全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第4期，2006年8月612
水稻悬浮细胞系的建立及培养条件对生物产量的影响
徐林林1 芦笛2 陆巍2,* 张荣铣2 杨清1,*
南京农业大学生命科学学院1 分子生物学实验室，2 光合作用实验室，南京 210095
提要 在附加 2,4-D 的 MS 培养基上诱导水稻‘中花 11’的愈伤组织，并用 AA 培养基建立了胚性悬浮细胞系。改变 AA
培养基中氮源、肌醇及 2,4-D 浓度的结果表明，5 mg·L-1 2,4-D、100 mg·L-1 肌醇和 150% AAN (AAN 为 AA 培养基中的氮
源浓度)悬浮细胞系的生物产量最高。
关键词 水稻细胞；悬浮细胞系；生物产量；培养基
Establishment of Suspension Cell Line of Rice (Oryza sativa L.) and Effects
of Different Media on Biomass
XU Lin-Lin1, LU Di2, LU Wei2,*, ZHANG Rong-Xian2, YANG Qing1,*
1Molecular Biology Laboratory, 2Photosynthesis Laboratory, College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing
210095, China
Abstract Callus of Oryza sativa L. cv. ‘Zhonghua 11’ were induced on MS medium with different concentra-
tions of 2,4-D and the suspension cell line was established in AA medium. The combinations of nitrogen, inosite
and 2,4-D levels were set up to investigate their effects on the biomass production of rice cv. ‘Zhonghua 11’
suspension cell in AA medium. The results showed that the highest biomass measurement was obtained on the
optimized medium with 5 mg·L-1 2,4-D, 100 mg·L-1 inosite and 150% AAN.
Key words rice cell; suspension cell line; biomass; culture medium
收稿 2005-12-12 修定 　2006-05-19
资助 国家科技部作物转基因专项基金(JY-03-A-11)和南京农
业大学 SRT 项目(0506A08)。
*通讯作者(E-mail: luw@njau.edu.cn, Tel: 025-84395423)。
植物细胞悬浮培养(cell suspension culture)在
现代生物学研究中有着广泛的应用，研究者们在
已有的水稻悬浮培养研究(杨金水等1979；赵成章
等1981；叶和春1984)基础上建立了许多水稻品
种的悬浮细胞系( 林拥军等 1 9 9 5 ；向太和等
1996；王俊丽和宋陆铧 1999；袁力勇等 2003；
王忠安 2005)。‘中花 11’是通过花药培养育成
的品种，在组织培养和基因转化中有较多的研究
和应用(谢道昕等1991；张玲等2002；王爱民等
2005)，但用AA培养基(Toriyama和Hinata 1985)
将其建立成可体外连续培养的悬浮细胞系，并通
过改变培养条件提高悬浮细胞系生物产量的研究还
未见报道。本文建立了稳定的‘中花 1 1’悬浮
细胞系，并找出可以提高其生物产量的培养条
件，可供今后的细胞学和分子生物学研究者参考。
材料与方法
实验材料为粳稻(Oryza sativa L.)‘中花
11’，由中国农业科学院作物研究所于 1989 年用
花药培养技术育成。亲本为(‘京丰 5 号’×
‘T e t e p’) ב福锦’；其中‘京丰 5 号’和‘福
锦’为日本粳稻改良品种，‘Tet e p’是越南地
方品种(金润州2001)。
诱导愈伤组织的培养基为 MS 培养基，加 3%
蔗糖、0.8% 琼脂、0~5 mg·L-1 2,4-D，pH 5.8，
121℃高温高压湿热灭菌20 min；28℃暗培养。悬
浮培养基为 MS 液体培养基和 AA 培养基，加 3%
蔗糖、3和 5 mg·L-1 2,4-D，pH 6.0，121℃高温
高压湿热灭菌20 min，AA培养基中谷氨酰胺溶液
用0.22 mm 微孔滤膜过滤灭菌；28℃下回旋振荡
(120 r·min-1)，暗培养。
诱导愈伤组织时，取‘中花 11’成熟种子
研究报告 Original Papers
植物生理学通讯 第42卷 第4期，2006年8月 613
人工去皮，经70%酒精表面消毒1 min后再以40%
次氯酸钠溶液避光浸泡30 min，无菌水冲洗5遍，
接种在附加0~5 mg·L-1 2,4-D的 MS培养基上。20
