全 文 ：植物学报Chinese Bulletin of Botany 2009, 44 (4): 484-490, w w w .chinbullbotany.com
doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2009.04.010
收稿日期 : 2008-10-15; 接受日期 : 2008-11-26
基金项目: 国家自然科学基金(No.30872045)、东北林业大学青年科研基金(No.07028)和东北林业大学本科生创新项目(No.
2007003)
* 通讯作者。E-mail: yaguangzhan@126.com
.技术方法.
转基因白桦中 GUS基因表达的定量分析
曾凡锁 1 ,2 , 钱晶晶1, 康君 1 , 王红艳 1 , 王亦洲1 , 詹亚光 1,2*
1东北林业大学生命科学学院 , 哈尔滨 150040; 2东北林业大学林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室 , 哈尔滨 150040
摘要 以转基因白桦(Betu la pla typhylla)为材料, 采用单酶切结合Southern杂交的方法揭示不同转基因植株中GUS基因的
整合拷贝数为1-4个。采用组织化学染色法定性分析不同整合方式转基因白桦植株中GUS基因的表达。结果表明, 11个转基
因植株中有2株出现了GUS基因沉默, 其余植株均有不同水平的GUS表达。在此基础上应用分光光度法定量分析不同拷贝数
的GUS转基因白桦中b-葡萄糖醛酸酶活性。结果表明, 在11个转基因无性系中除2个株系的GUS基因沉默外, 其它9个转基因
植株中GUS酶活力差异明显, 但这种差异与GUS基因的拷贝数没有必然联系。
关键词 基因表达 , GUS, 整合方式 , 分光光度法 , 转基因白桦
曾凡锁 , 钱晶晶 , 康君 , 王红艳 , 王亦洲 , 詹亚光 (2009). 转基因白桦中 GUS基因表达的定量分析 . 植物学报 44, 484-490.
外源 DNA插入植物基因组中可能导致宿主基因
组结构变化, 这种变化必将对宿主基因和外源基因的
表达产生影响(Kumar and Fladung, 2001)。因此对于
转基因植物尤其是生长周期较长的树木来说, 外源基
因能否稳定地整合和表达至关重要(Fladung, 1999)。
转基因植株中外源基因的表达受到很多因素的影响
(Cervera et al., 2000)。据报道, 与基因整合方式有
关的影响因素有转基因整合的位点数 ( 拷贝数 )
(Elmayan and Vaucheret , 1996; Mishiba et al., 2005;
Tang et al. , 2007)、插入位点的基因组成(即位置效
应)(Iglesias et al. , 1997; Fischer et al. , 2008)以及已
经整合的T-DNA的构型改变(Stam et al., 1997; Zhang
et al., 2008)。
本文以不同整合方式的转基因白桦 (B e t u l a
platyphylla)为材料, 首先采用组织化学染色法定性分
析不同转基因白桦植株中 GUS基因的表达。在此基
础上, 应用分光光度法定量分析不同拷贝数 GUS基
因的转基因白桦中 b-葡萄糖醛酸酶活性, 进而揭示
GUS基因拷贝数对其表达水平的影响。
1 材料与方法
1.1 实验材料
转基因白桦(Betul a platyphylla Suk .)为詹亚光等
(2003)采用农杆菌介导法获得的转抗虫基因白桦。工
程菌为根癌农杆菌(Agrobact erium tume fac iens )
LBA4404, 为双元载体系统, 其中质粒 pYHY, 长 13.9
kb, 携带抗虫基因(蜘蛛杀虫肽基因与 Bt基因 C肽的
嵌合基因, 简称 BGT基因)、NPTII和 GUS基因。转
抗虫基因白桦栽植于东北林业大学白桦强化育种温
室内。
1.2 转基因白桦的Southern杂交
首先进行转基因植株的 Southern blot检测。应用改
良的 CTAB 法(詹亚光和曾凡锁 , 2005)提取多糖含量
较多的转基因白桦总DNA, 采用紫外分光光度法结合
琼脂糖凝胶电泳法测定 DNA 纯度和浓度。将 20 mg
DNA样品以 T-DNA中边界具有单切点的限制性内切
酶 Pst I进行酶切过夜 , 电泳 8-10小时, 凝胶经变性
485曾凡锁等: 转基因白桦中GUS基因表达的定量分析
与中和后, 转膜和紫外交联固定 DNA, 之后分别与地
高辛标记的GUS探针杂交, 杂交操作参照《分子克隆
实验指南》(Sambrook and Russell, 2002)并稍加修改。
1.3 GUS酶活性的组织化学检测
GUS报告基因酶活性采用组织化学染色法检测。在
5月采集转基因白桦成熟叶片 , 用打孔器将白桦叶片
切成小圆片后浸泡在检测液中 , 于 37°C保温 4小时。
检测反应结束后将叶片转入 70%乙醇中脱色2-3次,
至阴性对照材料呈白色。用肉眼或在显微镜下观察,
白色背景下的蓝色小点即为 GUS基因表达位点。
1.4 GUS酶活性的定量分析
用分光光度法检测 GUS酶活性(Richard, 1987; 陈雅
蕙, 2005 )。以对硝基苯基 -b-D-葡萄糖醛酸苷 (P -
nitrophenyl-b- D-glucuronide, PNPG)为底物, GUS催
化其水解, 生成对硝基苯酚(P-nitrophenol), 在 pH值
为 7.15时, 离子化的发色团吸收波长为400-420 nm
的光, 溶液呈黄色。酶反应在 pH 7.0条件下进行, 随
着反应进行, 产物生成, 渐渐碱化, 显色增强。GUS
提取缓冲液: 50 mmol.L-1磷酸钠(pH 7.0), 10 mmol.
