全 文 ：植物生理学通讯 第41卷 第6期，2005年12月820
一种适用于酸性转化酶蛋白定量的酶联免疫吸附法
潘秋红* 刘艳艳 刘洪涛
中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083
A Method for Quantitative Determination of Acid Invertase Amount by En-
zyme-linked Immunosorbent Assay
PAN Qiu-Hong*, LIU Yan-Yan, LIU Hong-Tao
College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China
提要 利用纯化的苹果果实可溶性酸性转化酶蛋白及其多克隆抗体，建立了一套适合于果实酸性转化酶蛋白定量测定的
酶联免疫吸附方法(ELISA)。以 ABA 对苹果、葡萄果实酸性转化酶蛋白量的调节为例，从方法学的角度对 Western blot-
ting 和 ELISA 进行了比较，显示出 ELISA 具有定量分析的优势以及操作简便、灵敏度高的特点。
关键词 酸性转化酶；定量；酶联免疫吸附分析(ELISA)
收稿 2005-04-07 修定 　 2005-10-18
资助 中国博士后科学基金(200435378)。
*E-mail: panquih@263.net, Tel: 010-62737553
酸性转化酶能不可逆地降解蔗糖形成葡萄糖
和果糖，在库细胞蔗糖的代谢转化和库强调节中
起作用，它与植物对受伤反应和对病原防卫以及
低温适应性有关，有关酸性转化酶调控的研究已
得到广泛关注[1~3]。在酶活性调控的研究中，常
用蛋白质免疫印迹(Western blotting)技术检测酶蛋
白合成量的变化，以此来判断酶是否在蛋白水平
上受到调节。但蛋白免疫印迹技术有一些缺点，
它只能依据酶蛋白的免疫检测信号强弱分析酶蛋白
的含量变化，是一种定性或半定量的方法。本文
用高特异性的酸性转化酶抗体，建立了一套定量
测定酶蛋白含量的竞争性间接酶联免疫吸附方法
(ELISA)，并与Western blotting进行比较，以期
能为酶活性调控机制的研究提供一种方法。
材料与方法
1 材料
以八年生的新红星苹果树(Malus domestica
Borkh. cv. Starkrimson)和四至五年生巨峰葡萄株
(Vitis vinifera L.×V. lubrusca L. cv. Kyoho)为试材。
2 ABA温育果实圆片的实验
参照文献 4 和 5 的方法并稍加改动。基础温
育液的组成为：50 mmol·L-1 2- 吗啉代乙磺酸(pH
5.5)、1 mmol·L-1 EDTA、5 mmol·L-1 抗坏血酸、
5 mmol·L-1 CaCl2、1 mmol·L-1 MgCl2、200 mmol·L-1
甘露醇。用取样器分别将盛花后 100 d 的苹果果
实分割成直径 1.0 cm、厚 0.1 cm 的圆片，盛花
后60 d 的葡萄果实分割成 0.1 cm 厚的圆片，在
基础温育液中平衡30 min 后，用外源ABA 处理：
分别取 20 g 的果实圆片，放入盛有 60 mL 温育
介质的三角瓶中，温育介质为基础温育液加 0、
5、20 mmol·L-1 (±) ABA (ABA用少量乙醇溶解) ；
以基础温育液中加入乙醇(终浓度不超过0.1%)为
对照。于 25℃下振荡温育 4 h，取出圆片，用
双蒸馏水冲洗 3 遍，吸干，用液氮速冻，每种
处理设 2 个独立重复。
3 抗原和抗体的制备及其质量检测
参照前文[6]方法进行。即依次通过硫酸铵沉
淀、阴离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等步
