全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 9期
菌落 PCR快速扩增工业酿酒酵母基因组 DNA片段
阳辛凤 1, 2, 3 高秋芳 1 李锡敏 1 郭安平 1 孔华 1 贺立卡 1
( 1中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海口 571101; 2海南大学农学院,
海口 570228; 3中国热带农业科学院分析测试中心,海口 571101)
摘 要: 针对工业酿酒酵母细胞破壁难和提取基因酵母组 DNA费时长 ( 2- 3 h/样品 )的问题, 研究了 SDS微珠涡旋破
壁的方法。以破壁液上清为模板进行菌落 PCR扩增酿酒酵母南阳 K基因组中铜抗性蛋白基因 ( cup1)片段和 rDNA片段。结
果表明, 在不需要提取酵母基因组前提下, 利用该方法能有效地扩增酵母基因组 DNA片段, 同时该方法也适用于对转基因酿
酒酵母进行菌落 PCR从而实现对转化子的准确和快速地鉴定筛选,是一种成本低和易于操作的适于处理大量样品的方法。
关键词: 酿酒酵母 菌落 PCR 破壁
Rapid Amplification ofGenome DNA Fragment of Industrial
Saccharomyces cerevisiae by Colony PCR
Yang X infeng
1, 2, 3
Gao Q iufang
1
L iXmi in
1
GuoAnping
1
KongH ua
1
H e L ika
1
(
1
Institu te of T rop icalB ioscience and B io technology, CATAS,H aikou 571101;
2
Agr icultural College, H ainan University, H aikou 570228;
3
Analy sis and T est Center of CATAS, H aikou 571101)
Abstrac:t Fo r the d ifficulty o f disrupting the cell o f industr ialSaccharomyces cerevisiae and tim econsum ing ( 2- 3 h / sam ple) to
ex tract yeast g enom e, w e studied SDSm in i g lass beads vortexm ethod to disrupt the cell o f industr ia lSaccharom yces cerevisiae. Superna
tant of ce ll lysates w as used as temp let for co lony PCR to amp lify copperresistant gene CUP1 fragm ent and ribosom al DNA ( rDNA )
fragm en t of Saccharom yces cerevisiae. The resu lts show ed that yeast genome DNA fragm ents could be am plified e ffective lyw ithou t extrac
tion of yeast g enom e. Them ethod wh ich w as proved easy and cheap as performed a lso cou ld be used for co lony PCR to screen the trans
form an ts o f g enetica lly mod ified yeast accurate ly and rap idly.
Key words: Saccharom yces cerevisiae Co lony PCR D isruption o f ce ll
收稿日期: 20100222
基金项目:国家 863!重点课题 ( 2007AA021307)
作者简介:阳辛凤,女,博士研究生,研究方向:微生物生物技术; Em ai:l yangxin@f sina. com
通讯作者:郭安平, Em ai:l gap21@l 126. com
酿酒酵母 (Sacchromyces cerevisiae )是单细胞真
核微生物,是食品、药品等工业中广泛使用的生物,
同时它也是被广泛用作基因克隆和表达的宿主菌,
被称为真核生物中的 大肠杆菌 !。 PCR扩增酵母
基因组 DNA片段或鉴定整合到酵母基因组上的外
源基因之前往往需要提取基因组 DNA,提取约历时
2- 3 h,比较费时, 能一次同时提取的样品很有限;
在酵母遗传转化中更是难以通过上述方式大批量地
对酵母转化子进行筛选鉴定;另一方面,提取酵母基
因组或进行菌落 PCR之前都需要对酵母细胞进行
充分破壁,但酵母细胞壁结构坚韧,外层为甘露聚糖
(M annan) ,内层为葡聚糖 ( G lucan) ,中间夹有 1层
蛋白质分子,破壁难度较大 [ 1]。已报道的酵母菌破
壁方法有机械法 [ 2- 4 ]、化学法 [ 5]和酶法 [ 6] , 各种方
法有其特点和局限从而适合于不同的目的。有报道
溶壁酶 ( ly ticase)处理、95∀ 5 m in或使用酵母菌落
PCR鉴定试剂盒等方法能有效破壁 [ 5, 9- 12]。但我们
在进行酵母菌落 PCR时发现, 由于酵母遗传性质
的差异和细胞壁结构的复杂性, 尚有许多酵母菌
菌株, 特别是野生型酵母无法通过上述方法进行
菌落 PCR。本试验对工业酿酒酵母的破壁和菌落
PCR进行了研究,旨在建立简单、快捷的酵母菌破
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 9期
壁方法和无需提取酵母基因组就能快速扩增基因
组 DNA片段的方法, 从而可大大缩短试验时间,
提高效率。
1 材料与方法
11 试剂与仪器
PCR仪 ( T1Thermob lock, 德国 B iom etra ), 凝胶
成像分析系统 ( UVP B io Imag ing System, Upland.
