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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第12期
酿酒酵母是最简单的真核生物，同时又具有类
似原核生物的生长特性，便于培养和进行遗传操作
的优点，是一种模式真核生物和模式实验系统，被
称为真核生物的“大肠杆菌”［1］。它与人类的关系
极为密切，是人类实践中应用较早的一类微生物［2］，
同时它也被广泛用作基因克隆和表达的宿主菌。
为了鉴定克隆到酵母细胞内的外源基因，可以
通过提取酵母基因组后通过 PCR 扩增目的基因、与
特异性底物形成水解圈、荧光基团、挑取单克隆进
收稿日期 ： 2013-06-30
基金项目 ：广东省科技计划（2012B020311005）
作者简介 ：武可婧，女，硕士研究生，研究方向 ：微生物功能蛋白 ；E-mail ：wu.kejing@163.com
通讯作者 ：林蒋海，博士，副研究员，研究方向 ：基因工程，代谢工程 ；E-mail ：jianghai.lin@jnu.edu.cn
一种高效快速鉴定酵母转化子的酵母菌落 PCR 方法
武可婧  吕一鸣  李晶博  肖文娟  龚映雪  刘泽寰  林蒋海
（暨南大学生命科学技术学院，广州 510632）
摘 要 ： 酵母是一种重要的基因工程宿主菌，但是由于其细胞壁结构复杂牢固，普通的菌落 PCR 方法的成功率较低。为解
决此问题，提供一种快速、简单、高效的酵母菌落 PCR 方法。该方法先利用溶壁酶溶解酵母细胞壁，然后利用热涨裂解细胞并进
行 PCR 反应。此方法将酵母细胞裂解和 PCR 在同一个 PCR 管中完成。试验结果显示此方法能成功扩增目的基因且成功率高。将
此方法应用于外源性内切葡聚糖酶（endoglucanase，EG）的酿酒酵母转化子筛选，经与基因组 PCR 比较，菌落 PCR 与基因组 PCR
结果一致。结果证明此方法具有良好的稳定性，适用于酿酒酵母转化子的快速筛选。
关键词 ： 酿酒酵母 菌落 PCR 转化子 阳性克隆
A Rapid and Efficient Yeast Colony PCR Method to Identify Positive
Transformants
Wu Kejing Lü Yiming Li Jingbo Xiao Wenjuan Gong Yingxue Liu Zehuan Lin Jianghai
（School of Life Science and Technology，Jinan University，Guangzhou 510632）
Abstract:  Yeast is an important host microorganism in genetic engineering and molecular cloning. However, because of the complex
structure of their cell wall, ordinary colony PCR method has a low success rate. To address this problem, a fast, simple and efficient yeast colony
PCR method was provided. In the novel method, a commercial available cell wall degradation enzyme, lyticase, was used to disrupt yeast cell
wall and the resulted protoblast was then bursted by heating. Into the lysis mixture, other PCR components were added and PCR reactions
were performed. In the current constructed method, the yeast cell lysis and PCR reaction were performed in one single PCR tube, which is
convenient and easy to implement. The success rate of the novel method was relatively high compared to traditional ones. Using this method, the
Saccharomyces cerevisiae transformants of exogenous endoglucanase（EG）were screened. Compared to PCR using genomic DNA, the results
of colony PCR were consistent with those from genomic PCR. The results indicated that the novel method was of good stability, repeatability and
suitable for the rapid screening of the S. cerevisiae transformants.
Key words:  Saccharomyces cerevisiae Colony PCR Transformant Positive clone
行菌落 PCR 等一系列方法来鉴定酵母转化后的阳性
克隆。但是提取酵母基因组耗时较长，不利于大批
量的对转化子进行鉴定。而特异性底物筛选同样是
费时，且一些底物的价钱也很昂贵。因此，通常还
是选择菌落 PCR 的方法鉴定酵母转化后的阳性克隆。
酵母细胞的细胞壁主要成分为多糖（85%-90%）
