跨膜转移；维持蛋白质
的正常折叠状态，促进错误折叠的蛋白质降解；
在新生蛋白质折叠及应急条件下能起到稳定多肽
链、防止蛋白质失活的作用。细胞质小分子量热
激蛋白便具有这种功能，编码这一蛋白的基因来
源于甜椒，已得到克隆，全长 779 bp，命名为
CaHSP18，此基因在高温胁迫条件下可以提高大
肠杆菌的生存能力(郭尚敬等 2005)。高温胁迫下
小分子量热激蛋白对植物的保护作用已有较多报道
(Baniwal等 2004；Song等 2001；Tang等 2006)，
小分子量热激蛋白与植物抗寒性有相关性，近来
有研究表明过量表达叶绿体小分子量热激蛋白可以
提高番茄的抗寒性(Wang等 2005)，初步说明小分
子量热激蛋白对植物抵抗低温胁迫可能有一定的作
植物生理学通讯 第 44卷 第 3期，2008年 6月410
用。本文采用农杆菌介导的方法将甜椒 CaHSP18
转入番茄，并检测了转基因植株在低温胁迫下与
耐冷性有关的某些生理指标的变化。
材料与方法
甜椒(Capsicum annuum L.)品种为‘中农 8
号’，番茄种子为‘中蔬 4 号’。种子催芽 1 周
后移入含有基质的盆中，于培养室中培养，培养
温度为 25 ℃，光照强度为 75 µmol·m-2·s-1，光照
周期(昼 /夜)为 12 h/12 h。
克隆受体大肠杆菌菌株为DH5α，原核表达
的大肠杆菌菌株为 B L 2 1，克隆载体 P M D - T
vector、限制性内切酶、T4连接酶为 TaKaRa产
品，PCR产物纯化试剂盒购自上海生物工程技术
服务有限公司，小牛血清，牛血清白蛋白，辣
根过氧化酶标记的二抗和Taq DNA聚合酶为上海
博亚生物技术有限公司产品，氨苄青霉素、低熔
点琼脂糖为 Sigma 公司产品。原核表达载体为
PET30a。IAA、6-BA和玉米素为上海申能博彩
技术有限公司产品。实验小鼠从泰安市米歇尔公
司购得。
甜椒幼苗于 4 ℃低温下设 2、4、6、8 h共
4个处理，以 0 h低温处理(25 ℃室温)为对照。各
处理分别取 1 g幼叶组织，液氮冷冻磨碎，加 1
mL Trizol缓冲液提取总 RNA。关于 RNA提取、
Northern杂交分析、表达载体构建等操作步骤均
参见前期工作(郭尚敬等 2005)。
番茄的遗传转化采用叶盘法，采用根癌农杆
菌介导法进行遗传转化，其具体操作过程见张宁
等(2004)文中的方法，得到转基因植株。用CTAB
微量法提取转基因及野生型番茄叶中的总DNA，
以此为模板，用 PBI121载体上游的 35S启动子 5
引物(5 -GTAATCTCCACTGACGTAAG-3 )和CaH-
SP18基因的 3引物(5 -GAGAATTCTTAACCA-
GAG-3)进行 PCR扩增。
转基因番茄的Western杂交检测时，进一步
纯化经原核表达的蛋白质，再以 SDS-PAGE电
泳，将含目的蛋白的凝胶带割下，制成含青霉素
的注射液，注射小白鼠，1个月后取血清，得到
一抗。分别取转基因当代株系 T0-4、T0-6和野生
型番茄幼叶组织 1 g，提取蛋白质并进行Western
杂交分析。
测定转基因植株 Fv/Fm、放氧活性、膜透性
时，取野生型和转基因番茄 T0-4和 T0-6，于 4 ℃
培养箱中分别处理 0、2、4、6 和 8 h 后，用
FMS2饱和脉冲调制式荧光仪(英国Hansatech公
司)测定叶片 PSI I 最大光化学效率(F v/Fm)，用
Clark-型氧电极(英国Hansatech公司)测定放氧活
性，用DDS-12型电导仪测定相对电导率(赵世杰
等 2002)。
实验结果
1 低温下 CaHSP18在甜椒叶中的表达
Northern杂交分析表明(图 1)，CaHSP18基
因的表达受低温诱导，以处理 6 h的为最高。
图 1 4 ℃下CaHSP18在甜椒叶片中的表达
Fig.1 Expression of CaHSP18 in leaves of sweet pepper at 4 ℃
图 2 CaHSP18基因转化番茄的 PCR验证
Fig.2 The identification of CaHSP18 in transgenic tomato
plants by PCR
2 CaHSP18基因转化番茄的 PCR验证和North-
ern杂交
采用农杆菌介导法转化番茄后，挑选 7个转
基因当代株系和野生型，提取它们的总DNA，利
用PBI121上游 35S启动子和CaHSP18基因上的3
引物进行 PCR扩增验证，最后筛选得到 6个株系
(图 2)。对野生型及转基因株系 T0-1、T0-4和 T0-
6的Northern杂交分析表明(图 3)，在野生型番茄
植株中未检测到 CaHSP18基因的表达，而在转基
因番茄植株中则可检测到，以T0-4表达量为最高，
T0-6次之，T0-1最低。
植物生理学通讯 第 44卷 第 3期，2008年 6月 411
3 转基因番茄中 CaHSP18的Western杂交验证
Western杂交分析结果(图 4)表明，转基因植株
T0-4和 T0-6中 CaHSP18蛋白有较高的表达量，野
生型中未检测到。说明在转基因番茄中能表达
CaHSP18蛋白。
中，野生型和转基因植株的 Fv/Fm下降，但野生
型番茄的 Fv/Fm下降幅度较大，处理 8 h的转基因
株系 T0-4、T0-6和野生型番茄的Fv/Fm分别比处理
前下降 14.5%、16.7%和 32.8% (图 6)，表明野
生型的光抑制程度明显高于转基因株系。(2)转基
因植株和野生型植株的放氧速率随着低温处理时间
的延长而逐渐降低(图 7)，野生型番茄放氧速率下
降程度大于转基因植株，低温胁迫 8 h的 T0-4和
T0-6的放氧速率分别是处理前的 50.4%和 45.5%，
而野生型仅为处理前的 20.8%。
讨　　论
植物热激蛋白的研究始于 20世纪 80年代初。
一些生长在温带的植物如大豆、玉米、小麦、豌
豆等在组织温度超过32~33 ℃时即合成热激蛋白，
其他许多逆境因素如低温(Soto等 1999)、光氧化
(Waters等 1996)、干旱(Török等 1997；Vierling
1991)等也都可以诱导 sHSP基因的表达，这表明
