全 文 ：软加工成枫斗 ;而 F型铁皮石斛居群的植株因其茎
杆柔软可被加工成铁皮枫斗。
优质的铁皮枫斗味甘富粘性 ,被传统认为是枫
斗药材的上乘品质特征。经过观察 ,铁皮石斛的粘性
成分属基本组织细胞中的多糖类成分。前人通过研
究认为石斛多糖具有显著的养阴生津功效 [3 ]。 F型
居群铁皮石斛的茎杆粗壮柔软 ,细胞含有丰富的粘
性多糖成分 ,因此 ,由它加工成的铁皮枫斗具增强人
体免疫功能、防癌抗癌、恢复嗓音等显著功效 [ 4] ,价
格昂贵。 H型铁皮石斛 ,虽不适宜加工成铁皮枫斗 ,
但因其细胞中也含有一定的淀粉及少量多糖成分而
被民间煮水饮服 ,具有一定的功效且价格便宜 ,在开
发利用时应予以重视。
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银杏悬浮细胞系选育及继代培养中银杏内酯合成稳定性研究
刘佳佳 1 ,江文辉 1 ,郭　勇 2 ,郑穗平 2
( 1. 中南大学 中药现代化研究中心 岳麓校区 ,湖南 长沙　 410083;　 2. 华南理工大学食品与生物工程学院 ,广东
广州　 510641)
摘　要: 目的　选育高产银杏内酯悬浮细胞系 ,并对其在继代培养过程中银杏内酯 B合成的稳定性进行研究。方法
以银杏优良品种的种子萌发幼苗诱导愈伤组织 ,考察了不同培养基对愈伤组织生长和银杏内酯 B产生的影响 ,采
用缺氧胁迫法从诱导的愈伤组织中选育高产银杏内酯 B悬浮细胞系 ,并进行驯化培养。结果　选出了 7个细胞系 ,
其合成银杏内酯 B的能力比选育前的愈伤组织有了显著提高 ,其中细胞系 M H-3培养周期 18 d,细胞生物量增加
3. 71倍 ,银杏内酯 B含量达到 302μg /g DW ,比选育前提高了 172. 7% ,为国内领先水平。 在摇瓶培养时其合成银
杏内酯的能力稳定 ,连续培养 6代 ,银杏内酯 B的平均含量为 291μg /g DW ,变异系数为 0. 131。结论　采用该路线
选育的银杏悬浮细胞系银杏内酯 B产量高 ,在继代培养过程中合成代谢较稳定。
关键词: 银杏内酯 ;悬浮细胞系 ;继代培养 ;稳定性
中图分类号: R282. 13　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 09 0831 04
Selection ofGinkgo biloba cell line for suspension culture and
studies on stability of ginkgolide B in subculture
L IU Jia-jia1 , JIANG Wen-hui1 , GUO Yong2 , ZHENG Sui-ping2
　　 ( 1. Centr e of T raditional Chinese Medicine Mode rnization, Central-South Univ er sity , Chang sha Hunan 410083, China;
2. Colleg e o f Food Engineering and Bio tech no lo gy , South China Univ e rsity o f Technolog y , Guang zhou Guangdong 510641,
China)
Abstract: Object　 To select the cell line of Ginkgo biloba L. tha t may produce high yield o f ginkgolide
B ( GB) in suspension cul ture and to study the stabili ty of GB in subcul ture. Methods　 Calculus w as in-
duced wi th stem , roo t and leaf o f selected eli te species and high yield suspension cel l lines chosen by hy-
poxia st ress. Results　 Seven suspension cell lines wi th improved yield of GB w ere obtained. Among which
cell line M H-3 gave a 3. 71 fo ld increase of cellular bioproduct wi th an increased content up to 302μg /g
·831·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 9期
收稿日期: 2000-10-27基金项目:广东省自然科学基金 (No. 990865)和中南大学科研基金资助项目作者简介:刘佳佳 ( 1963-) ,男 ,工学博士 ,副教授。从事天然产物的研究与开发。研究方向:次生代谢物的代谢调控与结构修饰 ,活性成分的筛选与提取分离工艺。 Tel: ( 0731) 8836125
DW after cul turing for 18 d, a leading record country w ide. In shaking bot t le culture, i t show ed a consis-
tent yield o f GB w ith a content of 291μg /g DW in 6 successiv e subcul tures, co ef ficient of v aria tion=
0. 131. Conclusion　 The suspension cell line selected by hypoxia st ress gave a higher yield and stabi li ty in
successiv e transfer cul ture.
