全 文 ：植物生理学通讯 第41卷 第3期，2005年6月358
南方红豆杉的苯丙基转移酶异源表达和抗体制备
仇燕1 曹红2 王刚2,*
1 河北科技大学生物科学与工程学院，石家庄 050018；2 河北师范大学生命科学学院，石家庄 050016
Heterologous Expression of Phenylpropanoyltransferase in Taxus chinensis
var. mairei and Preparation of Its Antibody
QIU Yan1, CAO Hong2, WANG Gang2,*
1College of Biological Science and Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China; 2College
of Life Science, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050016, China
提要 构建了紫杉醇生物合成途径中连接紫杉醇主链 bac Ⅲ与侧链 C-13 O 的苯丙基转移酶原核表达载体，并在大肠杆菌
中表达了这种蛋白，以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰兔，获得了高效价(1∶102 400)抗体。免疫印迹检测表明，制备
的抗体具有较高的特异性。
关键词 南方红豆杉；苯丙基转移酶；抗体
收稿 2004-10-17 修定 　2005-01-24
资助 河北省自然科学基金(300162)。
*通讯作者(E-mail: qiu-yan-yan77@sohu.com，Tel:
0311-8632163)。
紫杉醇(taxol)是红豆杉分泌的一种天然产物，
对多种癌症具很好的疗效[1]。其天然产量极低，
目前化学全合成的成本较高，还不具商业生产的
可行性[2]，因而生物合成仍占主导地位。我们在
研究红豆杉细胞次生代谢途径中发现中间产物bac
Ⅲ大量积累[3,4]，这可能是C-13 O侧链与bacⅢ结
合处的酶——苯丙基转移酶(baccatinⅢ:3-amino-3-
phenylpropanoyltransferase, BAPT)表达量低而造成
的。我们采用 RT-PCR 方法已克隆到南方红豆杉
中该酶的 cDNA 全长[5]。本文以纯化的 BAPT 融合
蛋白为抗原制备抗体，以期能用此抗体对植物细
胞中BAPT 进行定量和生理功能分析。
材料与方法
大肠杆菌 DH5a由我室保存，表达质粒 pET-
28b(+)及表达宿主菌BL21(DE3)由本校细胞生物学
实验室赠送。重组质粒 pGEM-BAPT(1)(pGEM-T
easy Vector+BAPT cDNA 成熟蛋白编码区)由我室
构建[5]。质粒 pGEM-T easy Vector购自 Promega
公司，限制性内切酶 NdeI 和 BamHI、Taq DNA
聚合酶及 IPTG 购自 TaKARa 公司，T4 DNA 连接
酶购自 Promega 公司，RNA 酶及 X-gal 购自鼎国
公司。丙烯酰胺(Acr)及甲叉双丙烯酰胺(Bis)为
Bebco 公司产品，过硫酸铵(AP)及四甲基乙二氨
(TEMED)购自 Sigma 公司。标准 DNA 分子量购自
华美公司，低分子量标准蛋白由中国科学院上海
生物化学研究所研制。H I S 亲合层析柱购自
Novagon 公司，小量胶回收试剂盒为上海华舜公
司产品，其余试剂为国产分析纯。
经 OMI G A 软件分析设计，引物由赛百盛公
司合成。为了便于基因重组，在引物分别导入
NdeI 和 BamHI 酶切位点。
构建和鉴定BAPT表达载体时，以插入BAPT
cDNA 全长片段的质粒 pGEM-BAPT(1)为模板，
P1、P2 为引物进行PCR 扩增。反应条件为：94℃
预变性3 min；94℃变性 20 s，55℃退火 30 s，
72℃延伸1.5 min，35个循环；72℃延伸10 min。
将扩增片段酶切后插入到表达载体 pET-28b(+)
中，转化大肠杆菌 BL21(DE3)并筛选获得阳性克
隆，进行序列测定。
诱导和纯化 BAPT 融合蛋白时，取含重组质