CA. USA ), 电泳仪 ( DYY6B,北京六一仪器厂 ) ,微
型离心机 ( LX200, 江苏其林贝尔仪器制造有限公
司 ) ,涡旋混合器 ( XW 80A,江苏其林贝尔仪器制造
有限公司 )。
2xTaq PCR M asterM ix:北京天根生化科技有限
公司; 溶壁酶 ( ly ticase): Sigma公司;玻璃微珠 ( g lass
beads): Omega B ioTEK; 十二烷基硫酸钠 ( SDS)与
其它试剂均为国产或进口分析纯。
12 菌珠
工业酿酒酵母南阳 K (简称 NYK ), 海南大学
食品学院馈赠。
13 酵母菌的培养
挑取 NYK点种在 YPD固体平板上, 30∀ 培养
3 d。
14 酵母破壁方法
141 干菌落微波处理法 挑菌落放入 PCR管
中,微波 30 s间隔 10 s, 6个循环,加 20 L无菌水,
立即涡旋, - 20∀ 冷冻 15 m in。
142 沸水处理法 将 20 L无菌水放入 PCR
管中,挑菌落放入管中, 涡旋使细胞充分分散, 将
PCR管放在沸水中 5 m in, 立即放于 - 20∀ 冷冻
15 m in。
143 SDS处理法 将 20 L 02% SDS放入
PCR管中, 挑菌落放入管中, 涡旋使细胞充分分
散, 将 PCR管放在沸水中 5 m in, 立即放于 - 20∀
冷冻 15 m in。
144 溶壁酶 ( lyt icase)处理法 将 20 L溶壁酶
溶液 (以山梨醇缓冲液配制, 浓度 025 U /L, )放
入 PCR管中, 挑菌落放入缓冲液中, 涡旋使细胞充
分分散, 30∀ 40 m in,沸水 5 m in杀酶。
145 反复冻融法 将 20 L无菌水放入 PCR管
中,挑菌落放入管中, 涡旋使细胞充分分散,将 PCR
管放在沸水中 1m in, - 20∀ 15 m in, 3个循环。
146 微珠 ( g lass beads)涡旋法 将 20 L无菌
水放入 PCR管中, 挑菌落放入管中,加入玻璃微珠,
涡旋 5 m in,分 5次进行,其间冰上冷却。
147 SDS微珠 ( g lass beads)涡旋法 将 20 L
02% SDS放入 PCR管中,挑菌落放入管中,加入玻
璃微珠,涡旋 1m in,分 2次进行, 其间冰上冷却。上
述冷冻的破壁产物使用时在冰上解冻,在微型台式
微型离心机上离心 10 s,上清用菌落 PCR。
15 酵母菌落 PCR方法
151 引物合成 引物均由上海生物工程公司合
成。根据酿酒酵母铜抗性蛋白基因 CUP1序列
( G enB ank登录号 K02204)设计特异引物。上游引
物 Pcup1: 5# GTC AGC TAG CGC AAA AAG AGC
GAT GCG3#, 下游引物 Pcup2: 5# TAT TAA CGT
ATA CCT ATA AAT TAA CAA AG3#。根据酿酒酵
