全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 3期，2007年 6月524
收稿 2007-01-26 修定 2007-05-22
资助 国家自然科学基金( 3 0 4 6 0 0 1 5 )、教育部科学技术研
究重点项目( 2 0 5 1 7 8 )和新疆高校创新研究群体基金
(XJEDU2004G02)。
* 通讯作者(E-mail：zfcxju @xju.edu.cn；Tel：099 1-
8 5 8 3 5 1 7 )。
在我们实验室克隆到花花柴液泡膜Na+/H+反
向运输载体 1基因Kcnhx1 (注册号DQ303231) (张
霞等 2006)的工作基础上，为了探讨Na+/H+反向
运输载体的表达情况并获得KcNHX1的抗体，本
文又将KcNHX1 C端的94个氨基酸的编码序列克
隆到原核表达载体，并将Kcnhx1全编码序列克隆
到真核表达载体，分别构建了pMAL-p2x-Kcnhx1-
c285和 pcDNA3.1-Kcnhx1。用大肠杆菌 BL21表
达系统促使pMAL-p2x-Kcnhx1-c285表达并纯化融
合蛋白MBP-KcNHX1-C94；用尾静脉大容量快速
注射法(hydrodynamics-based transfection method，
HD法)将 pcDNA3.1-Kcnhx1导入小鼠的肝细胞让
其表达(Liu等 1999)。以 pcDNA3.1-Kcnhx1核酸免
疫小鼠，激发免疫反应后，再用MBP-KcNHX1-
C 9 4 加强免疫，制得效价高、特异性好的抗
KcNHX1抗体，建立了耐盐植物的功能基因制备
抗体和检测表达蛋白的方法。
材料与方法
1 材料
基因Kcnhx1由本实验室克隆。引物合成由北
京奥科生物技术有限公司完成。昆明白小鼠购自
新疆医科大学实验动物中心。Taq酶、T4 DNA连
接酶、限制性内切酶及 DNA分子量标准，均为
大连宝生物工程公司产品。DNA片段回收试剂盒
及羊抗鼠IgG-HPR为北京TIANGEN公司产品。直
链淀粉琼脂糖凝胶树脂购自美国NEB公司。质粒
pcDNA3.1和pMAL-p2x及大肠杆菌BL21由本实验
室保存。
2 重组质粒表达载体的构建
以含有花花柴[Karelinia caspica (Pall.) Less.]
Na+/H+反向运输载体基因开放阅读框(open reading
frame，ORF)的质粒 pYES-Kcnhx1为模板，用引
物 5 GCGGGATCCTT ACTACCTCACTCAGAAG
3和5 GCCGAATTCTCAATGGATCACATCCATGT
3 (分别带有 BamHI和 EcoRI的酶切位点)扩增出
Kcnhx1末端从 1 335~1 620 bp的片段 Kcnhx1-
c285，回收后用 BamHI和 EcoRI双酶切，与带此
2种黏性末端的原核表达载体pMAL-p2x连接。用
KpnI和 EcoRI直接酶切 pYES-Kcnhx1，回收目的
片段 Kcnhx1，与真核表达载体 pcDNA3.1连接。
将连接产物分别转化大肠杆菌BL21和DH5α，在
含有 100 mg·L-1氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性
重组子并进行酶切鉴定。
3 目的片段Kcnhx1-c285的原核表达
挑取含有质粒pMAL-p2x-Kcnhx1-c285的大肠
杆菌 BL21单菌落，37 ℃培养过夜后，按 1%的
花花柴Na+/H+反向运输载体的表达和抗血清制备
郑耀虎，张霞，张富春 *，曾幼玲
新疆大学生命科学与技术学院分子生物学重点实验室，新疆生物资源基因工程重点实验室，乌鲁木齐 830046
The Gene Expression of Karelinia caspica (Pall.) Less. Na+/H+ Antiporter and
Preparation of Its Antiserum
ZHENG Yao-Hu, ZHANG Xia, ZHANG Fu-Chun*, ZENG You-Ling
Key Laboratory of Molecular Biology, College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Xinjiang Key Laboratory
