全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 3期，2008年 6月 485
津田芜菁和赤丸芜菁苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)的克隆和表达
许志茹 *，崔国新，李春雷，孙燕，李玉花
东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040
提要：以UV-A处理津田芜菁和赤丸芜菁块根 24 h后提取总 RNA，再用 RT-PCR方法分别克隆 BrPAL1和 BrPAL2基因
的结果表明，BrPAL1和BrPAL2的开放读码框为 2 169 bp，编码722个氨基酸。氨基酸序列分析显示，BrPAL1和BrPAL2
与甘蓝型油菜苯丙氨酸解氨酶(PAL)的同源性达 99%，第61~559的肽段具有PAL结构域。BrPAL1和BrPAL2的核苷酸序
列在 9个位置上存在差异，而推导的氨基酸序列仅在3个位置上有差异。BrPAL1和BrPAL2基因有高度同源性。Northern
杂交结果显示，UV-A可以诱导BrPAL1和 BrPAL2表达，基因的表达量与处理时间呈相关。
关键词：芜菁；花青素；苯丙氨酸解氨酶基因；基因克隆与表达；序列分析
Cloning and Expression of PAL Genes in ‘Tsuda’ Turnip and ‘Yurugi Akamaru’
Turnip (Brassica rapa L.)
XU Zhi-Ru*, CUI Guo-Xin, LI Chun-Lei, SUN Yan, LI Yu-Hua
College of Life Sciences, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
Abstract: The roots of ‘Tsuda’ turnip and ‘Yurugi Akamaru’ turnip (Brassica rapa) were irradiated with UV-A
light for 24 h, then the total RNA was isolated and BrPAL1 and BrPAL2 genes were cloned by RT-PCR method.
The BrPAL1 and BrPAL2 genes included an open reading frame (ORF) of 2 169 bp and encoded a protein of 722
amino acid. Amino acid sequence analysis showed that BrPAL1 and BrPAL2 were 99% identity to PAL of
Brassica napus, and the PAL domain was in the sequence from 61 to 559. The nucleotides of BrPAL1 and
BrPAL2 genes had 9-bp differences, as well as 3 in deduced amino acid sequence. BrPAL1 and BrPAL2 genes
had high identity. The Northern blotting results showed that the expression of BrPAL1 and BrPAL2 could be
induced by irradiation of UV-A and the gene expression was correlated with light-exposure time.
Key words: turnip; anthocyanin; phenylalanine ammonialyase gene (PAL); gene cloning and expression; se-
quence analysis
收稿 2008-03-31 修定 2008-05-20
资助 国家自然科学基金(30700560)和国家自然科学基金重点
项目(3 07 3 0 0 78 )。
* E - m a i l：x u z h i r u 2 0 0 3 @ 1 2 6 . c o m；T e l：0 4 5 1 -
82191783
