全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第2期，2006年4月 291
快速克隆DNA 大片段的方法
徐淑红1 闫玉清1 曲敏1,2 李新玲1 徐香玲1,*
1 哈尔滨师范大学生物系，哈尔滨 150080；2 哈尔滨商业大学食品工程学院生物系，哈尔滨 150010
Fast Method for Cloning DNA Big Fragments
XU Shu-Hong1, YAN Yu-Qing1, QU Min1,2, LI Xin-Ling1, XU Xiang-Ling1,*
1Department of Biology, Harbin Normal University, Harbin 150080, China; 2Department of Biology, Food Engineeing College,
Harbin Commerce University, Harbin 150010, China
提要 文章采用菌落 PCR 的技术，快速扩增发根农杆菌 Ri 质粒 rol (包括 rolA、rolB、rolC)基因的 DNA 片段并用于测序
分析。克服了由于 Ri 质粒过大，提取困难等问题。
关键词 菌落 PCR；Ri 质粒；rol 基因
收稿 2005-11-04 修定 　2006-02-20
资助 黑龙江省教育厅项目(10531071)和黑龙江省自然科学基
金攻关课题(23010339052239、C2004-51)。
*通讯作者(E-mail: xxl8761@126.com, Tel: 0451-86840570)。
发根农杆菌中的Ri质粒约为250 kb，由于Ri
质粒过大，在克隆其功能基因 rol (包括 rolA、
rolB、rolC) (戴均贵和朱蔚华1999)时，用常规方
法提取质粒 D N A 费时且成功率低。经过反复摸
索，我们采用菌落PCR的技术从Ri质粒中克隆大
片段DNA (包括rolA、rolB、rolC基因)的方法快
速、简便，达到预期的实验目的。现报道如下：
材料与方法
发根农杆菌为 pRi1724，培养基为 YEB。克
隆rol基因的引物为：P1 (5端引物)，5 CGGATCC-
GCTAACAGCACTTCTTTTATTCTC 3 (下划线为
BamHI 位点); P2 (3 端引物)，5 ACGAGCTC-
GCTACTGCCATCACTCCATTCC 3 (下划线为 SacI
位点)。ExTaq 酶、dNTP、l-EcoT14 Ⅰ marker
购于宝生物工程(大连)有限公司。引物由上海申
能博彩生物工程公司合成。PCR 扩增仪为 PTC-
100 (MJ，美国)，离心机为贝克曼64R (美国)。
pRi1724模板采用3种：(1) YEB固体培养基
上28℃静置培养约10 h 未经任何处理的单菌落，
菌落大小为0.1~0.4 cm之间，用灭菌的枪头沾取
部分菌落溶于1 mL无菌水中；(2)将单菌落加入20
mL 0.1%的Triton-X100煮沸2 min，3 300×g离心
5 min，取上清液；(3)单菌落经YEB振荡培养10 h，
生长至对数生长期，浓度为OD600 值 0.3~0.5的菌
液。PCR 反应体系为：模板 DNA 1 mL、10× 缓
冲液2.5 mL、2.5 mmol·L-1 dNTP 2 mL、引物 P1
(10 mmol·L-1) 1 mL、引物P2 (10 mmol·L-1) 1 mL、5
U·mL-1 ExTaq酶 0.25 mL、无菌水17.25 mL，总
体积为 25 mL。PCR 反应条件为：95℃预变性 5
min；95℃变性 30 s，50℃退火 30 s，72℃延伸
2 min，共 35个循环；72℃延伸 10 min。在 4℃
下保存。PCR 产物经 1.0% 琼脂糖凝胶电泳鉴定。
结果与讨论