母 rDNA基因序列 ( GenBank登录号 NC001144 )设
计特异引物。上游引物 PrDNA 1: 5#GAA GTACCTC
CCAACTACTTT 3#, 下游引物 PrDNA 2: 5#CGT TGC
AAA GAT GGG TT3#。
152 菌落 PCR条件与体系 25 L体系中, 2x
Taq PCRM asterM ix 125 L,上游引物 1 L,下游引
物 1 L,菌液上清 05 L,无菌水 10 L。程序:扩增
CUP1片段为 95∀ 5m in, 95∀ 40 s, 55∀ 40 s, 72∀
40 s, 72∀ 10m in;扩增 rDNA片段为 95∀ 5m in, 95∀
40 s, 50∀ 40 s, 72∀ 2m in 30 s, 72∀ 10m in。
2 结果与分析
21 不同破壁方法处理后酵母菌落 PCR结果
随机挑取 2个 NYK菌落, 通过 1 4所述 6
种方法进行破壁后, 进行菌落 PCR, 结果见图 1。
图 1显示, SDS法、微珠涡旋法有较好的破壁效
果, 反复冻融法也有一定的破壁效果。 SDS法破
壁是依靠 SDS的表面活性作用破坏细胞壁。 SDS
同时也是酶的变性剂, 如果浓度高会对 PCR时
DNA聚合酶活性有影响, 在选择 02% SDS破壁
时, 破壁效果良好, 而且未发现对聚合酶产生抑
制。微珠涡流破壁主要是依靠微珠在快速运动
中产生的剪切力打破细胞壁。反复冻融法则是
依靠冰晶的机械挤压和穿刺作用破壁。溶壁酶
的作用是去除细胞壁从而将酵母细胞转变成原
生质体。溶壁酶破壁效果非常微弱, 该结果与文
献的报道有差异 [ 2]。试验中还使用了不同单位
216
2010年第 9期 阳辛凤等:菌落 PCR快速扩增工业酿酒酵母基因组 DNA片段
的溶壁酶在 30∀ 处理 60 m in、75 m in, 均未得到
理想的破壁效果。这反映了酵母菌细胞壁构成
的复杂性。
M. DNA M arker DL2000; 1- 6.分别为 NYK菌落 ( 1)经 6种方法破壁处理后菌落 PCR产物; 7- 12.分别为 NYK菌落 ( 2)经 6种
方法破壁处理后菌落 PCR产物; 13-阳性对照, CUP1片段 ( 540 bp )
图 1 不同破壁方法处理后菌落 PCR结果
22 微珠涡旋法破壁效果的验证
随机挑取 6个菌落, 通过微珠涡旋法破壁后,
进行菌落 PCR,结果见图 2。表明微珠涡旋法破壁
效果稳定, 经菌落 PCR后均能扩增出明亮的条带。
微珠涡旋法虽然有良好的破壁效果, 但是每个样
品 5 m in的涡旋时间太长, 所以该法适用于处理少
量样品,而不适合处理大批量的样品。
M. DNA M arker DL2000; 1- 6. 分别为 6个随机挑取的
NYK菌落经微珠涡旋法破壁处理后菌液 PCR产物; 7.