植物的苯丙氨酸解氨酶( p h e n y l a l a n i n e
ammonialyase，PAL)催化苯丙氨酸脱氨生成肉桂
酸，是一系列苯丙酸类化合物代谢中的第一个催
化酶，在植物花青素、木质素、香豆醇、松柏
醇、芥子醇及其他亚类的植物酚类物质合成途径
中起关键作用(Buchanan等 2004)。
花青素是类黄酮的一个亚类，由一系列附着
于细胞膜上的酶催化合成，积累在维管植物液泡
中，决定花、果实和种子的颜色。苯丙氨酸在
PAL、查尔酮合成酶(chalcone synthase，CHS)、
苯基苯乙烯酮黄烷酮异构酶(chalcone-flavanone
isomerase，CHI)、黄烷酮 -3-羟化酶(flavanone 3-
hydroxyla se，F 3H )、二氢黄酮醇 - 4 - 还原酶
(dihydroflavonol-4-reductase，DFR)、花色素合成酶
(anthocyanidin synthase，ANS)和类黄酮 3-葡糖基转
移酶(UDP glucose: flavonoid 3-O-glucosyltransferase，
UFGT)的催化下产生天竺葵色素(pelargonidin)、
矢车菊色素(cyanidin)、飞燕草色素(delphinidin)、
芍药色素(peonidin)、牵牛色素(petunidin)和锦葵色
素(malvidin)及其衍生物(刘仕芸等 2006)。花青素
的生物合成还需要转录因子的调控(万小荣和李玲
2002；Schwinn等 2006；Bogs等 2007；Khar等
2008)。
植物花和果实的着色过程除了受内在因素影
响外，外界环境尤其光照条件也起作用(Weiss和
Halevy 1991)。光是影响植物生长发育的环境因子
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之一，花青素合成与光受体和光信号转导因子密
切相关(Sheehan等 2004；Vanderauwera等 2005)。
另外，蓝光和紫外光对花青素生物合成相关酶基
因的表达也有调节作用(Bieza 和 Lois 2001；
Frohnmeyer和 Staiger 2003；Chatterjee等 2006)。
迄今，对不依赖光的植物花卉和果实的着色机制
研究得还不清楚。
芜菁别名小蔓菁，十字花科芸苔属芜菁亚
种。有花青素合成依光型津田芜菁(‘T s u d a’
turnip，块根着色时需要光，受光一侧呈紫红色，
背光一侧呈白色)和非依光型赤丸芜菁(‘Yurugi
Akamaru’turnip，块根无论受光与否都呈红色，
块根在黑暗条件下即可着色)两类。本文以这两种
芜菁为试材，用RT-PCR方法克隆两种芜菁的PAL
基因，并用基因片段合成探针，以Northern杂交
检测UV-A处理条件下两种芜菁中PAL基因的表达
变化，以期为研究依光型和非依光型花青素生物
合成机制建立基础。
材料与方法
取温室种植的芜菁(Brassica rapa L.)品种津田
和赤丸自交纯系，块根始终在土中避光生长，块
根开始膨大后用锡纸遮蔽整个栽培钵，进一步避
光。块根膨大 2个月后用 352 nm的UV-A (光照
强度为 13.5 µmol·m-2·s-1)处理两种芜菁膨大块根
0、6、12、18、24 和 48 h，取处理块根和未
照光的对照块根进行试验。
取经UV-A处理24 h的津田芜菁和赤丸芜菁块
根皮提取总RNA (许志茹和李玉花 2006)。用从津
田芜菁削减文库中筛选到的花青素合成催化酶基因
片段 PAL在Database数据库中进行同源性比对，
选取高度同源的十字花科植物的 PAL基因序列设
计 RT-PCR引物(F：5 CGATATTGTAATGGAG-
GTTAACGG 3；R：5 CTCTTAACATATAG-
GAATGGGAGC 3)。
离心管中加入1 µL总RNA、2.5 µL Oligo(dT)
(20 µmol·L-1)和 6.5 µL H2O。混合后于 70 ℃中保
温 3 min，立即放入冰中。然后加入 4 µL 5×第
一链合成缓冲液、2 µL dNTP (10 mmol·L-1)和 2
µL二硫苏糖醇(DTT，100 mmol·L-1)。混合后离
心，加入 1.0 µL PowerScript反转录酶(Clontech
公司)和 1.0 µL RNase抑制剂，混合。42 ℃中保
温 1.5 h。于 70 ℃中保温 15 min后终止反应。
以反转录产物为模板，用RT-PCR引物和LA-
