全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 6期，2007年 12月1152
收稿 2007-07-02 修定 2007-11-12
资助 国家 97 3 计划(2003CB1 14400)、国家自然科学基金
(2 05 72 05 4)和国家高等教育博士点基金。
* 通讯作者( E -ma i l：z o u x i a o m a o 1 1 1 1 @s i n a . co m，
T e l：0 2 2 -2 3 5 0 6 5 6 7；E-ma i l：nk _ y a ng hz@ 1 2 6 .
c om，T el：0 2 2 -2 3 5 0 3 7 9 9 )。
具有原卟啉原氧化酶(PPO)抑制活性的离体测定方法探讨
李华斌，李永红，刘斌，汪义丰，吴超，李斌，邹小毛 *，杨华铮 *
南开大学元素有机化学研究所，元素有机化学国家重点实验室，天津 300071
Study of Method for Measuring the Inhibition of Protoporphyrinogen Oxidase
Activity in vitro
LI Hua-Bin, LI Yong-Hong, LIU Bin, WANG Yi-Feng, WU Chao, LI Bin, ZOU Xiao-Mao*, YANG Hua-Zheng*
State Key Laboratory of Elemento-Organic Chemistry, Research Institute of Elemento-Organic Chemistry, Nankai University,
Tianjin 300071, China
提要：以玉米黄化苗为材料和除草剂S-23142 (N-[4-氯 -2-氟 -5-炔丙氧基]苯基 -3,4,5,6-四氢化邻苯二甲酰亚胺)为抑制剂，
对其抑制PPO活性的离体测定方法进行了研究和改进，并建立了一种简单而有效的离体测定方法。
关键词：原卟啉原氧化酶(PPO)；抑制剂；离体活性测定
原卟啉原氧化酶(protoporphyrinogen oxidase，
PPO，EC 1.3.3.4)的作用是将其底物原卟啉原 IX
氧化成原卟啉 IX，后者进一步参与叶绿素的生物
合成。PPO活性受抑会引起原卟啉原 IX过量积累
并自动氧化，进而原卟啉 IX 过量积累，在细胞
内引发一系列破坏性氧化而导致植物死亡(Duck等
1990)。二苯醚类除草剂和四氢邻苯二甲酰亚胺类
除草剂就是通过这种作用而达到除草效果的。
PPO通过电子转移反应，脱去原卟啉原 IX的
6个氢，将其氧化成高度共轭、红色、对光敏感
的原卟啉 IX。原卟啉原 IX不吸收可见光或者荧
光，而产物原卟啉 IX在波长 410 nm处有特征吸
收(激发光谱)，并且在波长 630 nm处有较强的发
射荧光(发射光谱)。抑制剂与底物原卟啉原 IX竞
争性地与酶活性中心结合，从而抑制 PPO转化原
卟啉原 IX成原卟啉 IX的能力。因而可以通过紫
外法或荧光分光光度法测定产物原卟啉 IX的量，
确定抑制剂的抑制率，进而确定 pI50 (Poulson和
Polglase 1975)，从而可供 PPO抑制剂的结构设计
和研究参考。Jacobs和 Jacobs (1982)报道 PPO的
性质以及紫外分光光度和荧光分光光度分析方法
后，此种方法即为人们用来测定 PPO抑制剂的活
性(Witkowak和 Halling 1989；Lee等 1993；Lee
和Duke 1994；Böger和Wakabayashi 1999)。在
已有的报道中，PPO的提取、原卟啉原 IX 的制
备以及测定方法各不相同，本文在综合这些方法
的基础上，对其进行了一些改进，以期建立一种
快速、简单而有效的方法。
材料与方法
1 材料
玉米(Zea mays L.)，品种‘纪元一号’，种
子。
2 试剂和仪器
主要试剂有：原卟啉 IX (购自 Sigma)、除
草剂 S-23142、HEPES、Tris、DTT、EDTA、