sHSP是植物对这些逆境因素产生的与植物的抗性
有关的应激蛋白。有研究认为，一些热激蛋白与
图 3 CaHSP18在转基因和野生型番茄中的表达
Fig.3 Expression of CaHSP18 in transgenic and wild tomato
plants
图 5 低温胁迫下转基因番茄叶的相对电导率
Fig.5 Relative electronic conductance in transgenic tomato
plants under chilling stress
图 7 低温胁迫下转基因番茄的放氧速率
Fig.7 Oxygen evolution rate in transgenic tomato plants
under chilling stress
图 6 低温胁迫下转基因番茄的 Fv/Fm
Fig.6 Fv/Fm in transgenic tomato plants under chilling stress
图 4 转基因和野生型番茄中CaHSP18在蛋白水平上的表达
Fig.4 The level of CaHSP18 protein in transgenic and wild
tomato plants
4 CaHSP18转基因番茄中几个与耐冷性相关的生
理指标
将转基因番茄 T0-4、T0-6两个株系和野生型
对照在 4 ℃进行低温胁迫 6 h。从图 5可见，低
温胁迫后，野生型和转基因番茄植株的相对电导率
都增加，但野生型植株增加的幅度较大(55.2%)，
CaHSP18表达量最高的T0-4株系增加最少(26%) ；
T0-6株系的居中(35.6%)。表明低温胁迫对转基因
番茄叶片细胞膜造成的伤害轻于野生型番茄。
从图 6和图 7可见，(1)在低温(4 ℃)胁迫过程
植物生理学通讯 第 44卷 第 3期，2008年 6月412
植物的耐冷性有关。我们对甜椒进行高温、低
温、干旱和 H2O2处理后，只有高温诱导叶绿体
小分子量热激蛋白基因(CaHSP26)表达(Guo等
2007)，说明高温以外的逆境因素对小分子量热激
蛋白的诱导并不具有普遍性。本文的Northern杂
交证实了低温的确诱导甜椒细胞质小分子量热激蛋
白基因(CaHSP18)的表达。用农杆菌介导法将其
转化番茄，并且分别通过PCR扩增、Northern blot
和Western blot得到的结果也证明了这一点(图 2、
3 )。
尽管人们已分离到许多热激蛋白基因，并且
对诱导表达的因素进行了探讨，但对这些基因在
生物活体内的功能的研究仍然较少(Liu和Mariko
2001)。甜椒 CaHSP18基因在番茄中表达对番茄
植株在常温下的生长没有影响，但在低温胁迫下
可以明显减缓植株细胞膜透性的增加(图 5)，维持
转基因番茄植物较高的Fv/Fm (图 6)和放氧速率(图
7)。据此我们推测甜椒细胞质 CaHSP18可能是通
过分子伴侣的作用参与番茄蛋白质的保护，改善
了细胞膜脂的流动性，减少电解质的外渗
(Horváth等 1998)，从而间接地保护了番茄叶片的
光合机构。
参考文献
郭尚敬, 陈娜, 郭鹏, 孟庆伟(2005). 甜椒细胞质小分子量热激蛋
白基因(CaHSP18)的 cDNA克隆与表达. 植物生理与分子生
物学学报, 31(4): 409~416
张宁, 王蒂, 司怀军(2004). 菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因的分离和诱
导表达. 农业生物技术学报, 12 (5): 612~613
赵世杰, 史国安, 董新纯(2002). 植物生理学实验指导. 北京: 中国
农业科学技术出版社, 130~132
Baniwal SK, Bharti K, Chan KY, Fauth M, Ganguli A, Kotak S,
Mishra SK, Nover L, Port M, Scharf KD et al (2004). Heat
stress response in plants: a complex game with chaperones
and more than twenty heat stress transcription factors. J
Biosci, 29: 471~487
Buchner J (1996). Supervising the fold: functional principles of
molecular chaperones. FASEB J, 10: 10~19
Carrasco R, Almoguera C, Jordano J (1997). A plant small heat
shock protein gene expressed during zygotic embryogenesis
bu t noninducable by heat s tress . J B iol Chem, 27 2:
27470~27475
Downs CA, Ryan SL, Heckathorn SA (1999). The chloroplast
small heat-shock protein: Evidence for a general role in
protecting photosystem II against oxidation stress and
photoinhibition. J Plant Physiol, 155: 488~496
Friedrich KL, Giese KC, Buan NR, Vierling E (2004). Interactions
between small heat shock protein subunits and substrate in
small heat shock protein-substrate complexes. J Biol Chem,
279: 1080~1089
Guo SJ, Zhou HY, Zhang XS, Li XG, Meng QW (2007).
Overexpression of CaHSP26 in transgenic tobacco alleviates