Taq DNA聚合酶(宝生物工程有限公司)进行全长
PAL cDNA的克隆。用 TOYOBO (东洋纺上海生
物科技有限公司)凝胶回收纯化试剂盒回收纯化
PCR产物，纯化产物与pBS-T载体(北京TIANGEN
生化科技有限公司)连接后转化大肠杆菌感受态细
胞 Top 10，经Amp+抗性及蓝白斑筛选，挑取阳
性克隆提取质粒。重组质粒经 PCR鉴定后由上海
生工生物工程技术服务有限公司完成测序。
在NCBI数据库中，将测得的津田芜菁和赤
丸芜菁的 PAL全长 cDNA序列和推测的蛋白质序
列进行 BLAST比对。用开放阅读框(open reading
frame，ORF)程序查找序列的ORF。用 BioEdit软
件比较津田芜菁和赤丸芜菁 P A L 基因的异同。
SignalP 3.0预测蛋白的信号肽。软件 ProtParam
(http://au.expasy.org/tools/protparam.html)计算蛋白
的分子量、净电荷和理论等电点。BLASTP预测
保守区，应用 Scan Prosite和HNN (Hierarchical
Neural Network)程序进行轮廓和基序分析。
探针用地高辛标记。探针合成的引物序列：
F，5 TCAAGTCGCCAAGAAAGT 3；R，5
CCTCCCTCACAAACCTAT 3。以质粒为模板进行
对照PCR合成目的片段。利用地高辛标记的dNTP
以质粒为模板合成探针。通过Northern杂交检测
两种芜菁试材中PAL基因的表达模式(许志茹和李
玉花 2006)。
实验结果
1 RT-PCR扩增
从图 1可见，28S rRNA和 18S rRNA的亮度
比接近 2:1，说明提取的总 RNA没有降解，完整
性良好。总 RNA在波长 260和 280 nm处的吸光
度比值为 1.96，均一性较好，可以用于 RT-PCR
和 Northern杂交。
采用设计的基因特异性引物，以提取的津田
图 1 芜菁中总RNA
Fig.1 Total RNA of turnip
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芜菁和赤丸芜菁总 RNA为模板，分别进行 RT-
PCR反应，结果(图 2)表明，津田芜菁和赤丸芜
菁中，扩增的 cDNA产物在 2 100 bp附近，分子
量大小与预期结果吻合。
插入了 RT-PCR扩增产物。选取带有扩增条带的
重组质粒进行序列测定。
津田芜菁和赤丸芜菁中RT-PCR获得的DNA
片段测序后证实为 PAL基因全长 cDNA序列。津
田芜菁的 PAL cDNA (BrPAL1)序列在GenBank中
的登录号为 EU402423，赤丸芜菁的 PAL cDNA
(BrPAL2)序列的登录号为 EU402424。Blast比对
结果显示，BrPAL1和 BrPAL2基因与甘蓝型油菜
(Brassica napus) PAL1-1的mRNA序列有 99%的
同源性，BrPAL1和BrPAL2由722个氨基酸组成，
含有完整的 ORF (图 5)。
氨基酸序列的 Blast P分析显示，BrPAL1和
BrPAL2编码的蛋白质具有PAL结构域，第61~559
的肽段与PAL具有高度同源性(图6)。氨基酸同源
性比对显示，BrPAL1和BrPAL2与多种植物的PAL
蛋白高度同源，与甘蓝型油菜PAL (ABC69916)的
同源性为 99%，与拟南芥 PAL1 (NP_181241)的同
源性为94%，与花叶木薯PAL (AAK60275)和美洲
山杨 PAL (AAN52279)的同源性为 85%，与大豆、
烟草、矮牵牛和小麦的 PAL (P27991、P25872、
AAV98199、CAA68036)的同源性分别为 84%、
82%、80% 和 77%。
ProtParam程序预测BrPAL1和BrPAL2的分子
量分别为 78.239和 78.3152 kDa，理论 pI值是
5.97和 5.9，氨基酸组成中Ala占最大比例，高达
9.3%，蛋白不稳定系数是 30.82和 31.35，属于
稳定蛋白。SignalP 3.0 Server 检测结果显示，
BrPAL1和 BrPAL2不含信号肽序列，为非分泌蛋
白。ScanProsite分析显示，BrPAL1和 BrPAL2在
204~220的氨基酸序列是GTITASGDLvPLSyiaG，
符合标签序列[GS]-[STG]-[LIVM]-[STG]-[SAC]-S-