MgCl2、牛血清白蛋白(BSA)、考马斯亮蓝G-250
(coomassie brilliant blue G-250)。
主要仪器有：Biofuge® Stratos全能台式高速
冷冻离心机、960MC型荧光分光光度计、酶标
仪、pH 计、FSH-2A 可调高速匀浆机。
3 测定方法
3.1 溶液的配制 酶的提取缓冲液组成为：0.05
mol·L-1 HEPES、0.5 mol·L-1蔗糖、1 mmol·L-1 DTT、
技术与方法 Techniques and Methods
植物生理学通讯 第 43卷 第 6期，2007年 12月 1153
1 mmol·L-1 MgCl2、1 mmol·L-1 EDTA、0.2% BSA，
以KOH溶液调 pH为 7.8。溶酶缓冲液的组成为：
0.05 mol·L-1 Tris、2 mmol·L-1 EDTA、20% (V/V)
甘油，以HCl调 pH为 7.3。反应缓冲液的组成为：
0.1 mol·L-1 Tris、1 mmol·L-1 EDTA、4 mmol·L-1
DTT，以HCl调 pH为 7.5。测试缓冲液的组成为：
0.1 mol·L-1 Tris、1 mmol·L-1 EDTA、5 mmol·L-1
DTT、1% (V/V)吐温 80，以HCl调 pH为 7.8。配
制 S-23142溶液时，称量 1.5 mg S-23142，加 1 mL
二甲基甲酰胺(DMF)溶解，并加 1 mL吐温 80，
再以蒸馏水定容至 100 mL，而后稀释成所需浓
度。
3.2 反应底物的制备 配制 10 mmol·L-1 KOH的乙
醇 /水混合溶液(82% KOH 0.017 g，5 mL无水乙
醇，蒸馏水定容至 25 mL)，精确称量 4.5 mg原
卟啉 IX，用 4 mL KOH的乙醇 /水溶液溶解，再
稀释至 10 mL，避光氮气保护下，按 1.5 g·mL-1
加入 3% 钠汞齐，反应 2 h。避光氮气保护下过
滤，用 10%盐酸调 pH为 8左右，按 1:3的体积
比加入反应缓冲液，分装至样品管中，每份 1
mL，于液氮中保存(浓度约 0.1 mmol·L-1)。
3.3 标准曲线的制作 分别取 0.08 mmol·L-1的原卟
啉 I X 标准溶液 1 0、2 0、3 0、4 0、5 0、6 0、
70和 80 µL，移入 0.92~0.99 mL反应缓冲液中，
再加 2 mL测试缓冲液，总体积为 3 mL，立即
测定波长 630 nm (激发波长为 410 nm)处的发射
荧光强度。每个处理重复 3 次，取平均值。以
原卟啉 IX 浓度为横坐标，F值为纵坐标，绘制
标准曲线。以最小二乘法计算得出线性回归方
程。
3.4 PPO的提取 取暗室中培养 6~7 d的玉米黄化
苗，照光 2 h微变绿后，取地上部分剪碎后加 5
倍体积的提取缓冲液，经高速匀浆机匀浆，以
100目尼龙绸过滤后再以 800×g离心 2 min (温度
为 0 ℃)，取上清液并以 17 000×g离心 6 min (温
度为 0 ℃)。沉淀以溶酶缓冲液溶解后，即为酶
样品(-70 ℃避光保存)，操作在 0~4 ℃下进行。
3.5 蛋白质含量测定 采用改进的考马斯亮蓝法
(Bradford 1976)。取 60 mg考马斯亮蓝G-250溶于
100 mL 3%的过氯酸溶液中，滤去未溶的染料
后，置于棕色瓶中保存。以牛血清白蛋白(BSA)
为标准品作标准曲线。取 1 µL酶样品，加蒸馏
水至 200 µL，加 200 µL染液。于波长 620 nm
处比色测定吸光度。每个处理重复 3次，取平均
值。以蛋白质浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘
制标准曲线。依据标准曲线的回归方程计算酶蛋
白含量。
3.6 PPO的动力学分析 在 15 mL的具塞试管中加
入 0.80~0.89 mL反应缓冲液和 100 µL酶样品，于
30 ℃水浴中振荡 10 min后分别加入 10、20、
30、40、50和 100 µL原卟啉原 IX溶液，总体