L-1 EDTA, 0.1% Triton X-100, 0.1 % Sarcosyl, 6 mmol.
L-1 L-抗坏血酸, 10 mmol.L-1 b-巯基乙醇。GUS 反
应缓冲液: 50 mmol.L-1磷酸钠(pH 7.0), 10 mmol.L-1
EDTA, 0.1% Triton X-100, 10 mmol.L-1 b-巯基乙醇,
1 mmol.L-1 PNPG。GUS 反应终止液: 1 mol.L-1 2-
氨基 -2-甲基 -1, 3-丙二醇(2-ami no-2-methy l-1,3-
propanadiol)。
实验样品提取按以下方法操作。分别取转基因
白桦及非转基因对照叶片约 0.3-0.5 g放入研钵中,
加入GUS提取缓冲液1 000 mL, 同时加入石英砂 , 将
叶片磨碎, 将研磨液转移至1.5 mL离心管中, 加入适
量的不溶性交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP), 剧烈振荡
约 1分钟, 置于 4°C提取约 2小时, 期间颠倒混匀数
次。然后 12 000×g离心 10分钟, 取上清。提取液置
于 -4 0 °C 冰箱保存备用。总蛋白含量测定按照
Bradford法, 制作标准曲线。取待测蛋白样品 20 mL,
加水至 4 mL, 加入 1 mL考马斯亮蓝 G-250溶液, 混
匀, 室温下放置 2分钟, 在 595 nm处测定吸光值。根
据标准曲线计算待测样品的蛋白质含量。
GUS酶反应及比色测定方法如下。取 6支试管
并编号, 分别加入总蛋白含量约为 35 mg的样品GUS
提取液, 再加入反应缓冲液至反应总体积为1 mL, 混
匀后立即向 1号管中加入 400 mL反应终止液。此为
反应 0分钟时样品。其它 5支试管置于 37°C保温, 分
别在 5、10、15、30和 60分钟时向管内加入 400 mL
反应终止液, 形成不同反应时间的样品。酶反应完成
后, 以 0时样品为空白对照 , 测定不同反应时间的样
品的 415 nm的吸光值, 根据对硝基苯酚标准曲线计
算其含量。酶活力计算时先以酶反应时间对生成对
硝基苯酚含量作图, 直线部分斜率即为酶反应初始阶
段的速率。酶活力单位定义为每分钟水解 PNPG生
成 1 nmol.L-1或 1 mg、1 mg对硝基苯酚的酶量为一
个单位。根据定义求出各样品的酶活力。GUS基因
表达活性以每毫克蛋白的酶活力表示, 即将样品酶活
力除以上述测得的样品蛋白含量。
2 结果与讨论
2.1 结果
2.1.1 转基因白桦中GUS基因整合的拷贝数
按照 1. 2节介绍的方法提取转基因白桦不同无性系
的基因组DNA。PstI在GUS基因中没有酶切位点 , 因
此利用 P s t I 酶切转基因白桦基因组 DN A , 通过
Southern杂交就可以确定GUS基因在转基因白桦中
整合的拷贝数。如图 1所示, 在供试的转基因白桦中
GUS基因拷贝数介于 1-4之间。其中有 2株为单拷
贝整合, 2株为 2拷贝, 1株为 4拷贝, 其余为 3拷贝
整合。
2.1.2 组织化学法检测GUS酶表达稳定性
为了确定转基因白桦中GUS基因蛋白水平的表达情
况, 对 11个转基因无性系和非转基因对照叶片进行
组织化学法检测。结果显示, 在转基因植株中有 9株
486 植物学报 44(4) 2009
能够稳定表达 GUS, 根据染色程度可以看出 GUS基
因在各个植株间表达水平的差异明显 , 其中 2 株
(TP30和 TP96)的 GUS基因沉默(图 2)。
2.1.3 转基因白桦总蛋白的提取及定量
白桦是木本植物, 叶片中的多糖和多酚类物质对蛋白
的提取有很大的影响。本实验中, 在提取缓冲液中加
入非水溶性 PVPP, 可以很好地去除大多数色素。L-
抗坏血酸有利于分光检测背景值的降低。选取 11个
转基因白桦无性系 , 以非转基因白桦作为对照。取直
径为 2.5 cm的叶片提取总蛋白 , 然后以 BSA为标准
样品, 制作蛋白含量标准曲线 (图 3)。根据标准曲线
计算所提取样品的总蛋白含量。
2.1.4 转基因白桦GUS基因表达差异的定量
分析
选择 0-4.5 mmol.L-1之间的 28个浓度的对硝基苯酚
制作标准曲线(图 4)。利用该标准曲线可以得出每个
待测样品在不同反应时间生成的对硝基苯酚的含量 ,
然后作出每个待测样品的 GUS 酶反应动力学曲线,
进而根据酶活力定义求得每个待测样品的GUS酶活
力。从表 1和图 5中可以看出各个转基因白桦无性系
的 GUS酶活性有明显差异, 与组织化学染色法的结
果一致。TP30和 TP96两个无性系表现了 GUS基因
沉默现象, TP23、TP36和TP71三个转基因株系GUS
酶活性较高。从表 1中可以看出, GUS基因在 TP30
和 TP52中都为 1个拷贝, 但它们的GUS酶活性却截
然不同, 前者出现了沉默 , 而后者表达水平较高。其
余植株中 GUS基因均为 2-4个拷贝整合, 表达量也
有明显差异 , 如 TP96出现了转基因沉默现象, 而