G-[DH]-L-x-[PN]-L-[SA]-x(2,3)-[SAGVTL]。此基
序也包含在 BlastP程序查找出的 PAL蛋白结构域
内。BrPAL1和 BrPAL2的 722个氨基酸中，形成
α-螺旋的氨基酸占 45.98%和 45.29%，形成随意
盘旋序列的氨基酸占 46.26%和 46.68%，形成伸
展序列的氨基酸占 7.76%和 8.03%。两种蛋白中
不含其他二级结构。
B i oE di t 软件比对结果显示，B r PA L 1 和
BrPAL2基因具有 99%的同源性。核苷酸序列仅
在 9个位置上存在差异，而推导的氨基酸序列仅
在 3个位置上有差异(表 1)。
2 序列分析
将津田芜菁和赤丸芜菁的 RT-PCR 产物纯
化、连接、转化后挑取转化平板上的白色菌斑，
经液体培养后提取重组质粒(图 3)。
图 3 重组质粒的电泳图谱
Fig.3 Electrophoresis of recombinant plasmid DNA
以提取的质粒为模板，用基因特异性引物进
行 PCR扩增，以此鉴定重组质粒中是否插入了外
源片段。扩增结果(图 4)显示，重组质粒扩增条
带的分子量大小符合预期结果，说明重组质粒中
图 4 重组质粒的 PCR鉴定
Fig.4 PCR identification of recombinant plasmid DNA
图 2 津田芜菁和赤丸芜菁中PAL基因的RT-PCR反应产物
Fig.2 The RT-PCR products of PAL genes in ‘Tsuda’ turnip
and ‘Yurugi Akamaru’ turnip
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图 5 BrPAL1基因 cDNA全长序列和推导的氨基酸序列
Fig.5 Nucleotide and deduced amino acid sequences of BrPAL1 cDNA
箭头标示区域为津田芜菁消减文库中筛选到的 PA L 基因片段的序列。
图 6 BrPAL1和 BrPAL2含有的结构域
Fig.6 The domains of BrPAL1 and BrPAL2
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3 探针制备和Northern杂交
选取BrPAL1和BrPAL2核苷酸序列高度保守
区设计引物制备探针得到的结果(图 7)显示，地高
辛标记的探针比对照 PCR的电泳条带滞后，这是
由于地高辛标记的探针比未标记的 PCR产物的分
子量大的缘故。
UV-A处理津田芜菁和赤丸芜菁 0和 48 h后，
检测BrPAL1和BrPAL2的PAL表达量的变化。在
未见光的块根皮中，BrPAL1和 BrPAL2基因的表
达量很低，UV-A处理 48 h后，BrPAL1和BrPAL2
的表达量明显增加(图 8)。
表 1 BrPAL1和 BrPAL2核苷酸和氨基酸位点的差异
Table 1 Differences of nucleotide and amino acid sequences
between BrPAL1 and BrPAL2
核苷酸位点 BrPAL1/BrPAL2 氨基酸位点 BrPAL1/BrPAL2
574 C/T 192 Leu/Phe
753 C/A 522 Leu/Pro
762 C/T 705 Gly/Asp
777 A/G
1 467 A/T
1 565 T/C
1 594 C/A
2 094 T/C
2 114 G/A
图 7 PAL探针
Fig.7 The probe of PAL gene
1：探针；2：对照；M：分子量标记( D L 2 0 0 0 )。
图 9 UV-A处理不同时间后 BrPAL1和 BrPAL2基因的表达
Fig.9 Expressions of BrPAL1 and BrPAL2 genes after treatments by UV-A for different times
图 8 UV-A处理 0和 48 h后BrPAL1和 BrPAL2基因的表达
Fig.8 Expressions of BrPAL1 and BrPAL2 genes after
treatments by UV-A for 0 and 48 h
为了更好地了解BrPAL1和BrPAL2基因的表
达量和UV-A处理时间长短的关系，用不同的光照
时间处理两种芜菁进行Northern杂交的结果(图 9)
显示，BrPAL1基因的表达量在光照 6 h后增强，
