全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 6期，2008年 12月1082
转基因白桦的花粉活力及外源基因的遗传表达分析
曾凡锁, 王晓风, 骆薇, 詹亚光 *
东北林业大学生命科学学院, 林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室, 哈尔滨 150040
提要: 采用荧光素二乙酸酯(FDA)染色比较分析转基因白桦花粉的活力的结果表明, 转基因白桦的花粉活力均低于非转基
因白桦。应用多重 PCR和Northern杂交技术分析表明, 转基因白桦花粉中有外源基因整合和转录表达。检测转基因白桦
花粉中gus报告基因的活性, 显示gus报告基因在花粉表达。
关键词: 转基因白桦; 花粉活力; 遗传; 表达
Analysis of Pollen Vigor, Inheritance and Expression of Foreign Genes in
Transgenic Birch (Betula platyphylla Suk.) Pollen
ZENG Fan-Suo, WANG Xiao-Feng, LUO Wei, ZHAN Ya-Guang*
College of Life Science, Key Laboratory of Forest Tree Improvement and Biotechnology of Ministry of Education, Northeast Forestry
University, Harbin 150040, China
Abstract: With method of FDA fluorescence, the pollen viability in transgenic birch was analysized. The results
showed that the pollen viability in different transgenic birch plants were lower than those in control. Integration
and expression of foreign genes in transgenic birch pollen were detected by Multiplex-PCR and Northern blotting. The
results indicated that foreign genes in transgenic birch could be transmitted to the pollen and could express in the level
of transcription. The histochemical GUS assay showed that gus gene could express in the level of translation.
Key words: transgenic birch (Betula platyphylla); pollen vigor; inheritance; expression
收稿 2008-08-28 修定 2008-10-27
资助 东北林业大学青年科研基金(07028)和黑龙江省攻关项
目(GB06B303-8)。
* 通讯作者(E-mail: yaguangzhan@126.com; Tel: 0451-
8 2 1 9 1 7 5 2 )。
自转基因杨树获得成功以来, 相继又有多例外
源基因可以在林木中稳定表达的报道。迄今已有
多种类型的转基因树木, 具有人类所期望的多种品
质, 如耐除草剂、抗虫、抗病、抗环境胁迫、木
质素得到改良、激素水平的调节以及次生代谢改
变等(Pilate等2002; Eriksson等2000; Wang和Con-
stable 2004; Seppänen等 2004), 有的已经进入商品
化阶段。詹亚光等(2003)采用农杆菌介导法将蜘
蛛杀虫肽和 Bt基因 C肽序列的嵌合基因(bgt)导入
白桦基因组, 获得的转基因白桦植株有稳定的抗虫
性。这种转抗虫基因的白桦栽植在温室内于自然
光照下生长, 可以开花结实。转基因植物花粉活力
的研究是进行遗传改良和转基因生态风险评价的一
项基础工作, 既是保证杂交成功的关键, 又与种子
的产量与品质密切相关。本文就是基于此种目的,
探讨转基因白桦花粉中是否遗传有外源基因、外
源基因转录表达与花粉粒的gus报告基因表达及分
离情况, 以供生产中人工授粉和转基因生态风险评
价研究参考。
材料与方法
实验材料为我们实验室采用农杆菌介导法获
得的转抗虫基因白桦(Betula platyphylla Suk.)。工
程菌为根癌农杆菌 LBA4404 (Agrobac terium
tumefaciens), 携带双元载体系统, 其中质粒 pYHY,
长 13.9 kb, 携带抗虫基因(bgt基因)、nptII基因和
gus基因。转抗虫基因白桦栽植于我校白桦强化育
种温室内, 2008年春季部分转基因白桦开花。4月
末采集转基因白桦的 11个无性系(TP33、TP42、