Key words: ginkgolide B ( GB) ; suspension cell lines; subculture; stabili ty
　　银杏叶中所特有的银杏内酯 ( ginkgolides,
GK)是血小板活化因子 ( PAF)受体的特异拮抗剂 ,
对治疗心脑血管疾病、哮喘、内毒素休克 ,增强人体
免疫力、抑制器官移植的排异反应有较好的效果 [1 ] ,
具有广阔的市场前景 ,但含量极低。为满足市场需
要 ,科学工作者对银杏内酯的化学合成进行了研究 ,
1988年 Corey[2 ]报道了银杏内酯的全合成 ,但步骤
复杂 ,很难工业化生产。 为此 , Carrier等 [3 ]在 90年
代初就开始细胞培养生产银杏内酯的研究 ,国内的
于荣敏、戴均贵等 [4, 5 ]也开始了细胞培养生产银杏内
酯的研究 ,银杏悬浮细胞培养物中银杏内酯的含量
达到 0. 009 9% 。实现细胞大规模培养生产银杏内酯
的关键技术之一是要有银杏内酯生产能力强、性状
稳定的悬浮细胞系。为此 ,从 1997年开始 ,我们进行
本项研究并已取得良好进展。
1　材料与方法
1. 1　实验材料: 选用银杏优良品种桐子果 Ginkgo
biloba cv. Tongziguo、梅核Ⅰ 号 Ginkgo biloba cv.
Meihe、小佛手 Ginkgo biloba cv . X iaofushou实生苗
当年生根、茎、叶作为诱导愈伤组织的外植体 ,接种
于含 3%蔗糖、 1%琼脂、 3. 0 mg /L 2, 4-D、 0. 5 mg /
L KT的 M S培养基上 ,于恒温培养箱中 25℃、黑
暗条件下诱导 , 30 d后转入继代培养基上进行继代
培养。
1. 2　愈伤组织的培养:选择 M S、 B5、 SH和 White 4
种常用培养基 ,考察其对银杏愈伤组织生长和银杏
内酯 B合成的影响 ,每种培养基添加 3%的蔗糖、
1%琼脂、 3. 0 mg /L 2, 4-D、 0. 4 mg /L K T,于恒温
培养箱中 25℃ ,每天 24 h光照培养 , 18 d继代 1
次 ,从第 5代开始连续测定 3代愈伤组织的生长指
数、状态、银杏内酯 B含量。
1. 3　胁迫法选育高产银杏内酯悬浮细胞系:选育流
程如下: 已 6次继代的愈伤组织转入加玻璃珠的
MS液体培养基 ,培养 5 d后捞出转入 MS固体培养
基 ,每瓶植板 20个左右的小细胞团 ,培养 10 d后加
玻璃纸密封 ,培养 5 d后挑出存活的细胞团转入新
的 MS固体培养基进行增殖培养 ,培养过程中挑出
与细胞团颜色结构不一致的细胞 ,继代 4次后 ,转入
MS液体培养基进行驯化培养 ,形成分散性良好的
银杏悬浮细胞系 测银杏内酯 B含量并与愈伤组
织中的含量进行比较。
1. 4　愈伤组织和细胞生长参数的测定:以干重为生
长指标 ,结果为 5个平行试样的平均值 ,生长指数=
(收获细胞量- 接种细胞量 ) /接种细胞量。
1. 5　 HPLC测银杏内酯 B含量:取 5 g左右的银杏
干燥细胞 ,用 50%的乙醇抽提 2次 ,共 1 h,定容至
100 mL,用石油醚脱脂 4次 ,用乙酸乙酯萃取 5次 ,
合并乙酸乙酯萃取液 ,减压浓缩蒸干 ,残渣用 2%二
甲亚砜-甲醇在温热条件下溶解 , HPLC测定方法参
照文献 [6 ]。
2　结果与讨论
2. 1　培养基和外植体对愈伤组织生长和银杏内酯
B含量的影响: 当外植体根、茎、叶接种于附加 3
mg /L 2, 4-D和 0. 5 mg /L K T的 MS培养基上 ,诱
导愈伤组织后 ,分别在 M S培养基上继代 5次。根、
茎的愈伤组织诱导率高 ,生长速度较快 ,而叶片的愈
