全 文 ：植物生理学通讯 第43卷 第1期，2007年2月 85
收稿 2006-11-28 修定　 2007-01-15
资助　 河南大学基金。
*通讯作者(E-mail: wzc@henu.edu.cn；Tel: 0378-2190699)。
光暗条件下大蒜DNA 甲基化差异的初步研究
何艳霞，王子成*，曹红平，张成婉
河南大学农业生物技术研究所，河南开封475001
提要：用甲基敏感扩增多态性(MSAP)技术分析光暗条件下生长的大蒜 DNA 甲基化水平差异。结果表明，用 8 对引物组
合扩增出 343 条带，完全一致的带型 240 条，不一致的 103 条。在不一致的条带中，光照条件下相同的 47 条带与黑暗条件
下相同的带型有差异，与黑暗相比光照下出现的去甲基化带 28 条，有 56 条差异带在 2 个处理内个体间也有差异。总的趋
势是光照引起大蒜 DNA 去甲基化。
关键词：DNA 甲基化；甲基敏感扩增多态性；大蒜
Initial Study of DNA Methylation Difference of Garlic (Allium sativum L.)
Growing in Light and Darkness
HE Yan-Xia, WANG Zi-Cheng*, CAO Hong-Ping, ZHANG Cheng-Wan
Institute of Agricultural Biotechnology, Henan University, Kaifeing, Henan 475001, China
Abstract: The variation patterns of DNA methylation in Garlic (Allium sativum L.) genome under the condition
of light and darkness was studied using MSAP technique to reveal the effect of light to the level of plant DNA
methylation. Total of 343 fragments were identified by eight primer combinations and of which 240 were shared
by all the samples in the two conditions. It was shown that 47 consistent fragments in light condition appeared
different comparing with those in darkness. Comparing with the darkness condition, the 28 fragments appeared
to be demethylated in light condition, and 56 fragments appeared to be varied among individuals in the same
condition. The overall results showed that light could induce DNA demethylation in Garlic.
Key words: DNA methylation; methylation sensitive amplified polymorphism; garlic
DNA 甲基化在高等生物的生命活动中具有维
持基因组稳定及调节生长发育等功能( C h a n 等
2005)。DNA 甲基化程度与一系列的生物过程相
关，如基因组稳定、X 染色体失活、基因的转
录调节和转座子元件的活性、基因沉默、基因组
印迹等(Bird和Wolffe 1999；Besyor 2000；Bender
2004；Gehring等 2004；Wassenegger 2002)。作
为一种表观遗传修饰，DNA 甲基化在不改变碱基
序列的基础上改变基因组的遗传信息，是现代表
观遗传学研究中的一个热点(仪治本等2005)。
胞嘧啶甲基化参与植物基因表达调控，进而
调节植物的生长发育(Finnegan等2000)。植物在
不同发育时期，通过遗传或环境变化调控内源基
因的表达所产生不同的发育反应，植物 DNA 甲基
化水平的变化在此种调节中起作用(Ri c h a r d s
1997；Kass 等 1997)，而温度和光照等环境因素
都可以促使DNA甲基化水平发生变化(Gurmind等
2000)。
甲基敏感扩增多态性(methylation sensitive
amplified polymorphism，MSAP)技术是基于扩增
片段长度多态性(AFLP)技术，以对甲基化敏感的
酶HapII和MspI代替MseI作高频内切酶，以EcoRI
为低频内切酶进行 AFLP 反应。这种方法适用于
检测材料 DNA 序列未发生变化情况下的 DNA 甲基