TP53、TP55、TP56、TP61、TP69、TP89、
TP90、TP94和 TP109)花枝, 于室内水培。散粉
时收集花粉, 干燥后密封保存于 4 ℃冰箱中备用。
荧光素二乙酸酯(FDA)荧光染色测定花粉的活
力利用浓度为100 µg·mL-1 FDA荧光染料对转基因
白桦的 11个无性系花粉样品和非转基因白桦的 3
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个样品, 分别染色 10 min, 在荧光显微镜下观察花
粉的荧光染色率。
改良的 CTAB法(詹亚光和曾凡锁 2005)提取
多糖含量较多的转基因白桦花粉总DNA, 采用紫外
分光光度法结合琼脂糖凝胶电泳法测定DNA 纯度
和浓度。多重 PCR (詹亚光等 2006)设计 3对引物
应用于 3个外源基因(bgt、gus和 nptII)的检测。扩
增反应体系为 30 µL, 内含 3 µL 10×PCR缓冲夜、
2.5 µL dNTP混合物(2.5 mmol·L-1)、2 µL MgCl2
(25 mmol·L-1)、引物(10 µmol·L-1)各 1 µL、1.5 µL
模板DNA (1 ng·µL-1)、0.3 U DNA聚合酶(5 U·µL-1),
最后以双蒸水补足 30 µL。时间设置 94 ℃预变性
5 min; 94 ℃变性 30 s, 58 ℃退火 30 s, 72 ℃保持
45 s, 共运行 30个循环; 72 ℃延伸 10 min, 产物经
1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。
以缓冲液冰浴 -CTAB法(曾凡锁等 2007)提取
花粉 RNA, Northern杂交操作参照《分子克隆实
验指南》(萨姆布鲁克和拉塞尔 2002), 稍加修改后
进行。
以组织化学法检测gus报告基因活性, 将准备
好的适量花粉加入离心管, 浸泡在GUS检测液中,
于 37 ℃中保温 1 h或在此温度下过夜。稍离心后
去除检测液并加入 70%乙醇中脱色 2~3次。然后
以离心方法去除上清液, 加入适量去离子水悬浮花
粉。吸取少量花粉悬液滴在凹面载玻片的凹槽里,
盖上盖玻片, 于显微镜下观察、照相并统计 gus基
因分离情况。
结果与讨论
1 转基因白桦花粉活力的荧光染色测定
采用浓度为100 µg·mL-1 FDA荧光染料对转基
因白桦和非转基因白桦花粉分别染色10 min, 在荧
光显微镜下检测花粉的荧光染色结果(图 1和 2)显
示, 转基因白桦不同无性系的花粉均有活力, 但不
图 2 转基因和非转基因白桦花粉的 FDA染色比较
Fig.2 Comparison on pollen in transgenic and non-transgenic birch by FDA fluorescence staining
图 1 FDA荧光染色测定转基因白桦及非转基因花粉的活力
Fig.1 Pollen viability detected by FDA fluorescence staining in transgenic and non-transgenic birch
对照 1、2、3 为非转基因白桦花粉, 其余为不同转基因白桦无性系花粉。
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同无性系间的花粉活力有明显差异; 转基因白桦与
非转基因植株的花粉活力差异显著, 3个非转基因
花粉 FDA染色率平均值为 76.54%, 高于转基因花
粉的最高染色率 63.57%。
花粉活力是杂交成功的先决因子, 它不仅与品
种有关, 同时与开花时外界环境因素(温度、湿度
等)密切相关(李训贞等 2002)。由于转基因插入、
组织培养的变异以及转基因表达等多种原因, 转基
因植物与其受体相比, 必然引起一些性状的变化。
有研究显示外源基因插入对宿主植物花粉活力无显
著影响(魏兴华等 2005)。也有一些研究表明转基
因植物的花粉活力明显低于非转基因植株(Yin等
2004)。许多研究表明转基因的存在可能影响配子
的发育和成熟, 导致转基因不能有效地通过配子传
递给子代, 从而造成转基因的分离异常。一般认为
转基因通过花粉传递的能力要小于卵细胞, 因而以
转基因植株作母本更有利于转基因的传递, 原因可
能是转基因植株花粉的发芽力、花粉管伸长能力
与受精能力低于相应的非转基因植株, 也可能外源
基因插入到影响花粉活力的基因位点上(周静等
2006)。本研究中转基因白桦不同无性系的花粉均
有活力, 但不同无性系间的花粉活力有明显差异, 而
转基因与非转基因植株的花粉活力也差异显著。
这可能主要是由于转基因白桦中外源基因插入影响
了雄配子体的发育进而降低了花粉活力。
2 转基因白桦不同无性系花粉的多重PCR检测
图 3表明, 在所有的转基因植株中 3个基因的
扩增产物条带清晰, 梯度明显, 显示各转基因白桦
无性系的外源基因能在花粉中整合。
3 转基因白桦花粉中bgt基因转录表达的Northern
杂交分析
抽提花粉RNA, 通过紫外分光光度计定量, 每
个样品 20 µg。采用Northern杂交分析转基因白
