全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 3期，2007年 6月430
盐胁迫下朝鲜碱茅的甜菜碱醛脱氢酶活性变化及其基因保守区的克隆
杨铮 1，钟鸣 1,*，郭志富 1，李丽 1，陈罡 2
1沈阳农业大学，辽宁省农业生物技术重点实验室，沈阳 110161；2辽宁省林业科学研究院生物中心，沈阳 110032
提要：文章探讨了朝鲜碱茅甜菜碱醛脱氢酶活性在盐胁迫下的变化，用简并引物扩增了甜菜碱醛脱氢酶基因保守区序列
的结果表明，该保守区段长438 bp，推测编码145个氨基酸，包括醛脱氢酶高度保守序列V[T/S]LELGGKSP和其后29位
与酶功能有关的 Cys。此序列Genbank登录号为 EF095710。
关键词：朝鲜碱茅；盐胁迫；甜菜碱醛脱氢酶(BADH) ；简并引物；保守区；同源性
Change in Betaine Aldehyde Dehydrogenase Activity of Puccinellia chinampoensis
Ohwi and Cloning of Its Conserved cDNA Region under Salt Stress
YANG Zheng1, ZHONG Ming1,*, GUO Zhi-Fu1, LI Li1, CHEN Gang2
1Key Laboratory of Agriculture Biotechnology of Liaoning Province, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China;
2Forest Biotechnology Center, Liaoning Academy of Forertry Sciences, Shenyang 110032, China
Abstract: Change in betaine aldehyde dehydrogenase (BADH) activity of Puccinellia chinampoensis under sall
stress was explored and the conserved sequence of BADH was amplified using degenerate primers. The results
demonstrated that the conserved sequence was 438 bp in length, which was deduced coding 145 amino acids.
The deduced products contained the conserved motif of aldehyde dehydrogenase which was V[T/S]LELGGKSP
and the Cys associated with aldehyde dehydrogenase function. The gene accession nucleotide sequence num-
ber in GenBank was EF095710.
Key words: Puccinellia chinampoensis; salt stress; betaine aldehyde dehydrogenase; degenerate primers; con-
served cDNA region; homology
收稿 2006-12-29 修定 　2007-05-08
资助 辽宁省重点实验室专项资金和辽宁省博士启动基金(辽
宁省科委 20 01 10 20 61 )。
* 通讯作者(E-mail：zhming@syau.edu.cn；Tel：024-
8 8 4 8 7 1 6 4 )。
朝鲜碱茅为禾本科牧草，广泛分布于我国东
北、华北和西北地区的草原、辽河平原及碱湖周
围，具有较强的耐盐碱、耐旱和耐寒性，是我
国三北地区改良盐渍土地的优良先锋植物(徐恒刚
2003)。与其它盐生植物一样，朝鲜碱茅在体内
大量积累甜菜碱进行渗透调节是其适应不良环境的
一个有效机制(梁峥等 1991)。甜菜碱醛脱氢酶
(betaine aldehyde dehydrogenase，BADH)是高等植
物体内合成甜菜碱的关键酶(Sakamoto和Murata
2000)，大多数耐盐植物体内的BADH活性均随着
盐浓度的升高而增加(McCue 和 Hanson 1992；陈
鹏和潘晓玲2001；Arakawa等1990)。自Weretilnyk
和Hanson (1990)克隆菠菜全长 BADH基因至今，
人们已相继在甜菜、辽宁碱蓬、大麦、玉米等
多种藜科和禾本科植物中分离鉴定了这一基因