photoinhibition of PSII and PSI during chilling stress under
low irradiance. J Plant Physiol, 164: 126~136
Haslbeck M, Walke S, Stromer T, Ehrnsperger M, White HE,
Chen S, Saibil HR, Bucher J (1999). Hsp26: a temperature-
regulated chaperone. EMBO J, 18: 6744~6751
Heckathorn SA, Ryan SL, Baylis JA, Wang DF, Hamilton EW,
Cundiff L, Dawn SL (2002). In vivo evidence from an Agrostis
stolonifera selection genotype that chloroplast small heat-
shock proteins can protest photosystem II during heat stress.
Funct Plant Biol, 29: 933~944
Horváth I, Glatz A, Varvasovski V, Török Z, Páli T, Balogh G,
Kovács E, Nádasdi L, Benkö S, Joó F (1998). Membrane
physical state controls the signaling mechanism of the heat
shock response in Synechocystis PCC6803: identification of
hsp17 as a “fluidity gene”. Proc Natl Acad Sci USA, 95:
3513~3518
Liu J, Mariko S (2001). Molecular cloning the gene of small heat
shock protein in the mitochondria and endoplasmic reticu-
lum of tomato. Acta Bot Sin, 43: 138~145
Lurie S, Klein JD (1991). Acquisition of low temperature toler-
ance in tomatoes by exposure to high temperature stress. J
Am Soc Hortic Sci, 116: 1007~1012
Song SQ, Fredlund KM, Moller IM (2001). Changes in low
molecular weight heat shock protein 22 of mitochondria
during high-temperature accelerated ageing of Beta vulgaris
L. seed. Acta Phytophysiol Sin, 27: 73~80
Soto A, Allona I, Collada C, Guevara MA, Casado R, Rodriguez-
Cerezo E, Aragoncillo C, Gomez L (1999). Heterologous
expression of a plant small heat-shock protein enhances
Escherichia coli viability under heat and cold stress. Plant
Physiol, 120: 521~528
Tang T, Kwon SY, Kim SH, Kim JS, Choi JS, Cho KY, Sung CK,
Kwak SS, Lee HS (2006). Enhanced tolerance of transgenic
potato plants expressing both superoxide dismutase and ascor-
bate peroxidase in chloroplasts against oxidative stress and
high temperature. Plant Cell Rep, 25: 1380~1386
Török Z, Horváth I, Goloubinoff P, Kovács E, Glatz A, Balogh G,
Vigh L (1997). Evidence for a lipochaperonin: association
of active protein-folding GroESL oligomers with lipids can
stabilize membranes under heat shock conditions. Proc Natl
Acad Sci USA, 94: 2192~2197
Vierling E (1991). The roles of heat shock proteins in plants.
Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 42: 579~620
Wang L, Zhao CM, Wang YJ, Liu J (2005). Overexpression of
chloroplast-localized small molecular heat-shock protein
enhances chilling tolerance in tomato plant. J Plant Physiol
Mol Biol, 31 (2): 167~174
Waters ER, Lee GJ, Vierling E (1996). Evolution, structure and
function of the small heat shock protein in plants. J Exp
Bot, 296: 325~338