伤组织诱导率低 ,愈伤组织其组织结构较松软、黄白
色、生长缓慢 ,从第 5代开始生长势转弱 ,开始出现
黑色坏死。因此只选择根、茎诱导的愈伤组织分别接
种在 M S、 B5、 White、 SH培养基上 ,连续继代 5次 ,
每次周期 18 d,结果如表 1。培养基的不同影响愈伤
组织的生长和银杏内酯 B的合成: White培养基既
不利于愈伤组织的生长 ,使愈伤组织结块变硬 ,生长
缓慢 ,又不利于银杏内酯的合成 ,愈伤组织中银杏内
酯含量低 ; M S培养基有利于形成分散性良好 ,结构
松软的愈伤组织 ,但银杏内酯的含量低 ; B5、 SH培养
基上愈伤组织生长较快 ,且对银杏内酯的合成有利 ,
但结构较致密 ,分散性不好。不同来源的愈伤组织其
生长速度和银杏内酯 B的含量有差异 ,来源于根的
愈伤组织中银杏内酯含量高于来源于茎的愈伤组
织 ,不同品种间愈伤组织的生长速度和银杏内酯含
量有差异。愈伤组织的结构与状态影响银杏内酯的
含量 ,愈伤组织结构松软、分散性好 ,不利于银杏内
酯的合成 ,因此在培养过程中控制培养物的生长状
态能促进银杏内酯的合成。愈伤组织在继代过程中
其生长速度和银杏内酯含量不稳定 ,变异系数 (代与
·832· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 9期
代之间的差异程度: s /x )为 0. 04～ 0. 21,愈伤组织
在生长特性、银杏内酯 B合成的差异及在继代过程
中的不稳定性有利于选择出生长速度快、银杏内酯
含量高的悬浮细胞系。 因为外植体细胞在诱导培养
条件下脱分化形成具有分生能力的薄壁细胞 ,在这
个过程中容易产生突变细胞 ,通过定向增加选择压
能提高突变率和挑选出适应选择压的细胞系。
2. 2　悬浮细胞系的生长特性和银杏内酯 B合成能
表 1　培养基对愈伤组织生长和银杏内酯合成的影响
培养基 品种 外植体 生长指数 指数变异系数 ( s /x ) 银杏内酯 B含量 (μg /g) 含量变异系数 ( s /x )
M S 桐子果 茎 3. 51 0. 11 70± 7. 7 0. 11
根 3. 11 0. 07 110± 19. 8 0. 18
梅核 1号 茎 3. 05 0. 15 60± 4. 2 0. 07
根 2. 86 0. 14 110± 13. 2 0. 12
小佛手 茎 3. 08 0. 08 70± 10. 5 0. 15
根 3. 26 0. 13 120± 19. 2 0. 16
B5 桐子果 茎 3. 36 0. 08 130± 7. 8 0. 06
根 2. 86 0. 14 190± 20. 9 0. 11
梅核 1号 茎 2. 83 0. 12 190± 26. 6 0. 14
根 3. 06 0. 07 250± 52. 5 0. 21
小佛手 茎 3. 16 0. 14 170± 20. 4 0. 12
根 3. 01 0. 13 210± 39. 9 0. 19
SH 桐子果 茎 3. 20 0. 11 140± 21. 0 0. 15
根 2. 95 0. 09 190± 22. 8 0. 12
梅核 1号 茎 3. 02 0. 13 150± 10. 5 0. 07
根 2. 78 0. 06 210± 25. 2 0. 12
小佛手 茎 2. 86 0. 14 180± 18. 0 0. 10
根 2. 56 0. 12 250± 37. 5 0. 15
Whi te 桐子果 茎 1. 85 0. 07 30± 3. 3 0. 11
根 1. 63 0. 12 70± 10. 5 0. 15