(McCue和Hanson 1992；白杰英等 2003；Yu等
2004；何晓兰等 2004；Nakamura等 2001；李
秋莉等 2006；Li等 2003；Li和 Zou 2002；Oishi
和 Ebina 2005)。本文在研究朝鲜碱茅BADH活性
与盐浓度相关趋势的基础上克隆 BADH基因保守
区 cDNA，并对其作了分析。
材料与方法
朝鲜碱茅(Puccinellia chinampoensis Ohwi)草
种由内蒙古民族大学农学院提供，种子消毒后播
于已灭菌的沙床中，以1/2Hoagland营养液浇灌培
养。幼苗长至五叶一心时，改用 1/2Hoagland营
养液水培，缓苗 1周后进行 NaCl胁迫处理。以
无 NaCl胁迫的样品为对照，共 9个处理，NaCl
胁迫浓度分别为 5 0、1 0 0、1 5 0、2 0 0、2 5 0、
300、350、400 mmol·L-1。为了避免刺激，NaCl
植物生理学通讯 第 43卷 第 3期，2007年 6月 431
浓度每隔 3 d递增 50 mmol·L-1直至终浓度。终浓
度处理 3 d后分别取样置于超低温冰箱中保存待
测。
BADH的提取与活性测定参考刘凤华等(1997)
文中和《现代植物生理学实验指南》(中国科学院
上海植物生理研究所和上海市植物生理学会编
1999)的方法，略有改动。于 28 ℃条件下用日立
U-3010型分光光度计测定340 nm处30 min内吸光
值变化。按公式酶比活性[nmol·mg-1 (蛋白)·min-1]=
∆OD×10-3/(emax×C)×109计算酶活性。式中，∆OD
为每分钟增加的平均吸光值；e为NADH摩尔消
光系数(6200) ；C为加入酶量。
根据BADH活性测定的结果，确定酶活性最
高时的对应NaCl浓度，提取此种胁迫浓度下的样
品总 RNA。采用 TIANGEN生物工程公司生产的
RNAplant试剂提取总 RNA，以 1.2%琼脂糖电泳
检测总 RNA的完整性，紫外分光光度计法确定
RNA的纯度。cDNA第一链的合成采用赛百盛生
物工程公司的 RT-easy go试剂盒。引物设计参照
才华等(2006)文中的方法，利用DNAMAN生物软
件对已报道的 BADH氨基酸序列进行比较分析，
参照禾本科植物中(白杰英等 2003；Yu等 2004；
Nakamura等 2001；Oishi和 Ebina 2005；其他信
息来自GenBank数据库)该酶靠近 3端两段同源性
高的区域(VKPVSLE、EEVFGPV)及对应的核苷酸
序列，用引物设计软件 Primer 5.0设计上、下游
简并引物，BF：5 GGTTAAGCCTGTTTCATT-
AGAGC 3 ；BR：5 ACTGG(T/A/C)CCAAAGACTT-
CCTC 3。引物由赛百盛生物工程公司合成。
以反转录得到的第一链 cDNA为模板，BF、
BR为上下游引物进行 PCR扩增。扩增条件：先
94 ℃预变性5 min；然后进入循环反应即 94 ℃ 50 s，
60 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，循环 38次；最后 72
℃延伸 8 min。产物经 1.2%的琼脂糖凝胶电泳检
测，用 TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit
Ver 2.0回收纯化目的片段。回收产物与大连宝生
物生物工程公司 pMD18-T载体连接成重组子，转
化 Escherichia coli DH5α感受态细胞，通过 PCR
和酶切鉴定阳性克隆，测序由上海生工生物工程
公司完成。
利用DNAMAN软件对测序结果进行氨基酸序
列翻译，并将测序结果与预测的蛋白序列分别通
过NCBI-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)程序
和DNAMAN软件进行同源性比对分析，确定克隆
的序列为 BADH基因的保守区序列。将得到的朝
鲜碱茅 BADH保守区 cDNA序列递交NCBI网站
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。
采用半定量RT-PCR对不同NaCl浓度下朝鲜
碱茅BADH基因的表达进行分析。在0~400 mmol·L-1
NaCl浓度处理 3 d后取样提取总 RNA，反转录成
cDNA作为模板保存待测。根据获得的 BADH基
因保守区设计特异引物，P1：5 GGTTAAGCC-
TGTTTCATTAGAGC 3；P2： 5 ACTGGACC-
AAAGACTTCCTC 3。反应体系及程序同前，扩
增循环次数减至 30次。根据 18S rRNA设计引物