of Biological Resources and Genetic Engineering, Urumqi 830046, China
提要：文章建立了检测耐盐植物功能基因抗体制备和蛋白表达的方法。
关键词：花花柴；Na+/H+反向运输载体；原核表达；尾静脉大容量快速注射法；抗血清
技术与方法 Techniques and Methods
植物生理学通讯 第 43卷 第 3期，2007年 6月 525
比例接种于 6 mL的含有 50 µg·mL-1氨苄青霉素的
LB培养基中，37 ℃下震荡培养，当菌液的吸光
度OD600达到 0.5~0.7时，加异丙基 -β-D-硫代半
乳糖苷(IPTG)至终浓度 0.5 mol·L-1，继续培养 4
h；与此同时，保留一份不加 IPTG 诱导的阴性
对照。诱导结束后，取 1.5 mL菌液，离心得细
菌沉淀。将沉淀用磷酸缓冲液(PBS)洗涤后再悬浮
于 40 µL的 PBS中，加等体积的 2×SDS-PAGE上
样缓冲液(0.2 mol·L-1 β-巯基乙醇、4% SDS、20%
甘油、0.2%溴酚蓝、0.1 mol·L-1 Tris-HCl，pH
6.8)混匀后，沸水浴中作用 10 min后置于冰浴中
冷却，4 ℃下以 12 000×g离心 10 min，取上清
液进行 SDS-PAGE分析；同时处理诱导和未诱导
的含有质粒 pMAL-p2x的大肠杆菌 BL21作对照。
4 融合蛋白MBP-KcNHX1-C94的纯化
将经鉴定能够诱导出融合蛋白MBP-KcNHX1-
C94的菌落按上述条件大量(500 mL)扩繁并诱导
后，于 4 ℃下以 8 000×g离心 5 min，取沉淀悬
浮于过柱缓冲液(20 mmol·L-1 Tr is-HCl、200
mmol·L-1 NaCl、1 mmol·L-1乙二胺四乙酸，pH 7.4)
中，于冰浴中超声波(180 W)破碎细胞。再于 4 ℃
下以 12 000×g离心 15 min，取上清液过直链淀粉
琼脂糖凝胶亲和层析柱(柱长 1.5 cm，柱径 0.8
cm)，具体步骤参照 NEB公司说明书进行。
5 目的基因在小鼠肝细胞中瞬时表达的检测
将构建好的质粒 pcDNA3.1-Kcnhx1提取并纯
化，用 0.9%生理盐水制备成 12.5 µg·mL-1的溶
液。用注射器将 2 mL溶液在 5~8 s的时间里从
小鼠的尾静脉全部推入小鼠的体内。8 h后，将
小鼠处死，提取肝脏的总 RNA。以总 RNA为模
板，以特异性引物 p 1 (5 TACAGTAGTGGT-
GTTTCATCCT 3 )和p2 (5 CTTTATGTTGGTATG-
GACTCA 3 )进行 RT-PCR检测。
6 抗KcNHX1抗体的制备
将纯化的质粒 pcDNA3.1-Kcnhx1用生理盐水
稀释至 1 µg·mL-1。取四周龄雌性昆明白小鼠随机
分为 2组(每组 8只) ：第一组以 pcDNA3.1免疫；
第二组以 pcDNA3.1-Kcnhx1。采用后肢内侧肌肉
三点注射法给小鼠注射100 µL质粒溶液(每次注射
前 24 h同位点注射 100 µg的盐酸普鲁卡因)，每
2周免疫 1次。每次免疫前从眼眶小量采血，分
离血清。免疫 3次后，取纯化的MBP-KcNHX1-
C94 用间接酶联免疫吸附测定( enzyme- l inked
immunosorbent assay，ELISA)法检测血清中的抗
体水平。将产生了抗体的小鼠用融合蛋白加强免
疫。加强免疫的过程为：用等体积弗氏佐剂将
MBP-KcNHX1-C94完全乳化皮下多点注射免疫，
每只小鼠的注射剂量为 30 µg，每 2周免疫 1次，
共免疫 3次，第 1次免疫抗原用弗氏完全佐剂乳
化，后 2次用弗氏非完全佐剂。第 3次免疫后 2
周，摘取眼球放血，分离血清，于-20 ℃下冻存。
7 抗KcNHX1抗体特性鉴定
效价检测采用间接 ELISA法，特异性鉴定采
用Western blot分析。用尾静脉大容量快速注射
法将pcDNA3.1和pcDNA3.1-Kcnhx1两种质粒转入
小鼠体内。8 h后取肝脏，置于液氮中充分研磨，
悬浮于 3倍体积的 PBS中，加入 1/5体积的 5×终
止缓冲液(20%甘油、10% SDS、250 mmol·mL-1
Tris-HCl，pH 6.7)混匀后于冰浴中，250 W超声
5 min。5 000×g离心 5 min后，取上清液，加
入 5% β-巯基乙醇和微量溴酚蓝，于沸水浴中作