TP23和 TP36则为表达水平较高的转基因植株。同
为 3个拷贝的转基因白桦无性系的 GUS酶活性也有
较大差异。说明转基因白桦中GUS基因的拷贝数与
表达量不存在必然联系。对GUS基因的拷贝数和表
达量进行相关性分析, 结果表明相关系数 r = 0.154,
P = 0.651(P>0.05), 说明 GUS 基因的整合拷贝数与
表达量之间无相关性(图 6)。
图 1 Ps tI限制性酶切基因组 DNA后 Southern杂交图谱
1: GUS基因阳性对照(2 kb) ; 2-10: 不同转基因白桦无性系 ;
11: 非转基因对照
Figure 1 Southern blot analysis of transgenic birch DNA
diges ted w ith Ps tI
1: Positive control of GUS (2 kb); 2-10: Transgenic birch lines;
11: Negative control
图 2 组织化学染色法检测 GUS酶活性
Figur e 2 GUS activity detected by histochemical staining
图 3 蛋白含量标准曲线
Figur e 3 Standard curve of protein content
487曾凡锁等: 转基因白桦中GUS基因表达的定量分析
2.2 分析与讨论
2.2.1 GUS基因表达分析
以 X-Gluc 为底物, 通过染色反应可直接观察到组织
器官中GUS基因活性的时空分布 , 并可进行GUS活
性的活体定位。此方法不需将该酶从组织中提取出
来, 而是使底物通过简单的扩散或真空渗入 , 被植物
组织、细胞或原生质体吸收。将被检植物材料浸泡
在含有X-Gluc的缓冲液中保温 , 若组织、细胞或原生
表 1 不同拷贝数转基因白桦的 GUS酶活性
Table 1 GUS activity of transgenic birch w ith diff erent copy numbers of GUS
Serial number Sample Copy number GUS activity Unit of enzyme activity (nmol.L-1.min-1.mg-1)
1 TP22 2 p 6.40E-05
2 TP23 3 l 1.11E-04
3 TP30 1 m -
4 TP36 2 p 1.04E-04
5 TP52 1 p 1.36E-05
6 TP68 3 l 4.48E-05
7 TP71 3 p 9.20E-05
8 TP90 3 l 5.03E-05
9 TP91 3 l 4.39E-05
10 TP92 3 p 3.00E-05
11 TP96 4 m -
12 Non-transgenic - m -
l被检测的叶片呈阳性 ; p 被检测的叶片部分呈阳性; m 被检测的叶片呈阴性
l Positive; p Par tly pos itive; m Negative
图 4 对硝基苯酚标准曲线
Figur e 4 Standard curve of P-nitrophenol
图 5 不同整合方式转基因白桦的 GUS酶活力比较
Figur e 5 Comparison of GUS ac tivity in transgenic birch w ith
different copy numbers
图 6 转基因白桦中 GUS基因拷贝数与其表达量的相关性
Figur e 6 Correlation betw een GUS copy number and its
expression level in transgenic birch
488 植物学报 44(4) 2009
质体表达 GUS, 在适宜的反应条件下 , GUS 可将 X-
Gluc水解生成蓝色物质。此靛蓝染料使具有GUS活
性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点, 肉眼或在显微
镜下可以观察到(秦小波等, 2008)。应用此方法检测
GUS基因的表达方便快捷 , 但是该方法只能定性检
测转基因植物中的GUS基因是否表达而不能准确比
较不同转基因植株间 GUS基因表达的差异。本研究
先采用组织化学染色法定性分析不同转基因白桦植
株中 GUS基因的表达。在此基础上应用分光光度法
定量比较了不同拷贝数转基因植株间GUS基因表达
的差异。两种方法相辅相成, 能够方便准确地分析转
基因植物中 GUS 基因的表达。
2.2.2 转基因的拷贝数对其表达的影响
研究表明(Alvarez et al. , 2000; Cervera et al., 2000;
Mishiba et al. , 2005; Tang et al., 2007), 高拷贝的 T-
DNA 插入到同一或不同位点常导致转基因沉默。
Cervera等(2000)在研究转基因柑橘(Citrus ret iculata)
时发现 GUS 表达水平与其基因(uidA )的拷贝数存在