作为内参，片段为 2 2 0 b p。P 3：5 G A A -
GTTTGAGGCAATAACAGGT 3；P4：5 AAA-
GGGCAGGGACGTAGTC 3。反应程序为：94 ℃
预变性 5 min；94 ℃ 50 s，55 ℃ 1 min，72 ℃
2 min，循环 30次；72 ℃延伸 8 min。
实验结果
1 朝鲜碱茅BADH活性的变化
如图 1所示，朝鲜碱茅BADH活性在无NaCl
处理中为 0.24 nmol·mg-1 (蛋白)·min-1，以后随着
NaCl浓度的增大逐渐上升；当NaCl浓度达到300
mmol·L-1时，酶活性达到最大值，是无NaCl处理
酶活性的 3倍；当NaCl浓度超过 300 mmol·L-1时，
酶活性开始下降。
图 1 NaCl胁迫下朝鲜碱茅BADH活性的变化
Fig.1 Change in BADH activity of P. chinampoensis
under NaCl stress
植物生理学通讯 第 43卷 第 3期，2007年 6月432
2 朝鲜碱茅总RNA的质量检测
以 1.2%琼脂糖检测RNA的完整性，RNA基
本未降解，比较完整。用日立 U-3010型分光光
度计检测 RNA的吸光值，A260/A280=1.89，符合纯
RNA溶液A260/A280介于 1.7~2.0之间的要求，表明
采用此法得到的总RNA纯度较高。从纯度和完整
性两方面分析，此 RNA符合试验要求。
3 朝鲜碱茅BADH基因保守区的克隆与序列分析
以 cDNA为模板，BP1、BP2为引物进行PCR
扩增，获得 1条大于 400 bp的特异条带，在 1 200
和 800 bp处分别有 2条不明显的非特异条带(图 2)
可能是由于简并引物的非特异性造成。克隆 PCR
产物并对克隆后的片段测序的结果表明，此片段
长 438 bp，编码 145个氨基酸(图 3)。推测的蛋
白序列包含有十肽醛脱氢酶高度保守序列V[S/T]
LELGGKSP和其后 29位与酶功能有关的Cys，前
人的的研究认为，这些保守区包含酶的催化位点
和NAD+结合位点(Weretilnyk 和Hanson 1990；
McCue和Hanson 1992；Ishitani等1995；González-
Segura等 2002，2005)。
4 朝鲜碱茅BADH氨基酸序列的同源性分析
搜索GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.
gov)，用DNAMAN生物软件将朝鲜碱茅BADH推
演的氨基酸保守区序列与其它物种的BADH氨基酸
序列进行同源性比对的结果表明，该序列与短芒
大麦(Hordeum brevisubulatum)、羊草(Leymus
chinensis)、细叶结缕草(Zoysia tenuifolia)、菠菜
(Spinacia oleracea)、甜菜(Beta vulgaris)的同源性
分别为 90.34%、89.66%、83.45%、75%和 73.61%。
结合序列分析和同源性比较结果可以初步认定该序
列为朝鲜碱茅 BADH cDNA的保守区序列。该保
守区核苷酸序列已在 N C B I 登录，登录号为
EF095710。在同源性比较中(图 4)，发现朝鲜碱茅
BADH氨基酸序列中醛脱氢酶高度保守序列V[S/T]
LELGGKSP第2位是S与大多数禾本科植物一致，
而在藜科和苋科中我们发现，该位点以 T的形式
存在居多( L i 和 Zou 2 0 0 2；白杰英等 2 0 0 3；
Nakamura等 2001；Oishi和 Ebina 2005；Ye等
图 2 朝鲜碱茅的 BADH基因保守序列电泳
Fig.2 Agarose electrophoresis of amplification of the BADH
conserved sequence from P. chinampoensis
　　1：2 0 0 bp D N A 标准分子量；2：朝鲜碱茅 BAD H 基
因保守序列扩增产物。
图 3 朝鲜碱茅 BADH基因保守区的核苷酸序列及推导的氨基酸序列
Fig.3 Conserved nucleotides and deduced amino acid sequences of BADH from P. chinampoensis
第一行斜体部分表示醛脱氢酶高度保守序列及与酶功能有关的 c ys 位点；方框部分表示引物设计位点。
植物生理学通讯 第 43卷 第 3期，2007年 6月 433
2005；Yu等 2004)。
5 朝鲜碱茅BADH基因的表达分析
半定量RT-PCR结果显示：在 0~400 mmol·L-1
NaCl胁迫下，朝鲜碱茅体内 BADH基因均有表