用 10 min后，上样进行Western blot分析。一
抗用抗MBP-KcNHX1-C94的小鼠血清，二抗用羊
抗鼠 IgG-HPR。
实验结果
1 重组质粒的酶切鉴定
用 BamHI和 EcoRI酶切 pMAL-p2x-Kcnhx1-
c285，KpnI和 EcoRI酶切 pcDNA3.1-Kcnhx1。琼
脂糖凝胶电泳结果显示，前者切出一条 285 bp的
片段(图 1)，后者切出一条 1 620 bp的片段(图 2)，
图 1 pMAL-p2x-Kcnhx1-c285的酶切鉴定
　　1：DL15000+2000 分子量标准；2：pMAL-p2x-Kcnhx1 -
c285 以 BamHI 和 EcoRI 双酶切。
植物生理学通讯 第 43卷 第 3期，2007年 6月526
均与预计的大小相一致。其中 Kcnhx1-c285连接
在 m al E (编码麦芽糖结合蛋白M BP )的 3 端，
Kcnhx1的ORF直接插入在真核表达载体CMV启动
子之后。
2 目的蛋白的诱导表达及纯化
将含有重组子pMAL-p2x-Kcnhx1-c285的大肠
杆菌 BL21诱导表达后，进行 SDS-PAGE分析，
发现在分子量为 52 kDa处有一条带，即为融合蛋
白MBP-KcNHX1-C94所显示的带(图3第4泳道)。
图 3中第 1泳道和第 2泳道的差异带大小为 50.8
kDa，是融合蛋白MBP-β-半乳糖苷酶 -α片段，
为malE和 lacZα融合表达产物。由于蛋白MBP-
KcNHX1-C94的N端带有MBP (分子量为42 kDa)，
故能用带有麦芽糖的直链淀粉琼脂糖凝胶树脂亲和
层析柱纯化。纯化后的蛋白经 SDS-PAGE分析
后，其纯度达 95%以上(图 4)。经定量测定，纯
化蛋白的浓度为 1.1 mg·mL-1。
图 2 pcDNA3.1-Kcnhx1的酶切鉴定
　　1：DL15000 +2000 分子量标准；2：pcDNA3.1-Kcn hx1
以 Kpn I 和 EcoRI 双酶切。
图 4 融合蛋白MBP-KcNHX1-C94纯化的 SDS-PAGE检测
　　1：蛋白质分子量标准；2：含有 pMAL-p2x-Kcnhx1 -c285
的大肠杆菌 BL21 经 IPT G 诱导，超声波破碎，离心所得上清
液；3：含有 pMAL-p2 x-Kc n h x 1 -c2 8 5 的大肠杆菌 BL2 1 经
I P T G 诱导，超声波破碎，离心所得的沉淀；4：纯化的融
合蛋白MBP-KcNH X1 -C9 4。
图 5 pcDNA3.1-Kcnhx1在小鼠肝细胞中瞬时表达的检测
　　1：D L 1 5 0 0 0 + 2 0 0 0 分子量标准；2：P C R 阴性对照；
3：RT-PCR 阴性对照；4：提取转染过 pcDNA3.1-Kcnhx1 的
肝脏的总 R N A 后，用 R T -P CR 检测的结果。
3 目的基因在小鼠肝细胞中瞬时表达
特异性引物扩增的区域为Kcnhx1的 511~977
bp，共 466 bp。如图 5所示，将转染过 pcDNA3.1-
图 3 融合蛋白MBP-KcNHX1-C94表达的 SDS-PAGE检测
　　1：未经 IPTG 诱导的含有 pMAL-p2x的大肠杆菌 BL21 的
总蛋白；2：经 IPTG 诱导的含有 pMAL-p2x的大肠杆菌 BL21
的总蛋白；3：蛋白质分子量标准；4：经 I P T G 诱导的含有
pMAL-p2 x-Kc nhx 1 -c28 5 的大肠杆菌 BL2 1 的总蛋白；5：未
经 IPTG诱导的含有 pMAL-p2x-Kcnhx1-c285的大肠杆菌 BL21
的总蛋白。
植物生理学通讯 第 43卷 第 3期，2007年 6月 527
Kcnhx1的肝脏的总RNA反转录成 cDNA，再用特
异性引物进行 PCR，得到一条 466 bp的特异性条
带。以总 RNA为模板直接进行 PCR，没有扩增
出条带(图 5)。说明用HD法将pcDNA3.1-Kcnhx1转
入小鼠肝细胞后，外源基因能在小鼠体内转录。
4 鼠抗KcNHX1抗体效价的测定
以纯化的MBP-KcNHX1-C94作抗原，间接
ELISA法检测pcDNA3.1和pcDNA3.1-Kcnhx1两种
质粒每次免疫昆明白小鼠后的血清(稀释 100倍)。
如图 6所示，核酸免疫 3次后，实验组产生了抗
KcNHX1的抗体，而未经免疫的没有；蛋白加强