阳性对照, CUP1片段 ( 540 bp)
图 2 微珠涡旋法破壁效果的验证
23 SDS法的验证与 SDS微珠法菌落 PCR结果
随机挑取 6个菌落, 通过 SDS法破壁, 进行菌
落 PCR来扩增 540 bp的 CUP1片段 (图 3A )和约
23 kb的 rDNA片段 (图 3B )以对 SDS法进行验
证。表明 SDS法能有效地扩增短片段, 但扩增长片
段则有些样品无法被扩增出来。这可能是 SDS方
法中需要沸水 5 m in处理,高温对基因组有一定的
降解作用造成的, 试验中还发现沸水处理时有的
PCR管中会有沸水进入, 引起污染。
SDS法操作简单, 但需要沸水处理, 而且 SDS
法扩增长片段有一定的局限性。鉴于微珠涡旋法有
良好的破壁效果,故将 SDS方法与微珠涡旋法相结
合 ( SDS微珠涡旋法 ) ,再做酵母菌落 PCR。
图 3表明, 扩增短片段时, SDS法与 SDS微珠
涡旋法效果相似。但扩增长片段时, SDS微珠涡旋
法效果好于 SDS法。 SDS法中不能扩增出的 rDNA
片段,用 SDS微珠涡旋法均可扩增出来。 SDS微
珠涡旋法需要的涡旋时间短, 缩短至 1 m in, 大大
地节省了样品预处理时间, 而且产生的剪切力既
保证了破壁, 又不损伤酵母基因组保证了对长片
段的扩增。
24 菌落 PCR体系中破壁产物体积的确定
随机挑取 3个菌落经 SDS微珠涡旋 !破壁处
理后进行菌落 PCR, 25 L体系中加入破壁产物分
别为 05、10、15 L, PCR扩增结果如图 4所示。
萨姆布鲁克等 [ 8]报道酵母细胞壁成分会抑制
PCR,因此做酵母菌落 PCR时细胞用量不能过多。
本试验中, 当 PCR体系为 25 L时,破壁产物体积
05- 15 L范围内未观察到 PCR反应受到抑制。
另外,也未发现 SDS对 Taq酶的抑制作用。考虑到
破壁菌液总体积较少,用 05 L菌液经扩增后即可
得到明亮的电泳谱带。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 9期
A: M. DNA M arker DL2000; 1- 6 6个随机挑取的 NYK菌落经 SDS破壁处理后菌落 PCR产物; 7 - 12 6个随机挑取的 NYK菌
落经 SDS微珠涡旋破壁处理后菌落 PCR产物; 13. 阳性对照 CUP1片段 ( 540 bp ); B: M. DNA Marker DL4500; 1- 6 6个随机挑
取的 NYK菌落经 SDS破壁处理后菌落 PCR产物; 7- 12 6个随机挑取的 NYK菌落经 SDS微珠涡旋破壁处理后菌落 PCR产物;
13. rDNA片段 ( 2 267 bp)
图 3 SDS法和 SD S微珠涡旋破壁处理后菌落 PCR扩增结果
M. DNA M arker DL2000; 1- 3.上清体积 05 L; 4- 6.上清体积 10 L ; 7- 9.上清体积 15 L ; 10 .阳性对照,
CUP1片段 ( 540 bp)
图 4 破壁液上清体积对菌落 PCR结果的影响
3 讨论
PCR是扩增酵母基因组 DNA片段的最方便快
捷的方式,但酵母基因组提取一直是 PCR的瓶颈步
骤。我们研究了菌落 PCR快速扩增工业酿酒酵母
基因组 DNA片段的方法,挑取适量酵母菌菌落放入
20 L 02% SDS中, 加入玻璃微珠,涡旋 1 m in, 分 2
次进行,其间冰上冷却,离心 10 s后上清用于菌落
PCR, 能扩增出长达约 23 kb的片段。该方法不需
要提取酵母基因组,不需要高速破壁的设备,条件温
和不需要超声处理或有机溶剂处理, 准确、快速、易
行和安全,可以大大提高效率。
参 考 文 献
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科学出版社新书
2008中国生物技术发展报告
中华人民共和国科学技术部社会发展科技司中国生物技术发展中心
9787030281067 148. 00 2010年 7月出版
内容简介: %2008中国生物技术发展报告&分为: 政策篇、科学篇、技术篇、生物产
业篇、国际合作篇。介绍了我国生物技术及其产业化发展的现状和主要成就, 交流、
总结了发展生物技术和产业的经验,宣传了政府发展生物技术的政策方针,收集反应
了截至 2008年底国内外生物技术研发和产业化的最新进展。
%2008中国生物技术发展报告&能为生物科技领域的科学家、企业家、管理人员和
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