达。当NaCl浓度达到 250~350 mmol·L-1时，基
因受NaCl胁迫的诱导最明显(图 5)，与酶活性测
定结果一致。
们选择了禾本科植物中醛脱氢酶常见的S 取得了理
想的结果，扩增了朝鲜碱茅 BADH基因的保守区
序列，并且最保守的醛脱氢酶十肽序列中的第 2
位氨基酸为 S。在氨基酸的分类中，T与 S同属
于脂肪族和不带电荷的极性氨基酸，他们的结构
和化学性质相近，在酶的功能中二者的差异应该
不会造成影响，但可能会造成物种间酶活性的差
异，这一点需进一步验证。T和 S出现在不同植
物中的醛脱氢酶保守十肽序列中可能是进化过程中
不同种属之间进化途径不同。
参考文献
白杰英, 陆一鸣, 庞晓斌, 李彦舫(2003). 盐胁迫短芒大麦甜菜碱
醛脱氢酶基因片段的克隆与序列分析. 内蒙古民族大学学报
(自然科学版), 18 (1): 38~41
才华, 朱延明, 李杰, 柏锡, 李勇(2006). 野生大豆 CDPK基因保守
区的克隆及序列分析. 东北农业大学学报, 3 7 (2 ): 1 59 ~
164
陈鹏, 潘晓玲(2001). 干旱和NaCl胁迫下梭梭幼苗中甜菜碱含量
和甜菜碱醛脱氢酶活性的变化. 植物生理学通讯, 37 (6 ):
520~522
何晓兰, 侯喜林, 吴纪中, 刘桂华, 钦佩, 朱卫民(2004). 三角叶滨藜
甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因的克隆及序列分析. 南京农业
大学学报, 27 (1): 15~19
李秋莉, 张毅, 尹辉, 李丹(2006). 辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶基因
(BADH)启动子分离及序列分析. 生物工程学报, 22 (1): 77~81
梁峥, 赵原, 李浴春, 邹喻苹, 骆爱玲, 黄巨富(1991). 菠菜甜菜碱醛
脱氢酶基因对甜菜碱醛的氧化. 植物学报, 33 (9): 680~686
刘凤华, 郭岩, 谷冬梅, 肖岗, 陈正华, 陈受宜(1997). 转甜菜碱醛脱
氢酶基因植物的耐盐性研究. 遗传学报, 24 (1): 54~58
徐恒刚主编(2003). 中国盐生植被及盐渍化生态治理. 北京: 中
国农业科学技术出版社, 244~245
杨铮, 钟鸣, 张丽(2006). 甜菜碱合成途径及其在基因工程育种中
的应用. 分子植物育种, 4 (3S): 67~72
中国科学院上海植物生理研究所, 上海市植物生理学会编(1999).
图 4 朝鲜碱茅 BADH保守区氨基酸序列与其它物种该基因氨基酸同源性的比较
Fig.4 Comparison of partical amino acids between P. chinampoensis and other species
第 1 条序列为实验获得的朝鲜碱茅 BA D H 部分氨基酸序列；方框为高保守区内的差异位点。
图 5 朝鲜碱茅 BADH基因的表达分析
Fig.5 Analysis of BADH expression from P. chinampoensis
讨　　论
甜菜碱是植物体内的渗透调节物质之一，也
是检测植物抗盐能力的指标之一，有人认为盐胁
迫下甜菜碱在植物体内大量积累并行使渗透调节及
分子伴侣的功能(Nomura等 1998；杨铮等 2006)。
BADH是甜菜碱合成途径的关键酶，Arakawa等
(1990)提出大麦BADH酶活性伴随着盐胁迫浓度的
增加而增大，当NaCl浓度达到 200 mmol·L-1时，
酶活性是未加NaCl的 3倍。其后有人分别在甜菜
和梭梭的研究中验证了BADH活性与盐浓度成正相
关(McCue和Hanson 1992；陈鹏和潘晓玲 2001)。
本文结果与此一致。
本文上游引物跨越醛脱氢酶保守十肽区 V
[S/T]LELGGKSP，在设计引物时通过对前人研究
结果以及GenBank的相关信息进行分析比对，我
植物生理学通讯 第 43卷 第 3期，2007年 6月434
现代植物生理学实验指南. 北京: 科学出版社, 127~128
Arakawa K, Katayama M, Takabe T (1990). Levels of betaine and
betaine aldehyde dehydrogenase activity in the green leaves,
and etiolated leaves and roots of barley. Plant Cell Physiol,
31: 797~803
González-Segura L, Velasco-García R, Munoz-Clares RA ( 2002).