免疫后，实验组小鼠的血清中抗体急剧增加，远
高于未经免疫的。说明核酸免疫时，pcDNA3.1-
Kcnhx1在实验组小鼠肌肉细胞中表达，小鼠免疫
系统产生了针对KcNHX1记忆细胞，再用蛋白加
强免疫，相应的抗体水平即增加。测定抗血清效
价约为 1:32 000。
盐生理过程中起作用。但作为一种代谢调控蛋
白，直接分离和纯化非常困难，要制备抗原只能
用基因工程表达的手段。用DNAMAN软件对该蛋
白的特性进行预测，其 C端 100个残基有 5个预
测的抗原肽，亲水性较强且位于膜外。从理论上
讲，此段有较好的抗原性和特异性，因此选择它
通过原核表达可以获得特异性的抗原。Hamada等
(2001)在制备滨藜Na+/H+反向运输载体蛋白多抗血
清时也曾做了类似的选择。
本文制备抗血清采用的是核酸免疫的方法。
核酸免疫既能激起体液免疫应答，又能激起细胞
免疫应答。目的基因在小鼠肌肉细胞中表达后，
产生的蛋白会被蛋白酶体降解成小分子的抗原肽，
抗原肽与MHC-I分子在细胞表面形成复合物递呈
给CD8+ T细胞识别，从而刺激多个B淋巴细胞分
化并产生免疫记忆(Habel等 2000)。用核酸免疫的
方法制备抗体的例子已有报道(胡太蛟等 2006)。
核酸免疫抗体滴度往往不理想，因为单纯的核酸
免疫产生的抗体水平很低。为了改变这种境况，
提高抗体滴度，很多增强核酸免疫的策略被相继
提出，其中“DNA初始免疫 -蛋白刺激加强”的
策略就是其中的一种(Ramsay等 1999)。本文用原
核表达的蛋白加强免疫，抗体水平明显增加，这
种增加不仅是量的增加，更是质的差异。核酸免
疫产生抗体中 IgG很少，它主要是 T辅助细胞刺
激 B细胞活化的过程；蛋白加强免疫产生大量抗
体是由于特异性抗原刺激记忆细胞所致。传统的
图 7 小鼠肝细胞表达的KcNHX1的Western blot分析
　　1：蛋白质分子量标准；2：被质粒 p cD N A 3 .1 转染的小
鼠肝脏处理液；3：被质粒 pcD N A3 .1 -Kc n h x 1 转染的小鼠肝
脏处理液。
5 小鼠肝细胞表达 Kcnhx1的Western blot分析
将分别用pcDNA3.1和pcDNA3.1-Kcnhx1两种
质粒转染的小鼠肝脏处理后，用所得的抗血清对
其进行Western blot检测的结果表明，后者在分
子量60 kDa处出现一条特异性条带，前者没有(图
7)，说明 pcDNA3.1-Kcnhx1转入小鼠肝细胞后，
Kcnhx1能够在肝细胞中表达，所制备的Kcnhx1抗
血清中含有抗KcNHX1的特异性抗体。
讨 论
花花柴Na+/H+反向运输载体蛋白共 539个氨
基酸，10 个跨膜区，位于液泡膜上。与其他植
物的Na+/H+反向运输载体蛋白相同，在花花柴耐
图 6 昆明白小鼠中KcNHX1抗体水平的检测
植物生理学通讯 第 43卷 第 3期，2007年 6月528
制备抗血清的方法采用蛋白抗原或多肽抗原免疫的
方法，但首要条件是制备比较纯的抗原，而蛋白
或多肽的提取和纯化是相当烦琐和困难的。即使
将本研究中已经得到的纯融合蛋白酶切，分离
KcNHX1-C94成本也会大大增高，而且产率很
低。所以，本文借鉴核酸免疫的思路来制备抗
体，减少了一些烦琐的过程，节约了成本。
本文对 Kcnhx1进行真核表达所用的方法是
HD法。此法是在小鼠尾静脉快速注射大容量的质
粒溶液(约占小鼠体重的 8%~10%)，要求快速的
注射时间为 5~8 s，这样就能够使肝门静脉产生高
压，导致肝窦的孔径增大，肝细胞膜产生瞬时穿
孔，通透性增加，所以外源质粒就被压入肝细胞
(Zhang等 2004)。金振晓等(2002)将带有人甘露糖
结合凝集素的真核表达载体 pcDNA3-MBL用此法
导入小鼠肝脏，8 h后在血清中检测到人甘露糖结
合凝集素。贺晨霞等(2003)也用同样的方法表达
过人凝血因子 IX。用此法进行的研究很多，但
表达植物基因尚未见报道。本文对Kcnhx1进行了
真核表达，目的在于检测真核表达载体pcDNA3.1-
Kcnhx1能否在小鼠的体内表达，进而确立其作为
核酸免疫的可行性，结果证明真核表达载体
pcDNA3.1-Kcnhx1能够在小鼠的肝细胞中表达，
这对核酸免疫生产抗血清是一个验证。而传统的
方法是将真核表达载体在体外转染Hela细胞后进
行检测(Jin等 2004)，这就需要在体外培养细胞，
还要用脂质体介导。两者相比，检测的效果相
当，而前者技术难度小，实验周期短，消耗经