梅核 1号 茎 1. 55 0. 04 40± 3. 2 0. 08
根 1. 68 0. 06 60± 6. 0 0. 10
小佛手 茎 1. 64 0. 04 60± 8. 4 0. 14
根 1. 73 0. 08 80± 8. 8 0. 11
力比较:由于幼根诱导的愈伤组织银杏内酯合成能
力高于幼茎诱导的愈伤组织 ,而在 B5、White、 SH培
养基上连续继代培养的愈伤组织结构致密 ,分散性
差 ,不能用于选育悬浮细胞系 ,因此选择在 MS培养
基上继代培养的幼根诱导的愈伤组织 ,按缺氧胁迫
小细胞团法选育悬浮细胞系 ,对选出的细胞系进行
8代次的扩大和驯化培养 ,淘汰生长慢的细胞系 ,共
选出 7个细胞系 ,其中桐子果 2个、梅核 3个、小佛
手 2个 ,分别命名为 TZG-1、 TZG-2、 M H-1、 M H-2、
MH-3、 X FS-1, X FS-2,它们的生长特性、银杏内酯
含量如表 2。 选择效益是指选出的悬浮细胞系在生
长特性和银杏内酯含量等方面比原来愈伤组织的提
高程度 ,计算公式为选择效益 (% )= 100× (悬浮细
胞系值 -愈伤组织值 ) /愈伤组织值。从表 2看出 ,选
出的悬浮细胞系细胞的生长速度比原来的愈伤组织
提高幅度不大 ,最好的细胞系 M H-1也只比原来的
愈伤组织提高 35. 7% ,但银杏内酯的合成能力显著
提高 , M H-3中的银杏内酯含量在培养周期结束时
比原来的愈伤组织提高了 172. 7% ,达到细胞干重
的 0. 030% ,因此缺氧胁迫小细胞团法是一种有效
的选育高产银杏内酯悬浮细胞系方法。
2. 3　细胞系悬浮培养细胞生长和银杏内酯合成动
表 2　银杏悬浮细胞系与愈伤组织的生长特性和银杏内酯 B( GB)含量比较
项目 TZG-1 TZG-2 M H-1 M H-2 M H-3 XFS-1 XFS-2
细胞系生长指数 3. 52 4. 13 3. 88 3. 02 3. 71 3. 78 3. 34
愈伤组织生长指数 3. 11 3. 11 2. 86 2. 86 2. 86 3. 26 3. 26
生长指数选择效益 13. 2　 32. 8　 35. 7　 5. 6　 29. 8　 16. 0　 2. 5　
细胞系 GB含量 (μg /gDW) 250± 18. 5 210± 25. 6 280± 41. 5 190± 20. 9 302± 3. 6 230± 25. 3 210± 18. 9
愈伤组织 GB含量 (μg /gDW) 110± 19. 8 110± 19. 8 110± 13. 2 110± 13. 2 110± 13. 2 120± 18. 5 120± 19. 2
GB含量选择效益 (% ) 127. 1 90. 9 154. 5 72. 7 172. 7 91. 7 75. 0
力学研究: 在选出的银杏细胞系中 , M H-3的银杏内
酯生产能力最强 ,在后续的研究中以此为实验材料 ,
MH-3生长和银杏内酯积累的动力学研究结果如图
1。 结果表明细胞接种后经过 6 d左右的缓慢生长
期 ,随即生长明显加快 ,生物量显著增加 ,在第 18天
时生物量达到最大 ,细胞干重为 15. 3 g /L ,比细胞
·833·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 9期
接种量增加了 3. 65倍。接着是细胞的缓慢生长期 ,
细胞在这一时期生物量略有下降。细胞中 GKB的
含量在接种后的 3～ 6 d略有下降 , 12～ 18 d是银杏
内酯的快速积累期 ,第 18天细胞中的银杏内酯含量
最高 ,达到 302μg /gDW ,之后至第 21天含量略有