Modulation of the reactivity of the essential cysteine resi-
due of betaine aldehyde dehydrogenase from Pseudomonas
aeruginosa. Biochem J, 361: 577~585
González-Segura L, Velasco-García R, Rudiño-piñera E, Mújica-
Jiménez C, Muñoz-Clares RA (2005). Site-directed mutagen-
esis and homology modeling indicate an important role of
cysteine 439 in the stability of betaine aldehyde dehydroge-
nase from Pseudomonas aeruginosa . Biochimie, 87 (12):
1056~1064
Ishitani M, Nakamura T, Han SY, Takabe T (1995). Expression
of the beta ine aldehyde dehydrogenase gene in barley in
response to osmotic stress and abscisic acid. Plant Mol Biol,
27 (2): 307~315
Li QL, Gao XR, Yu XH, Wang XZ, An LJ (2003). Molecular
cloning and characterization of betaine aldehyde dehydroge-
nase gene from Suaeda liaotungensis and its use in improved
tolerance to salinity in transgenic tobacco. Biotechnol Lett,
25 (17): 1431~1436
Li YH, Zou Q (2002). The sequence of Triticum aestivum betaine
aldehyde dehydrogenase gene WBADH. J Plant Physiol Mol
Biol, 28 (6): 495~496
McCue KF, Hanson AD (1992). Salt-inducible betaine aldehyde
dehydrogenase from sugar beet: cDNA cloning and expression.
Plant Mol Biol, 18 (1): 1~11
Nakamura T, Nomura M, Mori H, Jagedorf AT, Ueda A, Takabe T
(2001). An isozyme of betaine aldehyde dehydrogenase in
barley. Plant Cell Physiol, 42: 1088~1092
Nomura M, Hibino T, Takabe T, Sugiyama T, Yokota A, Miyake
H, Takabe T (1998). Transgenically produced glycinebetaine
protects ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase
from inactivation in Synechococcus sp. PCC7942 under salt
stress. Plant Cell Physiol, 39: 425~432
Oishi H, Ebina M (2005). Isolation of cDNA and enzymatic prop-
erties of beta ine a ldehyde dehydrogenase from Zoysia
tenuifolia. J Plant Physiol, 162: 1077~1086
Sak a moto A, Mu ra ta N (2 0 00 ) . G enet ic engineering of
glycinebetaine synthesis in plants: current status and impli-
cations for enhancement of stress tolerance. J Exp Bot, 51
(342): 81~88
Weretilnyk EA, Hanson AD (1990). Molecular cloning of a plant
betaine aldehyde dehydrogenase, an enzyme implicated in
adaptation to salinity and drought. Proc Natl Acad Sci USA,
87 (7): 2745~2749
Ye CJ, Wu SW, Yang QK, Ma CZ, Yang GS, Wang B (2005).
Cloning, sequencing and salt induced expression of PEAMT
and BADH in oilseed rape (Brassica naps). DNA Seq, 16:
364~371
Yu AL, Xu JSH, Zhou H, Zhang MQ, Chen RK (2004). Cloning
and sequencing of BADH gene from maize (Zea mays). Mole
Plant Breed, 2 (3): 365~368