费少，这一点体现出很大的优越性。此外，表
达出完整的KcNHX1，可以用作抗原检测所制备
的抗体。本文用原核表达的抗原制备获得的抗
体，能够与真核表达的KcNHX1特异性结合，说
明所获抗体具有特异性。如果用天然的蛋白作抗
原检测，其效果虽然好，但由于植物液泡膜蛋白
占细胞总蛋白的比例很小，分离起来很困难。因
此用真核表达的KcNHX1与天然的KcNHX1蛋白
具有相同的抗原决定簇的特性，以之作功能蛋白
的表达检测具有其明显的优越性。因此，本文所
建立的特异性的KcNHX1抗体制备和蛋白表达检
测的新方法，为研究盐生植物功能蛋白抗体制备
提供了技术基础，同时对研究Kcnhx1钠离子区隔
化的生理过程中的基因表达定位定量可能也有意
义。
参考文献
贺晨霞, 吴文君, 丁友法, 冯登敏, 陈立, 陈浩明, 姚纪花, 沈琦, 卢
大儒, 薛京伦(2003). 尾静脉大容量快速注射法介导的人凝
血因子 IX基因在小鼠肝内的高效表达. 科学通报, 48 (5):
447~451
胡太蛟, 苏军, 胡昌泉, 陈在杰, 林天龙, 王锋(2006). 核酸免疫制
备豇豆胰蛋白酶抑制剂抗体的制备及初步应用. 福建农业学
报, 20 (2): 104~107
金振晓, 刘维永, 胡军, 胡巧霞(2002). 人甘露糖结合凝集素在小
鼠肝脏细胞内表达. 中国免疫学杂志, 18: 828~831
张霞, 曾幼玲, 叶锋, 张富春(2006). 花花柴的组织培养与植株再
生. 植物生理学通讯, 42: 692
Habel A, Chanel C, Le Grand R, Martinon F, Couillin L, Mooq C,
Doms R, Gauduin MC, Hurtrel B, Guillet JG et al (2000).
DNA vaccine protection against challenge with simian/hu-
man immunodeficiency virus 89.6 in rhesus macaques. Dev
Biol, 104 (6): 101~105
Hamada A, Shono M, Xia T, Ohta M, Hayashi Y, Tanaka A,
Hayakawa T (2001). Isolation and characterization of a
Na+/H+ antiporter gene from the halophyte Atriplex gmelini.
Plant Mol Biol, 46: 35~42
Jin HL, Li YJ, Ma ZH, Zhang FC, Xie QG, Gu DF, Wang B (2004).
Effect of chemical adjuvants on DNA vaccination. Vaccine,
22: 2925~2935
Liu F, Song YK, Liu D (1999). Hydrodynamics-based transfec-
tion in animals by systemic administration of plasmid DNA.
Gene Ther, 6: 1258~1266
Ramsay AJ, Kent SJ, Strugnell RA, Suhrbier A, Thomson SA,
Ramshaw IA (1999). Genetic vaccination strategies for en-
hanced cellular, humoral and mucosal immunity. Immunol
Rev, 171 (2): 27~44
Shi HZ, Zhu K (2002). Regulation of expression of the vacuolar
Na+/H+ antiporter gene AtNHX1 by salt stress and abscisic acid.
Plant Mol Biol, 50: 543~550
Zhang G, Gao X, Song YK, Vollmer R, Stolz DB, Gasiorowski JZ,
Dean DA, Liu D (2004). Hydroporation as the mechanism
of hydrodynamic delivery. Gene Ther, 11: 675~682