d 后，统计愈伤组织个数，计算愈伤组织诱导率
(诱导率=愈伤组织个数/接种外植体数)。在诱导
的培养基上，愈伤组织每 20 d 继代 1 次，观察
继代过程中 2,4-D 对愈伤组织褐化和分散性的影
响。
将培养 4 个月的愈伤组织转移到液体培养基
中悬浮培养，每瓶培养基为 50 mL，接种愈伤组
织为 1 g，初期继代用 200 目不锈钢筛过滤，10
代后直接倾倒1/3原培养物至新培养基。用AA培
养基建立悬浮细胞系并测定培养物的密实体积和细
胞干重(中国科学院上海植物生理研究所和上海市
植物生理学会1999)。用双醋酸盐荧光素(FDA)染
色法鉴定细胞活力，用丙酮制备 0.5% 的 FDA 贮
液，加入量至终浓度为 0 . 0 1 %，室温下作用 5
min，荧光显微镜下观察。产生荧光的是有活力
的细胞，不产生荧光的是死细胞(中国科学院上海
植物生理研究所和上海市植物生理学会1999)。细
胞活力以发绿色荧光的活细胞数占总观察细胞数的
百分比表示。
进行影响生物产量因素实验时，增加 25%、
不变、减去 25% AA 培养基中的基本氮源(AAN，
包括天冬氨酸、甘氨酸、精氨酸和谷氨酰胺，这
4种氨基酸浓度同比例改变)、肌醇和2,4-D，组
合为3×3×3，共27种(即表1中组合编号为1~27);
进行提高氮源浓度对生物产量影响实验时，基本
氮源、肌醇和 2,4-D 的浓度如表 1 中组合编号为
28~33 所示。
悬浮培养物以 2 000×g 离心，弃去上清液，
取1 g鲜重培养物接种到表1中不同组合的培养基
里，于同样条件下培养。4 d 后，以 2 000×g 离
心收集培养物，于 60℃下烘干至恒重，并称干
重。生物产量的增加以干重增长率=干重增长量/
接种干重 ×100% 计算。所有实验均重复 3 次，用
SPSS 10.0软件中的Duncan’s测验对所得数据进行
单因素方差分析，并用Excel 2000软件进行计算
制成图表，图中具有相同小写字母者为a=0.05水
平差异不显著，不同者为差异显著。
结果与讨论
1 愈伤组织的诱导
接种于诱导培养基上的去皮水稻种子，7 d后
胚部位开始膨大和形成愈伤组织。20 d后，不加
2,4-D的不能诱导出愈伤组织；加1~5 mg·L-1 2,4-
D的培养基上均诱导出不同颜色和质地的愈伤组织
(表 2)。加 3 mg·L-1 2,4-D 的诱导率最高，但结
构紧密，不利于悬浮培养；加 5 mg·L-1 2,4-D 诱
表1 不同培养基中2,4-D、肌醇和基本氮源的浓度
Table 1 Concentrations of 2,4-D, inosite
and nitrogen in different medium
组合编号 基本氮源浓度 肌醇浓度/ 2,4-D浓度/ (AAN)/% mg·L-1 mg·L-1
1 75 75 3.75
2 75 75 5.00
3 75 75 6.25
4 75 100 3.75
5 75 100 5.00
6 75 100 6.25
7 75 125 3.75
8 75 125 5.00
9 75 125 6.25
10 100 75 3.75
11 100 75 5.00
12 100 75 6.25
13 100 100 3.75
14 100 100 5.00
15 100 100 6.25
16 100 125 3.75
17 100 125 5.00
18 100 125 6.25
19 125 75 3.75
20 125 75 5.00
21 125 75 6.25
22 125 100 3.75
23 125 100 5.00
24 125 100 6.25
25 125 125 3.75
26 125 125 5.00
27 125 125 6.25
28 75 100 5.00
29 100 100 5.00
30 125 100 5.00
31 150 100 5.00
32 175 100 5.00
33 200 100 5.00
A A N ：A A 标准培养基中的天冬氨酸、甘氨酸、精氨酸
和谷氨酰胺的浓度。
植物生理学通讯 第42卷 第4期，2006年8月614
导的愈伤组织结构较为松散，呈小颗粒状，符合
悬浮培养的要求。
2 愈伤组织的继代培养
将愈伤组织在诱导的培养基上继代。前几代
中各培养基上都有褐化现象，但程度不同，随着
继代次数的增加，褐化率都逐渐减少或消失；不
同培养基上愈伤组织的分散性随着继代次数的增加
而有明显差异(表 3)。
因此认为，以氨基酸为唯一氮源的AA培养基附加
5 mg·L-1 2,4-D 更适合于建立水稻‘中花11’的
悬浮细胞系。
一般认为，悬浮细胞体系中细胞密实体积是
细胞生长情况的反映，而细胞干重在一定程度则
反映细胞的质量(杨远媛等2005)，因此我们以干
重增长率(即生物产量)衡量培养条件对悬浮细胞系
的影响。将1 g 鲜重培养物接种在 50 mL 液体培
养基中悬浮培养，水稻悬浮细胞的密实体积和干
重变化均呈“S 形”，明显分为 3 个阶段即延迟
期(0~2 d)、指数生长期(3~4 d)和静止期(5~6 d)
(图 1)。指数生长期的悬浮细胞分散性好，活力
高，活细胞占 80% 以上(图 2)。在整个生长周期
中，悬浮细胞生长速度较快，4 d 时的干重增长
近1倍，第5天生长开始变慢，死亡率开始升高，
因此我们认为悬浮培养的较好继代时间为4 d。
表2 不同浓度2,4-D对愈伤组织诱导率的影响