骤从苹果果实中纯化出可溶性酸性转化酶，经
SDS-PAGE 检测达到电泳纯；用该纯化酶免疫兔
子，获得兔抗血清，经硫酸铵沉淀、阴离子交
换层析和偶联过氧化物酶的亲和层析，获得对酸
性转化酶有特异性的多克隆抗体；经免疫沉淀检
测，该抗体对酸性转化酶活性的抑制率达87.9%。
表明所获得的抗体对酸性转化酶有较强的特异性。
4 酸性转化酶提取与活性测定
参照文献 6 和 7 的方法。
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5 酸性转化酶的Western blotting
参照文献 6 的方法。
6 酸性转化酶蛋白含量的ELISA
包被：将电泳纯的苹果果实中可溶性酸性转
化酶(soluble acid invertase，SAI)蛋白溶于包被液
(15 mmol·L-1 碳酸钠缓冲液，pH 9.6)中至终浓度
为10 mg·mL-1，在酶标板的反应孔内准确加入SAI
包被液各 100 mL，再放于湿盒中，于 37℃下保
温 2 h 后；静置于 4℃冰箱中 48 h。
免疫反应：(1)在若干0.5 mL硅化的离心管中
分别加入200 mL经过一系列稀释的纯化的苹果
果实SAI蛋白(每管中每100 mL反应液中分别含有
2 000、500、125、31.25、7.81、0 ng 的标准
SAI 蛋白)和待测样品液，然后向各管中加入 200
mL 稀释酸性转化酶多克隆抗体(1∶3 000)，该抗
体用封闭液[10 mmol·L-1 Na2HPO4-KH2PO4 (pH 7.5)、
150 mmol·L-1 NaCl、3 mmol·L-1 KCl、0.05%
Tween-20、1% BSA]稀释；抗原与抗体充分混匀
后，置于 37℃培养箱中温育 1 h 后，再放在 4℃
冰箱中 24 h。(2)取出酶标板，弃去包被液，用
洗涤缓冲液[10 mmol·L-1 Na2HPO4-KH2PO4 (pH 7.5)、
150 mmol·L-1 NaCl、3 mmol·L-1 KCl、0.05%
Tween-20]洗涤 3遍。向各孔中加入100 mL 封闭
液，酶标板置于湿盒中，于37℃下温育2 h。(3)
用洗涤缓冲液洗涤各孔 3 遍。在酶标板的各孔内
加入上述经免疫反应的标准SAI蛋白液或待测样品
液100 mL (平行 3个重复)，以加入100 mL 免疫
前兔血清的孔为阴性对照(平行3个重复)，然后将
酶标板置于湿盒中，于37℃下温育2 h。(4)取出
酶标反应板，用洗涤缓冲液洗涤 3~4 遍之后，在
加洗涤液的孔内仍加入100 mL洗涤液，其余各孔
加入100 mL稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗
兔IgG (1∶500)，于 37℃下温育1 h。(5)取出酶
标板，洗涤各孔5遍，接着向各孔内加入100 mL
底物反应液[0.1 mmol·L-1 Na2HPO4-柠檬酸(pH 5.0)，
含0.4 mg·mL-1邻苯二胺和1.5 mL·mL-1 30% H2O2]，
室温下反应20 min，加入50 mL 2 mol·L-1 H2SO4终
止反应。在酶标测定仪上测定其在波长490 nm处
的 OD 值，以加入洗涤液的孔为空白调零孔。用
每孔标准SAI蛋白含量(ng)的对数为横坐标，以测
得的对应 O D 值为纵坐标，绘制标准曲线。
结果与讨论
1 酸性转化酶ELISA的基本原理和测定结果计算
酸性转化酶蛋白定量的ELISA 依据竞争性固
相抗原法的原理，即固相抗原(antigen-solid，
AgS，即包被于酶标板反应孔中的酸性转化酶蛋
白)和液相抗原(antigen-liquid，AgL，即加在硅
化离心管中的酸性转化酶蛋白) 对特异性抗体
(antibody，Ab，即兔抗酸性转化酶抗体)的竞争