和蛋白质（10%-15%），其中多糖是由甘露聚糖、
β-葡聚糖和少量的几丁质等组成，处于细胞壁内层
的 β-葡聚糖与几丁质共价相连，起到细胞骨架的作
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用 ；而外层的甘露聚糖与中层蛋白质中的丝氨酸或
苏氨酸以 O-糖苷键相连接，形成的甘露糖蛋白覆
盖于细胞表面，给予酵母细胞一定的韧性［3］。酵母
细胞壁独特的结构致使其难以被普通高温煮沸法打
破，因此普通细菌菌落 PCR 的方法直接应用于酵
母，成功率往往比较低［1，3］。为提高酵母菌落 PCR
的成功率，在 PCR 反应前，需要对酵母进行破壁处
理，但是通常的破壁方法，如研磨法、冻融法、高
压均质法、超声波法等，对酵母细胞的破壁效果不
理想［4］。为解决此问题，本研究利用商品化的溶壁
酶，通过重新设计破壁反应时间和反应程序，提出
一种新的简单高效的酵母菌落 PCR 方法，并将该
方法运用于整合克隆到酵母基因组的内切葡聚糖酶
（endoglucanase，EG）转化子筛选，从而大大缩短酵
母转化后阳性克隆鉴定的时间，提高试验效率。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 本研究所用的酿酒酵母菌株为 W303-
1a，由江南大学生物工程学院的张梁馈赠。
1.1.2 培养基 YPD 培养基 ：1％酵母提取物，2％
蛋白胨，2％葡萄糖 ；固体培养基添加 1.5％琼脂粉，
高压灭菌 20 min。
1.1.3 仪 器 和 试 剂 电 击 转 化 仪（Bio-Rad Gene
Pulser Xcell），PCR 仪（东胜 EDC-810），电泳仪（北
京六一 DYY-8C），凝胶成像系统（北京创美伟业公
司），微型离心机（江苏海门市其林贝尔仪器制造
有限公司 LX-100）。溶壁酶（天根生化科技（北京）
有限公司），PCR 反应用 Taq 酶，dNTPs，10×PCR
buffer 均购于广州威佳科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 菌落 PCR 方法 将 W303-1a 菌种于 YPD 液
体培养基中 30℃，200 r/min 摇床培养，分别于 1.5
d 和 3 d 时吸取菌液，根据其 OD600 估算细胞数。将
菌液于 12 000 r/min 离心 1 min，收集菌体。用 0.06
mol/L，pH7.4 的磷酸缓冲液将菌体重悬稀释至不同
浓度，使 5 μL 重悬液中分别含有约 1×103，2.5×103，
5×103，1×104，2.5×104，5×104 个细胞。
取 5 μL 上述菌液于 PCR 管中，并加入 8 U 溶壁
酶，置于 PCR 仪上 30℃温浴 30 min，紧接着于 95℃
温浴 10 min。然后向各 PCR 管内加入其余 PCR 反应
成分（含 Taq 酶 1.5 U，dNTP 各 2.5 mmol/L，1×buffer，
上下游引物各 10 pmol/μL），使 PCR 反应终体积为
50 μL，进行 45 个循环 PCR 扩增。本研究以酿酒酵
母肌动蛋白基因 ACT1 为扩增目的基因，扩增引物分
别为 ：ACT1F ：5-GTTTAGAGGTTGCTGCTTTGGTT-3
和 ACT1R ：5-GATAGAACCACCAATCCAGAC-3 ；
扩增产物为 1 031 bp。PCR 引物由中美泰和生物技
术（北京）有限公司和英潍捷基（上海）贸易有限
公司合成。
1.2.2 菌落 PCR 鉴定内切葡聚糖酶（endoglucanase，
EG） 转 化 子 利 用 δ 整 合 的 方 法［5］， 将 来 源 于
Trichoderma reesei（里氏木霉）的内切葡聚糖酶基
因（EGI，GenBank 登录号 M15665.1）整合到酿酒
酵母 W303-1a 的基因组中。转化产物于 YPD 固体平
板培养基 30℃培养 2 d。待菌落形成后，随机选取
10 个克隆进行菌落 PCR 鉴定。同时分别提取此 10
个克隆的基因组，用基因组 PCR 方法进行鉴定。以
ACT1 基因作为对照基因。
2 结果
2.1 细胞数对菌落PCR的影响
不同细胞数的菌落 PCR 结果如图 1 所示。培养
3 d 的酵母，当细胞数为 1×103、2.5×103、5×103、
1×104 个，利用上述破壁方法均能较好地释放出基
因组，且均能特异地扩增出目的基因片段 ；而当细
胞数为 2.5×104，5×104 个时，没有扩增出目的条
带。而培养 1.5 d 的酵母菌当细胞数超过 5×103 个时，
PCR 反应开始受到抑制，不能扩增出目的条带。
该结果表明，酵母细胞数会影响菌落 PCR 的成
功率。培养时间不一的酵母细胞对 PCR 结果影响不
一样，这可能是溶壁酶对不同生长状态的酵母细胞
的细胞壁活性不同 ；对对数生长期细胞的活性高，
而对稳定期细胞的活性低。因此对于 1.5 d 的细胞，
5×103 个细胞就能裂解出相当于 1×104 个稳定期细
胞的细胞壁，从而对 PCR 反应产生相似程度的抑制
效应。
2.2 加热破细胞的顺序对菌落PCR的影响
从图 2 可以看出，溶壁酶破壁后即加入 PCR 反
应成分的方法，不同培养时间，不同细胞数均没有
2013年第12期 139武可婧等 ：一种高效快速鉴定酵母转化子的酵母菌落 PCR 方法
获得相应的目的基因片段，说明这种方法可能不能
使酵母细胞破裂。其原因不明确，一种可能的解释
是溶壁酶是一种混合酶，具有一定的蛋白酶活性。
在加入 PCR 反应体系以后将 PCR 反应和细胞的破
裂同时进行，裂解酶很可能会降解 DNA 聚合酶，从
而抑制了 PCR 反应，而如果 30℃处理后马上升温至
95℃，不仅可以使酵母细胞充分破裂，也可以使裂
解酶失活从而避免影响后续的 PCR 反应。
示。从图 3 可以看出，参照基因（ACT1）及目的基