化水平变化。
本文以遗传基础一致、光和暗条件下培养的
大蒜为材料，用 MSAP 技术分析大蒜胞嘧啶甲基
化的变化情况，探讨光对植物 DNA 甲基化水平的
影响。
材料与方法
实验材料是郑州农科所赠送的大蒜(Allium
sativum L.)品种 ‘双高一号 ’。取4个大蒜头，分
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别编为 1 号、2 号、3 号和 4 号材料，即重复 4
次。从每个重复的材料中，分别取 10 个大小基
本一致的蒜瓣均分为 2 部分，取相同的玻璃杯
(200 mL)，盛装等量的自来水，用滤纸制成滤纸
桥，滤纸桥中间打一小孔，以便大蒜根生长。将
滤纸桥放入水杯，并接触水面，实验材料置于滤
纸桥上，使其生根部分与水面接触。材料都放在
23 ℃恒温培养室中培养，一部分于光照下培养，
光照强度为11 µmol·m-2·s-1，每天光照12 h，另
一部分于暗箱中遮光培养。
MSAP 分析以 AFLP 实验为基础，实验流程
参照Xiong等(1999)和Cervera等(2002)的方法。模
板DNA分别用 EcoRI/HpaII和 EcoRI/MspI进行酶
切。EcoRI/HpaII 酶切分步进行，20 mL 体系含
250 ng DNA，EcoRI 3 U，10 倍缓冲液(500
mmol·L-1 Tris-HCl，pH 7.5；100 mmol·L-1 MgCl2；
10 mmol·L-1 dithiothreitol；100 mmol·L-1 NaCl)和无
菌水，于 37 ℃下温浴 2~4 h，加 2 倍体积无水
乙醇后于 -20 ℃下放2 h，抽干加6 mL无菌水溶
解，然后加入3 U HpaII，2 mL 10倍缓冲液(100
mmol·L-1 Tris-HCl，pH 7.5；100 mmol·L-1 MgCl2；
10 mmol·L-1 dithiothreitol)，用水补足到20 mL，
37 ℃下酶切3 h；EcoRI/MspI酶切体系同前，只
是加入EcoRI和MspI 这2种酶后同时反应，在37
℃下放 3 h。酶切产物分别都加上 EcoRI 接头和
H p a I I - M s p I 接头，E c o R I 接头序列是 5 -
CTCGTAGACTGCGTACC-3，3-CTGACGCAT-
GGTTAA-5，HpaII-MspI 接头序列是 5-GATC-
ATGAGTCCTGCT-3，3-AGTACTCAGGACGA-
GC-5，于 25 ℃下连接2 h；以稀释5倍的连接
产物进行预扩增反应，预扩增产物稀释20倍后再
进行选择性扩增反应。所有的引物序列见表 1，
预扩增和选择性扩增程序参照邹喻苹等(2001)书中
的程序，扩增产物加入1/2体积的变性缓冲液(见
分子克隆第三版)，放入94 ℃水浴 3 min后立即
转入 0 ℃中，进行 6% 的变性聚丙烯酰胺电泳，
条件为 55 W，2.5 h，最后银染显色。
实验结果
1 光暗条件下大蒜的生长性状差异
黑暗条件下生长的大蒜苗出现黄化现象(蒜
黄)，苗高而纤细；光照条件下正常生长的大蒜
为绿色，蒜苗粗壮而矮一些(图略)。
2 DNA甲基化水平变化
光暗条件下生长的大蒜 DNA 分别进行 MSAP
分析，观察到3种带型：I型带是在EcoRI/HpaII
和 EcoRI/MspI这 2种酶切组合中均出现的带；II
型带是在EcoRI/HpaII酶切中出现但在EcoRI/MspI
酶切中不出现的带；在EcoRI/HpaII 酶切中不出
现但在EcoRI/MspI中出现的带为III型带(图1)。
用 8 对引物组合进行扩增，共得到 343 条清晰的
条带，所有的带型统计见表 2。在光照和黑暗 2
种条件下生长的样品，完全一致的条带有 2 4 0
条，其中最多的带型是I型带，有165 条；而 II
型和III型带相对较少，II型带有34条，III型带
有 41 条。样品间不一致的 DNA 条带共有 103 条，
其中光照与非光照处理样品之间有差异的条带有
47条。在这些差异带中，光照处理的样品与黑暗
处理的相比较，去甲基化位点 28 个(标 * 的带)。
有19条带无法确定是去甲基化还是新产生的甲基
化(标**的带)，这47条差异带在所有黑暗或光照
条件下的样品都是一致的(即要么是所有光下的样
品有，要么是所有暗下的样品有)，由于样品的
其他生长条件完全相同，因此这些差异应该与光
照与否有关。其中光照条件下特有的带有 25 条，
而黑暗条件下特有的带有5条。有56条带在处理
间的差异很大，且处理内部各样品间也有差异，
这些可能是样品本身差异造成的。总之，光下生
表1 实验的引物序列
Table 1 Total numbers of amplified fragments
引物 序列(5®3)
E-A* G A C T G C G T A C C A A T T C A