下降。 因此在以后的研究中 ,细胞的收获期不超过
20 d。
2. 4　继代悬浮培养过程中银杏内酯 B合成稳定性
研究:在悬浮培养过程中 ,很多植物细胞由于形态分
化受到抑制和染色体发生变异 ,使目的产物含量降
低甚至消失 ,如红豆杉中的紫杉醇 ,随着继代次数的
增加 ,紫杉醇的含量迅速降低 ,因而建立具有高而稳
定的目的产物的细胞系是实现细胞大规模培养生产
次生代谢物的关键之一。我们对细胞系 MH-3进行
了连续 6代的继代培养 ,结果如表 3。在继代培养过
1-银杏内酯 B　 2-生物量
图 1　悬浮培养时细胞生长和银杏内酯合成
时间进程
程中 ,细胞的生长指数和银杏内酯含量没有随继代
次数的增加而明显下降 ,其变异系数分别为 0. 073
和 0. 131,性状表现稳定。
采用缺氧胁迫小细胞团法从愈伤组织中选育高
表 3　细胞系 MH-3继代培养的稳定性
继代次数 1 2 3 4 5 6 平均值 X 变异系数 ( s /x)
生长指数 3. 68 4. 16 3. 46 3. 78 4. 01 3. 52 3. 77 0. 073
GB含量 (μg /gDW) 340± 45. 2 260± 31. 2 280± 22. 4 310± 34. 3 320± 48. 0 240± 26. 4 291± 38. 1 0. 131
产银杏内酯细胞系取得明显效果 ,选出的细胞系生
产银杏内酯 B的能力比原来的愈伤组织有了显著
提高 ,且其生产能力在继代过程中表现稳定 ,在细胞
悬浮培养过程中银杏内酯合成代谢的优化控制将另
文报道。这些研究为今后实现银杏细胞大规模培养
生产银杏内酯打下了良好基础。
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5S-rRNA基因间区序列变异用于金银花药材道地性研究初探
李　萍 ,蔡朝晖 ,邢俊波
(中国药科大学 生药学教研室 ,江苏 南京　 210038)
摘　要: 目的　研究金银花药材道地性形成的基因基础。方法　用 SDS法提取金银花 Lonicera japonica不同居群、
外类群细毡毛忍冬 L . similis和山银花 L . conf usa的总 DN A,进行 5S-rRN A基因间区的 PCR扩增和测序 ,并用软
件 Mega进行分析。结果　 Lonicera L. 属植物 5S-rRN A基因间区约 210 bp,其中 G+ C含量较高 ,达 70%左右 ,不
同居群的 L . japonica碱基序列有差别 ,通过测序可以进行鉴别。 L . conf usa与 L . japonica间的遗传距离较大。结论
　种间 5S-rRN A基因间区的序列差异大于种内 ;道地药材之间的遗传距离较小 ;道地与非道地药材之间的遗传距
·834· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 9期
收稿日期: 2000-12-04基金项目:国家自然科学基金重点项目 ( 39730500) ,教育部优秀教师资助计划项目 ,江苏省“ 333”工程项目资助作者简介:李　萍 ( 1960-) ,女 ,辽宁大连人 ,教授 ,博士生导师 ,理学博士 ,国家有突出贡献的中青年专家。 1982年毕业于辽宁中医学院中药系 , 1988年毕业于中国药科大学生药学专业 ,获得博士学位。 1992年任副教授 , 1995年破格晋升为教授。主要研究方向:中药材的品种鉴定、质量评价及活性成分研究。 Tel: ( 025) 5322256　 Fax: 025-5322448　 E-mail: lipingli@ publicl. p tt . js. cn