光照 24 h后表达量达到最高水平；BrPAL2基因
的表达在光照后明显增强，光照 48 h后表达量达
到最高水平。以上试验结果说明UV-A处理能够诱
导 BrPAL1和BrPAL2基因表达，基因的表达量与
光照时间相关。
讨　　论
PAL (EC4.3.1.5)是植物次生物质代谢系统中
的关键酶，花青素、香豆素及木质素等物质的合
成均与 PAL活性密切相关(Buchanan等 2002)。本
文克隆津田芜菁 BrPAL1基因和赤丸芜菁 BrPAL2
基因并进行生物信息学分析，BrPAL1和 BrPAL2
的核苷酸序列及推导的氨基酸序列之间有微弱差异
说明二者高度同源。
植物在进化过程中产生一系列的减轻太阳射
线伤害的方法，其中之一就是在叶子和根的表皮
层细胞中积累诸如花青素之类的保护性色素，由
此削弱 UV-B 辐射对内部细胞的伤害(Braun和
Tevini 1993)。我们实验室的相关研究已经证明，
UV-A可以诱导津田芜菁块根皮中花青素的积累和
催化酶基因的表达(Zhou等 2007)。以UV-A处理
两种芜菁后，BrPAL1和 BrPAL2基因的表达有相
似性，说明UV-A处理可以诱导这两个 PAL基因
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的表达，表达量与处理时间存在相关关系。已有
研究表明，光照诱导的类黄酮类化合物积累之
前，几种类苯丙醇(phenylpropanoid)和类黄酮合成
途径的酶类基因，如 PAL和 CHS，就开始受到
诱导表达，这可以解释黑暗条件下 PAL基因仍有
极微弱表达的原因(Hahlbrock和 Scheel 1989；
Schmelzer等 1988)。Lo和 Nicholson (1998)用恒
定光处理高粱(Sorghum bicolor)白化苗后，其中胚
轴内花青素积累过程中 PAL的表达量也有类似现
象，在一定时间范围内，PAL基因的表达量随光
照时间的延长而逐渐增加。这与果实成熟过程中
有花青素生物合成关键酶基因 PAL表达的报道是
类似的(Jaakola等 2002)。
迄今非依光型花青素的生物合成机制尚未得
到阐明。Cone等(1993)的研究表明，玉米的 pl基
因是MYB型转录因子家族中的成员，可控制玉米
花青素生物合成途径中许多结构基因的转录。显
性 Pl等位基因能促使植物性器官和花器官强烈非
依赖光的着色；而隐性等位基因 pl则是光依赖性
的，它只能促使接受光照的组织着红色。从生物
学特性而言，赤丸芜菁块根皮着色属于非依光
型，而 Northern杂交结果显示 UV-A可以诱导
BrPAL2基因的表达，由于 PAL是家族基因，从
而推测在赤丸芜菁中有可能存在不同的花青素生物
合成途径或相关基因家族成员，有的基因负责非
依光型花青素的生物合成，而有些基因的表达则
负责应答光诱导。这显示津田芜菁和赤丸芜菁花
青素合成之间也可能存在不同的光信号转导因子和
途径，对此问题今后似可以通过 Southern杂交分
析两类的 PAL基因的拷贝数，分离家族基因和调
控基因，研究它们在块根着色过程中的作用和涉
及的光信号转导途径，以探明依光型和非依光型
花青素生物合成机制。
参考文献
刘仕芸, 黄艳岚, 张树珍(2006). 植物花青素生物合成中的调控基
因. 植物生理学通讯, 42 (4): 747~754
万小荣, 李玲(2002). 植物的MYB蛋白. 植物生理学通讯, 38 (2):
165~170
许志茹, 李玉花(2006). 利用 cDNA微阵列分离津田芜菁花青素
生物合成相关基因. 遗传, 28 (9): 1101~1106
Buchanan BB, Gruissem W, Jones RL (2004). 瞿礼嘉, 顾红雅, 白
书农, 赵进东, 陈章良主译. 植物生物化学与分子生物学. 北
京: 科学出版社, 1057~1082
Bieza K, Lois R (2001). An Arabidopsis mutant tolerant to lethal
ultraviolet-B levels shows constitutively elevated accumula-
tion of flavonoids and other phenolics. Plant Physiol, 126
(3): 1105~1115
Bogs J, Jaffe FW, Takos AM, Walker AR, Robinson SP (2007).