粒pET-BAPT的大肠杆菌BL21(DE3)在含卡那霉素
(10 mg·mL-1)的LB液体培养基中37℃下培养过夜，
次日按 2% 接种量转接，37℃培养至 OD600=0.6~
0.8，IPTG (终浓度 1 mmol·L-1)诱导 4 h。在 4℃
下以10 000×g 离心 10 min，收集经IPTG 诱导的
菌体，以100 mL菌液∶40 mL 1×Binding缓冲液
(40 mmol·L-1咪唑、4 mol·L-1 NaCl、160 mmol·L-1
Tris-HCl，pH 7.9)的比例重悬菌体；超声破碎(超
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声5 s后以间隔25 s，15次，功率400 W)，5 000×g
离心15 min；收集的沉淀以20 mL 1×Binding 缓
冲液(包含20 mL溶菌酶50 mg·L-1)孵育5~10 min，
按上述条件再次超声破碎5次后以5 000 ×g离心15
min；最后以5 mL 1×Binding缓冲液(含6 mol·L-1
尿素)重悬沉淀，冰浴1 h 以溶解蛋白。4℃下以
16 000×g离心 30 min，上清液以0.45 mm滤膜过
滤，4℃下存放。按Novagen 用户手册的方法，用
HIS 亲合层析柱纯化重组BAPT 蛋白。
BAPT抗体制备和检测参照文献6的方法略有
改动，蛋白样品经SDS-PAGE分离后，用含3 mol·
L-1 KCl 的显色液显色，直至出现明显的蛋白条带
(约 5 min)，切下相应分子量大小的蛋白带，放
于 -20℃中保存。采用电洗脱技术将目的蛋白(抗
原)从凝胶中洗脱出来，置于低温冰箱(-40℃)中
保存备用。
动物免疫步骤为：(1)初次基础免疫(0 d): 2.0
mL 0.1 mg·L-1 抗原加等体积的福氏完全佐剂，混
匀后注射于腹股沟皮下及后脚掌；(2)二次基础免
疫(16 d): 2.0 mL 0.06 mg·L-1抗原加等体积的福氏
不完全佐剂，混匀后注射于腹股沟皮下及后脚
掌；(3)加强免疫(36 d): 1.0 mL 0.6 mg·L-1抗原加
等体积的福氏不完全佐剂，混匀后注于腹股沟及
背部皮下多点；(4)第 3 次免疫后第5天耳静脉采
血，分离血清，测定效价；(5)若效价符合要求，
则进行颈动脉采血，所采兔血于室温放置
2 h后转入4℃中；(6)室温下以10 000× g离心10
min，吸取抗血清分装存于 -20℃中备用。
采用ELISA法测定抗血清效价；用Western-
blot检测抗血清的特异性：以纯化的融合蛋白为
材料，一抗稀释度为 1∶2 000，用碱磷酶检测。
实验结果
1 BAPT表达载体的构建
以测序正确的 pGEM-BAPT(1)为模板，用引
物P1和P2扩增得到1 338 bp左右的DNA片段(图
1)，连接至pET-28b(+)原核表达载体中，再转化
至大肠杆菌(E. coli) BL21(DE3)中进行测序，结
果与文献5一致。抽提质粒DNA，经NdeI与BamHI
双酶切鉴定的外源插入片段(图2)与预期片段大小
相符，重组表达载体命名为 pET-BAPT。
2 BAPT蛋白的纯化
IPTG 诱导使 pET-BAPT 融合蛋白表达。SDS-
PAGE 电泳的结果表明：融合蛋白在 BL21(DE3)
中经 IPTG 诱导有很强的表达，其分子量约为 51
kD (图 3中箭头所指)。诱导表达的pET-BAPT 细
菌全蛋白样品按前述方法经 HIS 亲合层析纯化，
洗脱收集液经SDS-PAGE分离检测的结果(图 4)显
示，各收集管中除了 BAPT 的主要条带外，还有
其它一些微弱的蛋白条带。
3 BAPT抗体制备及效价的测定
考虑到上述实验未能获得高纯度的pET-BAPT
重组蛋白，因此将细菌蛋白经 SDS-PAGE 电泳，
KCl显色后寻找到BAPT 融合蛋白的位置，切下来
并经电洗脱后测定其浓度用于抗血清制备。
图1 PCR 扩增 BAPT 成熟蛋白编码区蛋白片段
1 ：P C R 产物；M ：标准 D N A 分子量。
图2 重组质粒pET-BAPT的酶切鉴定
　　1、2：酶切pET-BAPT；3：PCR 产物；4：pET-28b(+)