桦花粉中外源基因的转录表达, 选用转基因白桦的
bgt基因为探针进行杂交。如图 4所示, 甲醛变性
胶电泳的总RNA各样品条带亮度基本一致且没有
降解, 可以进行杂交, bgt嵌合基因的杂交条带清晰
完整, 但各个样品间的 RNA表达水平并不一致,
TP61、TP53 的表达量较低。
4 转基因白桦花粉中 gus报告基因的活性检测
由多重 PCR检测和Northern杂交分析可知在
转基因白桦花粉中有外源基因整合与转录表达, 但
这两种方法都是以转基因白桦各个植株的花粉总体
为研究对象初步揭示整合与转录表达情况, 未能揭
图 3 转基因白桦花粉的多重 PCR电泳图谱
Fig.3 Multiplex PCR of total genomic DNA from transgenic birch pollen
1: 阴性对照; 2~6、8~11泳道: 转基因白桦不同无性系花粉 DNA; 7: DL2000 分子量; 12: 阳性对照。
图 4 转基因白桦花粉 bgt基因的Northern杂交图谱
Fig.4 Northern blotting analysis of bgt gene in transgenic birch pollen
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示外源基因在花粉中具体的分离情况。因此, 本文
进一步检测了转基因白桦花粉的GUS活性, 并在显
微镜下观察、照相并统计 gus基因在转基因白桦
花粉中的表达和遗传分离情况。如图 5可知, gus
报告基因在转基因白桦花粉中能够正常表达, 但不
是所有的花粉粒都有GUS酶活性, 从而初步证明
gus报告基因在转基因白桦花粉中有分离。转基因
白桦 TP69的花粉表达比率最高为 38.53:1, 最低的
TP109为0.12:1 (表1), 说明不同的转基因白桦无性
系的花粉中gus报告基因的表达水平和遗传分离的
图 5 转基因和非转基因白桦花粉GUS酶活性比较
Fig.5 Comparison on GUS activity in transgenic and non-transgenic birch pollen
差异较大。
外源基因要正常传递给子代, 首先在减数分裂
形成配子时, 外源基因必须能够正常分配给雌雄配
子, 而且雌雄配子的存活能力也要相当。研究表
明, 外源基因的遗传特性与转化方法有关。目前大
部分转基因植物主要是应用农杆菌介导法和基因枪
法获得。多数学者认为农杆菌介导的遗传转化具
有外源基因整合位点单一、遗传稳定的优点, 而基
因枪转化法表现出外源基因整合多拷贝、多位点
导致遗传、表达不稳定的不足。也有报道称不管
用什么转化方法, 基因整合一旦发生, 外源DNA 都
有可能在减数分裂过程中保持下来, 从而稳定地遗
传给后代(Rooke等 2003)。然而, Sangtong等
(2002)在转基因玉米中发现小麦Glu-1DX5基因不
能有效地通过花粉进行传递。Gahakwa等(2000)
则用碘染的方法在某些转基因水稻的R2子代植株
中观察到畸形的花粉粒, 在这些植株的R3子代中外
源基因呈现1:1异常分离。有研究表明雌配子的不
育也可以导致外源基因的异常分离。如Aragão等
(1996)发现外源基因的插入可能导致与卵细胞受精
和 /或发育必需的基因发生插入突变, 结果导致转
基因碗豆中 gus、neo、AC123和BC1基因异常分
离。Limanton-Grevet和 Jullien (2001)也发现外源
基因只能通过雄配子进行传递, 产生这一现象的原
因可能是插入突变影响了雌配子的存活能力。目
前研究表明, 外源基因可能从以下几个方面影响配
子存活能力: 外源基因的表达产物干扰配子的发育
和成熟; 外源基因导致与配子发育成熟必需的基因
发生插入突变; 转化过程导致的染色体异常也可能
影响配子的竞争能力(周静等 2006)。
本文表明各转基因白桦无性系的花粉活力虽
表 1 转基因白桦花粉 gus基因的分离
Table 1 Segregation of gus gene in transgenic birch pollen
转基因白桦无性系 GUS活性检测分离比
T P3 3 3.26:1
T P4 2 4.80:1
T P5 3 2.43:1
T P5 5 7.10:1
T P5 6 3.76:1
T P6 1 3.24:1
T P6 9 38.53:1
T P8 9 1.75:1
T P9 0 7.00:1
T P9 4 3.32:1
TP1 09 0.12:1
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均低于非转基因白桦花粉, 但均有一定的活力。多
重 PCR检测也表明外源基因在转基因白桦花粉中
均有整合, 初步揭示了外源基因通过花粉传递的可
能性。同时, 应用 Northern杂交分析表明转基因
白桦花粉中 bgt基因能够转录表达, GUS检测也进
一步表明花粉中报告基因能够正常表达 β-葡萄糖
醛酸酶, 并在转基因不同无性系的花粉粒间表现出
了不同的遗传分离比例。
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