Hpa-msp* A T C A T G A G T C C T G C T C G G
E - A A C G A C T G C G T A C C A A T T C A A C
E - A A G G A C T G C G T A C C A A T T C A A G
E - A C A G A C T G C G T A C C A A T T C A C A
E - A C T G A C T G C G T A C C A A T T C A C T
E-ACC G A C T G C G T A C C A A T T C A C C
E-ACG G A C T G C G T A C C A A T T C A C G
E-AGC G A C T G C G T A C C A A T T C A G C
E-AGG G A C T G C G T A C C A A T T C A G G
Hpa-Msp-TCAA A T C A T G A G T C C T G C T C G G T C A A
　　* 为预扩增引物，其余的为选择性扩增引物。
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讨 论
HpaII和 MspI是一组同裂酶，二者均识别并
切割5 CCGG 3序列，但是HpaII不能切割任何
1 个或 2 个均甲基化的序列，即 H p a I I 对
5CmCGG3、5mCCGG3 和 5mCmCGG3 都不表
现出活性，但若只是单链发生甲基化，则能识别
切割。MspI 对内部胞嘧啶的甲基化是不敏感的，
但对外部胞嘧啶的甲基化敏感，也就是说MspI可
以切割 5CmCGG3 但不能切割5mCCGG3。如果
在同一位点上，I型带变成II型、III型带或无任
何带，则说明在原来的5CCGG3序列至少有1个
胞嘧啶发生了甲基化，反之则是去甲基化。但用
这种方法分析 DNA 甲基化水平的变化存在一个不
能克服的弊端，即不能区分非甲基化的5CCGG3
序列与单链的胞嘧啶甲基化序列。
本文结果显示，光下生长的样品其电泳条带
较多，这种结果似乎也说明光对 DNA 去甲基化有
效应。有人认为 DNA 甲基化水平的变化是为了适
应生存环境而变化的一种自我修饰(Cervera 等
2002)。大蒜在是否受光照的条件下，DNA 甲基
化发生 13.7% 的变异，这种变异是否与某些基因
表达相关？植物 DNA 甲基化水平在植物的不同组
织及不同生长时期都会有差异，这在番茄、玉米
和水稻中已有过报道(陆光远等2005)，本文的材
料来源单一，用于提取 DNA 的叶片都处在同一生
长期，这可减少实验误差。在我们的实验中有56
条差异带存在于样品个体间，推测可能是由于个
体本身的营养差异造成的。
DNA 甲基化信息在植物的生长发育过程中起
着关键的调控作用。表型观察表明，光下的样品
生长较茁壮，暗下的蒜苗黄化且较细长，这种性
状是否是甲基化信息变化的结果？抑或是性状改变
导致甲基化信息遗传的改变？对此需进一步研究。
至于光暗条件下特有的 DNA 甲基化差异条带回收
和序列测定及差异 DNA 序列的功能分析，是我们
下一步的工作。此外，植物对光信号的接受涉及
到一系列信号转导过程，这些信号究竟如何调节
D N A 的甲基化，也有待深入研究。
参考文献
陆光远, 伍晓明, 陈碧云, 高桂珍, 许鲲, 李响枝(2005). 油菜种子萌
图1 模板 DNA 的 MSAP 分析
Fig.1 DNA methylation patterns using MSAP analysis
　　1 ~ 4 是 4 个蒜头样品。H1、H 2、H 3 和 H 4 为黑暗下的，
G1、G2、G3 和 G4 为光照的；H 和 M 分别代表样品由 EcoRI/
HpaII 和 EcoRI/MspI 酶切后扩增的条带。
表2 光照和黑暗条件下样品的MSAP分析带型统计
Table 2 A summary of MSAP band type of the sample
growing under light and darkness
带型 类型 条带数
黑暗 光照
2 种条件处理均 I I 165
有相同的条带 II II 34
III III 41
2 种处理间条带 II I 6*
有差异，但处 － I 13*
理内条带相同 － II 8**
－ III 4**
III I 3**
II I 2**
III II 2**
III I 9*
2 种处理间和处理 56
内均有差异的条带
　　I、II 和 III 为 3 种 MSAP 带型。“－”表示无任何带型；
* 为去甲基化的条带；** 为无法确定是去甲基化还是新产生的甲
基化的条带。
长的样品甲基化敏感酶的切割位点增多，即光对
大蒜 D N A 有脱甲基化作用。
植物生理学通讯 第43卷 第1期，2007年2月88
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