性结合，AgL 先与 Ab 结合形成 AgL-Ab 复合物，
剩余的 Ab 再与预先吸附于酶标板上的一定量的
AgS 结合，形成 AgS-Ab 复合物。由于 Ab 为有限
量，而 AgL 与 AgS 量之和超过 Ab 上的有效结合
位点，因此，在这个系统中，A g L 越多，形成
的AgL-Ab 复合物就越多，形成的AgS-Ab 复合物
量就越少，当加入酶标二抗(Ab 2E，即辣根过氧
化物酶标记的羊抗兔血清)时，形成的 AgS-Ab-
Ab2E 三元复合物就少[二抗(Ab2)与 AgS-Ab复合物
中Ab的Fc(fragment crystallizable)段相结合]，二
抗中酶的显色反应就越浅，OD 值也越小，反之
亦然。同系列浓度的 Ag L 就得到系列的 OD 值，
据此绘制标准曲线，从样品的 OD 值即查出待测
AgL 的量。在一定的范围内，OD 值对 AgL 的对
数呈一定的线性关系。
2 抗酸性转化酶的抗体最佳稀释倍数的确定
在进行ELISA 测定之前，首先确定抗体的最
佳稀释度，这是影响 ELISA 灵敏度的重要因素。
不同稀释倍数(1 000~3 000 倍)的一抗工作液的
ELISA标准曲线表明：稀释1 000和 2 000 倍的抗
体在测定范围的低含量区(7.8~500 ng)不敏感，说
明这两个稀释度的 SAI 抗体工作液不适合于范围
为 7.8~2 000 ng的酸性转化酶测定；而当用稀释
3 000 倍的苹果果实 SAI 抗体工作液进行测定时，
电泳纯的苹果果实SAI蛋白含量(7.8~2000 ng)的对
数与其在酶联免疫反应中对应的OD值呈极显著的
线性相关(Y=-0.082X+0.4479，R2=0.9935)，表明
该稀释度的一抗工作液适合于这一范围的酸性转化
酶蛋白的测定。
3 ABA对苹果和葡萄果实中酸性转化酶蛋白含量
的调节
3.1 ABA 对苹果果实中SAI 和细胞壁酸性转化酶
(cell wall acid invertase，CWI)的调节 从图1可
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以看出，用 A B A 溶液温育果实圆片后，苹果果
实SAI 和 CWI 活性明显增加，且随着处理浓度的
增大，增加更明显。用 ELISA 测定其蛋白含量，
结果显示，无论是 SAI 或是 CWI，与相同处理的
对照相比，ABA 处理的酶蛋白含量均增加，但差
异并不显著。Western blotting分析表明，用抗SAI
抗体，在苹果果实可溶性组分和细胞壁组分的
SDS-PAGE条带上均特异性地识别出3条多肽，其
表观分子量分别为 68、50 和 30 kD，说明苹果
果实中可能存在 3 种酸性转化酶的同工酶。ABA
处理与对照之间，这 3 条多肽的免疫检测信号强
度均没有明显可见的差别。ABA 对苹果果实 SAI
和 CWI 的激活作用可能是受翻译后的调节。
3.2 ABA 对葡萄果实中SAI 和 CWI 的调节 ABA
对葡萄果实中 SAI 和 CWI 活性也有明显的激活作
用(图2)。Western blotting分析显示，用苹果果
实SAI的抗体，可在葡萄果实蛋白质的SDS-PAGE
条带上特异性识别出一条分子量为60 kD的多肽，
它与Ruffner等[8]用抗葡萄SAI抗体检测到的葡萄
果实中 SAI 的分子量完全相同。SAI 和 CWI 免疫
检测信号强度与相应的酶活性呈现几乎一致的变化
规律。用 ELISA 测定这两种酸性转化酶蛋白含量
的结果同样显示，在不同浓度 ABA 预温育的圆片
中，其 SAI 和 CWI 蛋白量均呈现明显可见的增
加。与未经 ABA 预温育的对照相比，20 和 100
mmol·L-1 ABA温育的圆片中，SAI蛋白含量增加了
50% 和 110%, CWI 蛋白则增加 2 倍多。这些结果