The grapevine transcription factor VvMYBPA1 regulates
proanthocyanidin synthesis during fruit development. Plant
Physiol, 143 (3): 1347~1361
Braun J, Tevini M (1993). Regulation of UV-protective pigment
synthesis in the epidermal layer of rye seedlings (Secale
cereale L. cv. Kustro). Photochem Photobiol, 57 (2): 318~323
Chatterjee M, Sharma P, Khurana JP (2006). Cryptochrome 1
from Brassica napus is up-regulated by blue light and controls
hypocotyl/stem growth and anthocyanin accumulation. Plant
Physiol, 141 (1): 61~74
Cone KC, Cocciolone SM, Burr FA, Burr B (1993). Maize antho-
cyanin regulatory gene pl is a duplicate of c1 that functions
in the plant. Plant Cell, 5 (12): 1795~1805
Frohnmeyer H, Staiger D (2003). Ultraviolet-B radiation-medi-
ated responses in plants. Balancing damage and protection.
Plant Physiol, 133 (4): 1420~1428
Hahlbrock K, Scheel D (1989). Physiology and molecular biol-
ogy of phenylpropanoid metabolism. Ann Rev Plant Physiol
Plant Mo1 Biol, 40 (6): 347~369
Jaakola L, Maatta K, Pirttila AM, Torronen R, Karenlampi S,
Hohtola A (2002). Expression of genes involved in antho-
c y a n i n b i o s yn t h e s i s i n r e l a t i o n t o a n t h o c y a n i n ,
proanthocyanidin, and flavonol levels during bilberry fruit
development. Plant Physiol, 130 (2): 729~739
Khar A, Jakse J, Havey MJ (2008). Segregations for onion bulb
colors reveal that red is controlled by at least three loci. J
Am Soc Hort Sci, 133 (1): 42~47
Lo SC, Nicholson RL (1998). Reduction of light-induced antho-
cyanin accumulation inoculated sorghum mesocotyls. Plant
Physiol, 116 (3): 979~989
Schmelzer E, Jahnen W, Hahlbrock K (1988). In situ localization
of l ight-induced chalcone syntha se mRNA, chalcone
synthase, and flavonoid end products in epidermal cells of
parsley leaves. Proc Natl Acad Sci USA, 85 (9): 2989~
2993
Schwinn K, Venail J, Shang Y, Mackay S, Alm V, Butelli E, Oyama
R, Bailey P, Davies K, Martin C (2006). A small family of
MYB-regulatory genes controls floral pigmentation inten-
sity and patterning in the Genus Antirrhinum. Plant Cell, 18
(4): 831~851
Sheehan MJ, Farmer PR, Brutnell TP (2004). Structure and ex-
pression of maize phytochrome family homeologs. Genetics,
167 (3): 1395~1405
Vanderauwera S, Zimmermann P, Rombauts S, Vandenabeele S,
Langebartels C, Gruissem W, Inze D, Van Breusegem F (2005).
Genome-wide analysis of hydrogen peroxide-regulated gene
expression in Arabidopsis reveals a high light-induced tran-
scriptional cluster involved in anthocyanin biosynthesis.
Plant Physiol, 139 (2): 806~821
Weiss D, Halevy AH (1991). The role of light reactions in the
regulation of anthocyanin synthesis in Petunia corollas.
Physiol Plant, 81 (1): 127~133
Zhou B, Li Y, Xu Z, Yan H, Homma S, Kawabata S (2007).
Ultraviolet-A specific induction of anthocyanin biosynthesis
in the swollen hypocotyls of turnip (Brassica rapa). J Exp
Bot, 58 (7): 1771~1781