利用引物P1、P2对发根农杆菌pRi1724进行
菌落PCR 扩增，结果从发根农杆菌 pRi1724 中扩
增出的特异性带约为3 kb (图1)，经上海博亚生
物技术公司利用 M 1 3 通用引物进行核酸序列测
定，结果表明，rol基因全长3 209 bp，与GenBank
数据库中搜索的rol基因片段大小相符，确认是rol
基因的 D N A 片段。
图1 PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析
　　1：l-EcoT14 Ⅰ marker；2、3：以菌落为模板扩增基
因片段；4、5：以经 T r i t o n 处理的菌落为模板扩增基因；
6 、7 ：以对数生长期的菌液为模板扩增基因；8 ：空白。
植物生理学通讯 第42卷 第2期，2006年4月292
质粒DNA 的实际产量受多种因素影响，其中
最重要的是寄主菌株的遗传背景和质粒分子自身的
拷贝数的影响，质粒分子大小也是决定其 DNA 产
量高低的一个重要因素。发根农杆菌中的 Ri 质
粒，分子量可达 200~400 kb，且为寡拷贝质粒，
这种质粒的提取，用一般的质粒提取方法很难取
得较好的效果。李昌禹等(2003)曾用改良的王关
林和方宏筠(2002) Ti质粒的提取方法，对发根农
杆菌A4的Ri质粒进行提取，赵寿经等(2001)曾用
碱裂解法提取发根农杆菌A4的Ri质粒，但我们在
使用王关林和方宏筠(2002)、李昌禹等(2003)、
赵寿经等(2001)的方法提取发根农杆菌pRi1724的
Ri 质粒时均没有获得较好的效果。可见，用传统
碱裂解等方法提取的大质粒 DNA 为模板进行 PCR
扩增，较为繁琐且成功率较低。而菌落 PCR 的方
法简便快捷、省时高效，同时又避免在抽提过程
中 DNA 的损失。因此，用菌落 PCR 的方法对发
根农杆菌pRi1724的Ri质粒rol基因的克隆及后期
测序显示出一定的优越性。
菌落PCR 实验中需注意的是，在 PCR 反应体
系中，作模板的菌量浓度不宜过高。菌液模板一
般用菌落接种至 YEB 培养基振荡培养过夜，在加
到 P C R 反应液前，混匀菌液；菌落模板以挑取
单菌落，最好是新的单菌落，菌落要尽可能少。
此外，PCR 反应液应尽量在冰中调制，这种冷启
动方式可增强 PCR 扩增的特异性。本文中采用 3
种模板形式进入 PCR 反应体系，结果发现菌液作
为模板时背景不清晰，有杂带，单菌落和经Triton-
X100 处理的菌落作为模板效果优于菌液作为模
板。采用菌落 PCR 反应克隆的 rol 基因经测序，
长度为3 209 bp，经GenBank检索证明确定为rol
基因片段。另外，实验过程中用不同菌液浓度(通
过培养时间控制)做了比较实验，在加到PCR反应
液前，可事先用移液器吸打几次以混匀菌液，发
现菌液含菌量不能过高，一般 YEB 培养液震荡培
养 10 h，浓度为 OD600 值 0.3~0.5 较好。采用菌
落 PCR 的技术克隆大片段 DNA 还需具备以下条
件：(1)选取新培养的单菌落经Triton-X100处理，
起到破坏细胞、使DNA充分释放的功效；(2) PCR
反应液应尽量在冰中调制，这种冷启动方式可增
强 PCR 扩增的特异性，表现为琼脂糖凝胶电泳的
单一清晰条带。
参考文献
戴均贵, 朱蔚华(1999). 发根培养技术在植物次生代谢物生产中
的应用. 植物生理学通讯, 35 (1): 69~76
李昌禹, 马海琴, 赵寿经, 臧埔(2003). Ri质粒的快速提取及rolC
基因的克隆. 吉林农业大学学报, 25 (3): 263~265
王关林, 方宏筠(2002). 植物基因工程. 第2版. 北京: 科学出版
社, 738~739
赵寿经, 李昌禹, 藏埔, 马海琴, 杨振堂(2001). 影响人参发根中
皂甙含量基因的定位及其克隆. 特产研究, 4: 1~6