积为 1 mL，置于 30 ℃水浴中振荡暗反应 30 min
后各加入 2 mL测试缓冲液，测波长 630 nm处的
荧光强度，以加热灭活的酶样品为空白对照，每
个处理重复 3次，取平均值。得到反应速度与底
物浓度的反应曲线。酶活性以 nmol·mg-1·h-1蛋白
表示。
3.7 反应时间的确定 选取含有 100 µL酶样品，
50 µL原卟啉原 IX溶液的反应体系，分别测定反
应 5、10、20、30和 40 min后的波长 630 nm
处的荧光强度，以加热灭活的酶样品为空白对
照，每个处理重复 3 次，取平均值。
3.8 酶对抑制剂敏感性的测定 在 15 mL的具塞试
管中加入反应缓冲液和 100 µL 5×10-7 mol·L-1的 S-
23142以及 100 µL的分别于-20 ℃和-70 ℃条件
下保存的 0 (当天测试)、1、2和 3 d的酶样品，
于 30 ℃水浴中振荡 10 min后加入 50 µL原卟啉原
IX溶液，于 30 ℃水浴中振荡暗反应 30 min。再
加 2 mL测试缓冲液后立即测定波长 630 nm (激发
波长为 410 nm)处的发射荧光强度。以加热灭活
的酶样品为空白对照。每个处理重复 3次，取平
均值。得到随酶的保存时间而变化的抑制率变化
曲线。
3.9 化合物对PPO抑制活性的离体测定 在 15 mL
的具塞试管中加入反应缓冲液和 100 µL各种浓度
的除草剂 S-23142以及 100 µL的酶样品(当日提
取)，于 30 ℃水浴中振荡 10 min后加入 50 µL原
卟啉原 IX 溶液，于 30 ℃水浴中振荡暗反应 30
min。再加 2 mL测试缓冲液后立即测定波长 630
nm (激发波长为 410 nm)处的发射荧光强度。以
加热灭活的酶样品为空白对照。每个处理重复 3
次，取平均值。
植物生理学通讯 第 43卷 第 6期，2007年 12月1154
4 方法可行性的验证
用上述方法测定我们自行设计合成的新化合物
1~8的抑制活性。此外，还用盆栽法作了验证，
即在直径 8 cm的塑料小杯中放入一定量的土，加
入一定量的水，播种[分别是稗草(Echinochloa
crusgalli)、油菜(Brassica campestris)、马唐
(Digitaria sanguinalis)和反枝苋(Amaranthus
retroflexus)等 4种种子]后覆盖一定厚度的土壤，
于花房中培养，幼苗出土前以塑料覆盖。每天加
定量的清水以保证正常植物生长。在幼苗一叶一
心期叶面喷施药剂。20 d后测定地上部鲜重，以
鲜重受抑百分数表示药效。并与 PPO抑制活性进
行比较。
实验结果
1 酶的特性
1.1 酶蛋白质含量 由图 1计算出的酶蛋白质浓度
为 15.0 mg·mL-1，与文献中的 33 mg·mL-1 (Ishida
等 2000)比较接近。
1.2 Km和vm 在测定反应速度(v)随底物浓度(S)而变
化时，根据图 2的标准曲线，由测定的荧光强度
求出底物的转化速度 v [nmol·mg-1 (蛋白)·h-1]，然后
根据Lineweaver-Burk作图(双倒数)，得到图 3。求
得Km=1.23 µmol·L-1，vm=2.49 nmol·mg-1 (蛋白)·h-1。
1.3 反应时间的确定 如图 4所示，在选取的反应
体系中(100 µL酶溶液，50 µL原卟啉原 IX)，30
min以内的反应速度基本是恒定的，在这段时间
内，产物的累积与反应时间基本上成正比关系，
反应速度呈一级反应，而 30 min后，反应速度
趋于平缓，因而以 30 min为反应时间。
图 2 原卟啉 IX标准曲线
图 4 酶促反应速度曲线
1.4 酶对抑制剂的敏感性 从图 5可见，酶对抑制
剂的敏感性随着时间进程呈下降趋势，在-20 ℃
图 5 随着时间进程而变化的抑制率
图 3 双倒数曲线
图 1 BSA的标准曲线
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条件下保存的酶对抑制剂的敏感性下降更快，经
过 3 d后，5×10-8 mol·L-1的 S-23142对 PPO的抑