表明 ABA 对酸性转化酶的激活作用是通过增加其
基因表达量实现的。
从上可以看出，Western blotting与ELISA的
分析结果基本相符。Western blotting方法虽然可
显示细胞中所存在的酸性转化酶同工酶和各个同工
图1 ABA温育苹果果实圆片中SAI和 CWI活性和含量的变化
a 和 d 分别为 SAI 和 CWI 活性；b 和 e 分别为 SAI 和 CWI 蛋白含量；c 和 f 分别为 SAI 和 CWI 的 Western blotting。
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图2 ABA预温育对葡萄果实圆片中SAI和 CWI活性和含量的影响
a和 d分别为 SAI 和 CWI 活性； b 和 e分别为 SAI 和 CWI 的数量；c和 f分别为 SAI 和 CWI 的 Western blotting。
酶的定性变化情况，但应用此法时通常必须先将
粗提液浓缩以提高其中蛋白质浓度，尤其是果
实，其蛋白含量很低[20~40 mg·g-1(FW)]，浓缩
操作较为繁琐，工作量大，而且容易造成蛋白的
损失。ELISA 法可采用粗提液直接测定，操作简
便，所需样品少，对蛋白含量较少的材料(如果
实等)更加适用，更重要的是，它还能定量地反
映酶蛋白含量的变化情况。在酸性转化酶调控的
研究中，这两种方法结合使用可取长补短。
这里还应指出的是，SAI 和 CWI 是由同一基
因家族的不同基因编码的蛋白[9~11]，它们之间有
很高的抗原相似性，所以抗体和基因探针一般可
以互换 [9~11]。不同植物酸性转化酶之间同源性也
很高，它们的抗体之间也可以互换[12,13]，因此，
抗苹果果实中 SAI 的抗体对苹果果实中 CWI、葡
萄果实中 SAI 和 CW I 都具有相似的免疫学特异
性。用免疫前兔血清代替一抗进行温育而其它步
骤不变的Western blotting中，没有显示免疫蛋白
带(结果未列出)。这说明本实验中苹果果实中SAI
抗体对苹果果实中 CWI、葡萄果实SAI 和 CWI 蛋
白的识别是特异的。此外，本文中所用的是多克
隆抗体，尚不能对苹果果实中酸性转化酶的 3 个
同工酶分别定量，它只能反映可溶性组分或细胞
壁组分中酸性转化酶的总含量。
总之，在现有的条件下， ELISA不失为一种
简单的可用于定量测定酶蛋白含量的方法，尤其
是对于蛋白质含量很少的材料(如果实)。为保证
ELISA 的正确使用，根据我们的经验，操作中应
注意以下几点：(1)抗体的特异性要好；(2)测定前
应先确定抗体的最佳稀释浓度，这是影响 ELISA
灵敏度的重要因素；(3)每次测定时标准曲线必须
重新制作；(4)液相抗原与抗体反应需在经硅化处
理过的离心管(这种离心管与抗体之间的附着力很
小，抗体不易吸附于管壁上)中进行，所用的反
应试剂(标准 SAI，一抗、二抗及反应液)需要充
分混匀(在混匀器上振荡1 min以上); (5) ELISA虽
在同一酶标板上有很好的重复性，但由于反应条
件的不一致，板与板之间重现性不佳，故测定前
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需在酶标检测仪上读取每孔消光值，再逐一用每
孔消光值与平均值比较在 10% 以内为合格，同一
批样品尽可能采用消光值一致的酶标板并同时进行
测试；(6)在操作中多次涉及到洗涤，洗涤是否彻
底往往关系到实验的成败，只有彻底洗涤，才能
除去前各步加入的未被结合的抗原、抗体或结合
物，防止它与随后加入的抗体、结合物或底物发
生某些干扰反应，洗涤要严格，每次洗涤时间控
制在1 min 之内，所有小孔采用同样方法严格清
洗，以减少干扰。
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