Table 2 Effects of different concentrations of
2,4-D on callus induction
2,4-D浓度/mg·L-1 愈伤组织数/个 诱导率/%
0 0 0
1 9 30
2 16 53
3 22 73
4 13 43
5 8 27
接种的外植体数均为 30 个。
表3 不同浓度2,4-D 对愈伤组织褐化及分散性的影响
Table 3 Effects of different concentrations of 2,4-D on
browning rates and disperse of callus
2,4-D浓度/ 褐化率/% 分散性
mg·L
-1
第1次继代 第6次继代
1 27 7 差
2 23 3 差
3 17 0 差
4 27 3 较好
5 30 0 最好
分散性好是指愈伤组织结构疏松，呈细小颗粒状，放到液
体培养基中后，轻轻摇动三角瓶，小颗粒状愈伤可很快分散
开。接种的外植体数均为 3 0 个。
向太和等(1995)根据悬浮细胞系建立过程中细
胞状态的变化，把胚性悬浮细胞系建立过程划分
为前期、中期和后期。前期细胞为长条形、不
规则形、近椭圆形，具有明显的大液泡，细胞
质透明。中期细胞为椭圆形，细胞团周缘细胞的
细胞质透明，具有明显的大液泡；而中央部位细
胞的细胞质较浓厚，颗粒状内含物较丰富。后期
细胞为椭圆形，细胞质浓厚，无明显的液泡，颗
粒状内含物丰富；后期细胞系为胚性悬浮细胞
3 悬浮细胞系的建立
悬浮细胞系建立的关键是挑选适合于悬浮培
养的愈伤组织和选用合适的液体培养基。将继代
在加3和 5 mg·L-1 2,4-D的 MS 固体培养基上的愈
伤组织转移到附加3和 5 mg·L-1 2,4-D的 MS和 AA
液体培养基中，MS 液体培养基中的愈伤组织生长
都很缓慢，且不分散开。而 AA 液体培养基中的
愈伤组织生长旺盛，颗粒细小，分散性好，尤
其是加5 mg·L-1 2,4-D的生长更快，分散性更好。
图 1‘中花 11’悬浮细胞的生长
Fig.1 Growth of suspension cells of
O. sativa cv. ‘Zhonghua 11’
植物生理学通讯 第42卷 第4期，2006年8月 615
图2 ‘中花 11’悬浮细胞系
Fig.2 The suspension cell line of O. sativa cv. ‘Zhonghua 11’
a: 普通光下悬浮细胞; b: 经蓝光激发，发出荧光的活细胞; c: 高倍镜下的悬浮细胞; d: 高倍镜下发出荧光的活细胞。
图3 不同浓度2,4-D对生物产量增长率的影响
Fig.3 Effects of different concentrations of 2,4-D
on the biomass increase
图4 不同浓度肌醇对生物产量增长率的影响
Fig.4 Effects of different concentrations of inosite
on the biomass increase
系，适合于进行原生质体培养。他们用这样的胚
性悬浮细胞制备原生质体进行培养，得到了以胚
状体形式再生的植株。本文中的悬浮细胞系是每
4 d 继代 1 次，经过多次继代培养后，‘中花 11’
悬浮系中的细胞团大小和细胞形态已趋于稳定。
细胞团是由几个到几十个细胞组成，细胞形态与
向太和等(1995)对后期胚性悬浮细胞系的描述相似
(图 2-c、d)，可能是胚性悬浮细胞系。
4 不同培养基对悬浮细胞系生物产量的影响
图 3~ 5 显示：
(1) 2,4-D浓度从3.75 mg·L-1升高到5 mg·L-1
时，干重增长率随之提高；当 2,4-D 浓度增加到
6.25 mg·L-1 时，干重增长率都下降。6.25 mg·L-1
2,4-D的干重增长率在75% AAN时的比3.75 mg·L-1
2,4-D 的高，在 100% AAN 和 125% AAN 时的比
3.75 mg·L-1 2,4-D的低(图3)。
(2)随着肌醇浓度的增加，在 AAN 为 75% 和
100% 时，干重增长率增加。但 AAN 为 125% 时，
干重增长率不受肌醇浓度变化的影响(图 4)。
(3) AAN 为 75%~125% 时，干重增长率都随
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着氮源浓度增加而增加。当2,4-D为5 mg·L-1，肌
醇为 100 mg·L-1 时，氮源浓度提高到 150% AAN
时的干重增长率达到高峰，175% AAN 时的干重
增长率则开始下降，200% AAN 时的干重增长率
比 75% AAN 时的还低(图 5)。
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图5 不同浓度氮源对生物产量增长率的影响
Fig.5 Effects of different concentrations of nitrogen
on the biomass increase
总之，不同种类和不同品种植物细胞培养的
最佳培养条件不同。本文建立的可体外连续培养
的稳定‘中花 1 1’悬浮细胞系，以培养基中附
加5 mg·L-1 2,4-D、100 mg·L-1 肌醇和150% AAN
为最适合，可以得到较高的生物产量。