因（EGI）均能被特异的扩增出来。比较菌落 PCR
与基因组 PCR 的结果，两结果一致，说明该方法具
有良好的稳定性，可以用于酵母转化后阳性克隆的
鉴定。
M 1 2 3 4 5 6 P C M
2000
bp
bp
1000
750
M 1 2 3 4 5 6 P C M
2000
1000
750
M：DNA Marker DS2000；1-6：细胞数分别为 1×103，2.5×103，5×103，1×104，
2.5×104，5×104 ；P ：阳性对照（W303-1a 基因组 DNA）；C ：空白对照
图 1 酵母菌分别培养 3 d（A）和 1.5 d（B）细胞数对菌
落 PCR 的影响
M 1 2 3 4 5 6 P C M
2000
1000
750
M 1 2 3 4 5 6 P C M
2000
A
B
1000
750
酵母菌分别培养 3 d（A）和 1.5 d（B）；M ：DNA Marker DS2000 ；1-6 ：细
胞数分别为 1×103，2.5×103，5×103，1×104，2.5×104，5×104 ；P ：阳性
对照（W303-1a 基因组 DNA）；C ：空白对照
图 2 破细胞的顺序对菌落 PCR 的影响
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 P C M
2000
1000
750
A
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 P C M
2000
1000
750
B
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 P C M
2000
1000
750
C
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 P C M
2000
1000
750
D
A，B ：菌落 PCR ；C，D ：基因组 PCR ；A，C ：扩增 ACT1 基因 ；B，D ：扩
增 EGI 基因；M：DNA Marker DS2000；1-9：9 个酵母转化子；P：阳性对照（A
和 C 中以 W303-1a 基因组 DNA 为模板，B 和 D 中以含有 EGI 基因的质粒为
模板）；C ：空白对照
图 3 EGI 转化子菌落 PCR 与基因组 PCR 的结果
3 讨论
菌落 PCR 是鉴定外源基因克隆的最方便快捷
的方法，但由于酵母细胞壁的特殊结构及成分，通
常的酵母菌落 PCR 成功率不高。本研究利用商业化
的酵母细胞壁裂解酶改进传统菌落 PCR 的方法，相
对于传统的酵母菌落 PCR 的方法最大优势在于简便
高效，稳定性好。该方法将酵母细胞破壁，裂解和
PCR 反应集中在一个 PCR 管中进行，用溶壁酶 30℃
温浴 30 min，95℃，10 min 后即可做后续的 PCR 反
应，与彭苗苗［6］ 等报道的利用溶壁酶 30℃水浴
20 min，-80℃，5 min 后无菌水稀释作模板的方法相
2.3 菌落PCR与基因组PCR的结果比较
随机挑选 10 个转化有 EGI 基因的单菌落进行细
胞裂解，裂解产物分两份，分别用 EGI 和 ACT1 基
因的引物进行菌落 PCR，同时将所挑的克隆经 YPD
扩大培养后提取基因组后进行 PCR。结果如图 3 所
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第12期140
比更省时省力。且本研究的方法不需要机械破壁法
的辅助，反应条件温和。也有报道［7］用 100℃热处
理后再用乙醇沉淀、浓缩的方法来鉴定重组酵母克
隆，但操作较繁琐，且高温煮沸可能会引起基因组
模板的降解，煮沸过程中也容易引起污染。
本 研 究 所 采 用 的 用 溶 壁 酶 30 ℃ 处 理 30 min，
95℃，10 min 的破壁方法，能够得到很好的破壁效
果。与之前阳辛凤等［1］报道的溶壁酶的破壁效果微
弱形成了对比。王志博等［8］曾报道用蜗牛酶和溶菌
酶的混合酶液对酵母细胞进行破壁，所得结果是酶
量 300 mg（10 mg/mL），pH5.0，反应温度 45℃，反
应时间 6 h 破壁效果最佳，该方法与本文的方法相
比所需酶量大且耗时。
通过对内切葡聚糖酶转化子的菌落 PCR 及基
因组 PCR 的对照试验，证明了该方法的有效性和稳
定性。同时本研究的结果表明，酵母细胞数对菌落
PCR 具有重要的影响，因此控制细胞数是菌落 PCR
成功的一个关键因素。该方法不仅操作方便，而且
重复性也很好。在实验室操作中，可以用此方法进
行酵母细胞转化后阳性克隆的鉴定。
4 结论
溶壁酶处理后的酵母细胞，再经 95℃处理，基
因组可充分释放。将细胞数控制在 5×104 个，利
用此方法可以得到较稳定的菌落 PCR 结果。将该
方法用于 EGI 的酿酒酵母转化子的鉴定，参照基因
（ACT1）及目的基因（EGI）均能被特异扩增。
参 考 文 献
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2005 ：12.
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［4］ 刘晓永 , 王强 , 胡永金 . 用微珠涡流法破壁酵母细胞［J］. 吉
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zed yeast strains［J］. Microbial Cell Factories, 2010（9）：32-39.
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定方法研究［J］. 江苏农业科学 , 2011, 39（3）：63-64.
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（责任编辑 李楠）