载体；M ：标准 D N A 分子量。
图3 融合蛋白诱导表达的SDS-PAGE分析
　　1：诱导后pET-28b(+)总蛋白；2：未诱导的pET-BAPT 总蛋
白；3~5：诱导后的pET-BAPT 总蛋白；M：标准蛋白质分子量。
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新西兰大白兔经融合蛋白 3 次免疫后采血，
制备抗血清。ELISA 检测结果表明，抗血清效价
达1∶102 400。图 5显示，在第1次免疫后第16
天检测到抗体的产生，抗体效价从第 36~41 天迅
速升高，第 41 天时抗体效价达到 1∶102 400，
颈动脉采血，分离血清。
4 抗血清特异性检测
采用免疫印迹检测抗血清特异性的结果(图6)
表明，非诱导 pET-BAPT 及免疫前血清均无特异
性条带，诱导后 pET-BAPT 检测到了 BAPT 条带
(图6中箭头所指)，说明本实验中制备的抗体仅与
BA P T 结合，为 BA P T 的特异性抗体。
讨　　论
随着基因工程技术的发展，人们愈加可以通
过蛋白质异源表达的方法为生产和研究提供蛋白质
多肽。大肠杆菌以其易于操作、遗传背景清楚、
发酵成本低和蛋白表达水平高等优点成为生产重组
蛋白的首选表达系统。本文将克隆到的带有合适
酶切位点的BAPT 基因与经 NdeI 与 BamHI 酶切的
表达质粒 pET-28b(+)连接，将其转化到宿主菌
BL21(DE3)中，经培养、诱导、纯化等一系列程
序得到所需要的目的蛋白。
宿主 BL21(DE3)经 IPTG 诱导后，提取全蛋
白，SDS-PAGE 分析表明，在43.0~66.2 kD 之间
有一强表达蛋白条带，而未经诱导的菌体蛋白则
没有，因而可以初步确定此条带为目的融合蛋
白。由于重组蛋白具有 HIS 标签的结构，HIS 亲
和柱分离纯化得到分子量约 51 kD 的蛋白，经证
明此蛋白确为 BAPT 融合蛋白。但由于蛋白纯度
和含量均较低，因此采用 SDS-PAGE 分离切割目
的蛋白再用电洗脱方法可以获得纯度和含量均较高
的融合蛋白，即抗原。融合蛋白免疫新西兰兔
后，可以制备得到抗 BAPT 融合蛋白的抗体，以
ELISA 检测抗体效价为 1∶102 400。免疫印迹方
法检测显示，抗体具较高的特异性，这为以后研
究红豆杉细胞 BAPT 生理功能和转 BAPT 基因细胞
的Western检测提供了可能。
参考文献
1 Alexander RW. Teasing apart the taxol pathway. Trends
Biochem Sci, 2001, 26:152
2 Wildung MR, Croteau R. A cDNA clone for taxadiene
synthase, the diterpene cyclase that catalyzes the commited
step of taxol biosynthesis. J Biol Chem, 1996, 270:
9201~9204
3 庄晓蕾. 红豆杉细胞培养中紫杉醇代谢调节机理的研究 [硕
士学位论文]. 石家庄：河北师范大学, 2003
4 贾宁, 仇燕, 王丽等. 南方红豆杉细胞培养中紫杉醇代谢调
节的研究. 河北师范大学学报, 2003, 27(3): 295~297
5 仇燕, 王刚. 紫杉醇合成代谢途径中苯丙基转移酶cDNA的
克隆. 应用与环境生物学报, 2004, 10(1): 43~45
6 丁存宝, 毛国红, 孙大业. 白芷细胞外钙调素结合蛋白(ECBP21)
免疫组化及金标定位分析. 实验生物学报, 2004, 37: 22~26
图 4 融合蛋白分离提纯的SDS-PAGE分析
　　1：pE T- 2 8 b ( + )诱导后蛋白；2：诱导后的 pE T- B A P T
蛋白；3 ~ 6：分别为洗脱收集部分；M：标准蛋白质分子量。
图5 抗体产生的时间进程　
图6 BAPT融合蛋白抗血清的Western检测
　　1~3：BAP T 抗血清检测。1：未诱导 pET-BAP T；2、3：
诱导后 pET - B A P T。4、5：分别为免疫前血清检测诱导及非
诱导 p E T - B A P T 。M ：标准蛋白质分子量。