明显的负相关。Tang等(2007)对转基因白松的研究
表明, 在2个或更多拷贝的T-DNA整合时常导致绿色
荧光蛋白基因的沉默。Linn等(1990)发现在转玉米可
凝性球蛋白 A1基因的矮牵牛(Petunia hyhrida)植株
中单拷贝整合的转基因植株通常表现整齐一致的预
期基因表达, 然而有多拷贝整合的转基因植株的启动
子区通常会甲基化而使外源基因不能表达 , 这与
Mishiba等(2005)的研究结果一致。有关支持目的基
因在宿主中的高拷贝导致基因沉默的观点的研究还
有很多(Rathore et al., 1993; Meyer, 1996; Kumpat la
et al., 1997; Yang et al., 1998; Fischer et al. , 2008),
但也有一些研究结果与此观点相反。van der Krol等
(1990)报道在转基因的矮牵牛植株中具单拷贝的转基
因植株中外源基因沉默发生的频率较高。Doming-
uez等(2000)在研究转基因柑橘时发现所有的转基因
品系无论其GUS基因的拷贝数多少 , 其GUS表达活
性均相似。进一步研究表明 , 其目的基因 CTV-CP的
表达与其拷贝数也无相关性。华志华等(2001)在研
究基因枪转化法获得的转基因水稻 (Oryza sat iva)中
外源基因整合与表达时发现转基因拷贝数的多少与
其表达和沉默不存在必然联系。Lech t enberg 等
(2003) 通过对转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)的
研究认为, T-DNA的多拷贝整合及重排并不是外源基
因沉默的诱因, 这与 Iyer等(2000)的研究结果相同。
本研究中 TP30和 TP96为GUS基因转录水平沉默的
植株, 拷贝数分别为 1和 4。而GUS基因以单拷贝或
多拷贝整合的转基因无性系中均有转录水平表达强
的植株, 如 TP23、TP36和 TP71。因此, 在本研究中
外源基因是否发生沉默与其整合的拷贝数不存在必
然联系。
转基因植物中外源基因的表达除受整合方式的
影响外, 整合过程中载体骨架序列的污染、转基因
DNA的甲基化及转基因植物自身的发育调控等因素
均是造成外源基因沉默的原因 (Yang et al. , 2005;
Abdal-Aziz et al., 2006; Fischer et al., 2008; 南楠等,
2008)。在本研究中转基因白桦外源基因的多拷贝整
合并没有造成转基因沉默。因此, 还需进一步分析其
它影响因素, 以确定导致转基因沉默发生的原因。
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2Ke y L aborato ry of Forest Tre e Improvement an d B iotechn olo gy of Min istry o f Educatio n, Northe ast Forest ry
Un ive rsi ty, Ha rbin 15 004 0, Chi na
Abstract To determine the copy number of the transgene, the s ingle- res triction enzyme Pst I w as used to diges t the genomic
DNA. Southern blot analys is of transgenic birch plants indicated that the GUS gene had been integrated into the birch genome.
Among the 11 transgenic birch lines, the copy number of GUS varied from 1 to 4. The expression of the GUS gene w as studied by
his tochemical s taining and spectrophotometry . His tochemical s taining w ith X-gluc show ed the GUS gene s ilenced in TP30 and TP96
plants , and that signif icant dif ferences of GUS activ ity w as observed in other transgenic plants, w ith GUS ac tivity remarkably high
in TP23, TP36 and TP71 plants. How ever, the copy number and expression of the GUS gene w ere not signif icantly related.
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