制率下降 26.6%，而酶在 -70 ℃条件下保存时，
抑制率只下降 5.4%。
2 S-23142对酶的抑制活性
根据图 6，求出 pI50=8.95，与文献中的 8.97
(Böger和Wakabayashi 1999)基本一致。
(1) PPO的准备，用暗室中培养 6~7 d的玉
米黄化苗为材料，其叶中 PPO 含量较多，PPO
酶活性也较高(Ishida等 2000)。用两次离心法：
先以 800×g离心 2 min除去植物碎片，上清液经
17 000×g离心 6 min，所得沉淀即为粗酶，毋需
进一步纯化，以溶酶缓冲液溶解后可直接用于测
试。常用方法以提取缓冲液溶解酶蛋白(Jacobs和
Jacobs 1982；Lee和Duke 1994)，这样得到的酶
样品经加热灭活处理后出现大量沉淀，干扰吸光
度测定，本文采用的溶酶缓冲液中加有 20%的甘
油，既不影响酶活性，且加热灭活时产生的沉淀
能重新溶解，不会影响吸光度的测定，重复性
好，可信度高。
(2)缩小反应体系，所有测试都是在 1 mL体
系中进行，这就减少了酶和底物的用量。确定的
反应时间为 30 min，这可以避免原卟啉原 IX自氧
化发生，从而提高了测试的灵敏度和可重复性。
(3)用盆栽法(茎叶处理)验证方法的可行性，
抑制剂对杂草活性的抑制可直接反映化合物的除草
活性，以及离体条件下 PPO的 pI50反映抑制剂与
酶蛋白的结合能力，此二指标的良好相关性说明
离体测试方法可以直接用于新化合物初步筛选，
和可快速而简便的了解化合物的潜在除草活性，
从而缩短了新农药研制的周期。
根据我们的经验，操作中有以下几点值得
注意：(1)原卟啉原 IX的制备是关键，如果还原
得不好，就会略带浅褐色。通常采用钠汞齐进
行还原，钠汞齐的制备尤为重要。制备钠汞齐
的关键就是应彻底清洗汞和彻底清除钠表面的氧
化物(Jacobs和 Jacobs 1982)。同时还有很多因素
也影响原卟啉 IX的还原，如氮气保护、光照强
度、温度、湿度、搅拌速度、p H 值等，操作
时也应注意。(2)制备成的原卟啉原 IX 分装好后
放在液氮中保存，至少可以保存 6个月而不影响
使用。酶对抑制剂的敏感性会随着时间进程呈下
降趋势，- 20 ℃下保存的此种趋势更明显，而
在 -70 ℃下保存时，酶对抑制剂的敏感性下降很
慢，显示提取的酶可以用液氮保存。(3)不同玉米
品种的酶浓度、活性和对抑制剂的敏感性可能有
差异，这时可重新选择酶和底物之间的比例和用
量，用来测定抑制剂的抑制率和 pI50，如果用 pI50
图 6 S-23142的浓度的负对数及其与抑制率的关系
图 7 pI50与抑制率的相关性
3 方法可行性的验证
用此法测定我们自行设计合成的新化合物1~8
的 pI50，并通过盆栽测定的活体抑制率进行相关
性分析，相关性较好(图 7 )。
讨　　论
所有的有关 PPO 抑制剂的离体活性测定方
法，对材料的选择、酶的提取和纯化、原卟啉
原 IX 的制备、测试体系的大小、酶及底物的浓
度等都不相同。为了建立一种快速、简单和有效
的离体活性测定方法，本文对这些方法作了如下
改进。
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进行抑制剂结构与活性关系的计算时，则必须确
保所有的数据都是来自同一个品种的玉米。(4)暗
反应时，需保证恒温(30 ℃)和恒定的振荡速度(75
r·min-1)。反应 30 min后立即取出，置于冰水浴
中，并加磨口塞，这样可以大大降低酶继续氧化原
卟啉原 IX的活性，从而保证所测数据的可靠性。
总之，经过如上改进后的方法操作简单而方
便，测得除草剂 S-23142的值与文献中报道的基
本上一致，因而可行、可靠。我们用此法筛选
自行合成的新化合物 100余个，测得 pI50值的有 8
个。盆栽实验中所测得的结果与离体方法测得的
结果相关性较好，因此认为可用于筛选化合物和
测定 pI50。
参考文献
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