全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 4期，2008年 8月 797
细胞分裂素氧化酶 /脱氢酶的生理生化和分子特性
张芬, 郭得平 *, 林明丽, 闫淼淼
浙江大学农业与生物技术学院园艺系, 杭州 310029
Physiological, Biochemical and Molecular Properties of Cytokinin Oxidase/
Dehydrogenase
ZHANG Fen, GUO De-Ping*, LIN Ming-Li, YAN Miao-Miao
Department of Horticulture, College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China
提要: 文章对细胞分裂素氧化酶/脱氢酶(CKX)的结构、生理生化特性、基因功能及表达调控等方面的研究进展作了介绍。
关键词: 细胞分裂素氧化酶 /脱氢酶(CKX); 特性; 植物激素; 基因表达
收稿 2008-05-04 修定 2008-07-01
* 通讯作者(E-ma i l : dpgu o@zju . edu .c n; T e l : 0 5 7 1 -
8 6 9 7 1 1 2 1 )。
细胞分裂素(cytokinins, CKs)是一类在N6位置
上取代的腺嘌呤衍生物, 对植物生长发育起重要调
节作用。植物细胞内的 CKs动态平衡受合成和降
解等过程调控。有关CKs合成途径的研究较多, 机
制较为明确, 在此不再赘述。CKs的降解由细胞分
裂素氧化 /脱氢酶(cytokinin oxidase/dehydrogenase,
CKX)催化, CKX是目前已知的惟一的专一催化天
然异戊烯类CKs及其核苷的不可逆降解的酶, 如异
戊烯基腺嘌呤(isopentenyl adenine, iP)、玉米素
(zeatin, Z)等及其核苷(邓江明和潘瑞炽 1997)。此
酶最早由 Paces等(1971)在烟草细胞中发现, 之后
又相继在玉米、小麦和拟南芥等植物中报道
(Armstrong 1994; Galuszka等 2001, 2004)。最近,
CKX的研究取得很大进展, 本文就其生理生化和分
子特性作一介绍。
1 CKX的生化特性
1.1 CKX的辅酶结构和催化功能 CKX的辅酶结
构是其活性的重要基础, 也一直是研究的热点。研
究发现, 玉米ZmCKX1基因的氨基酸序列69~105处
存在的一个束缚态 FAD 区域为其辅酶结构, 在
104~106处存在GHS (Glu-His-Ser)序列模式。CKX
酶通过His与 FAD共价结合(Hare和Van Staden
1994)。CKX既可以发生氧化作用, 也可以在无氧
条件下通过电子受体(苯醌)发生脱氢作用。氧化
反应对底物特异性要求不严格, 能以极低的速率催
化芳环侧链的 C K s 降解, 如 6- 苄基腺嘌呤(6 -
benzyladenine, 6-BA)。如果有合适的电子受体,
CKX会以脱氢的方式发生作用, 其高度专一性底物
为含有不饱和异戊烯类侧链的 CKs。CKX的催化
机制可能是: CKs先与FAD形成共价中间产物, 随
后中间产物降解成氧化态FAD及亚胺化合物, 此化
合物进一步水解成腺嘌呤和不饱和醛(3-甲基 -2-
丁烯醛) (Malito等 2004)。
1.2 CKX的底物专一性 CKX对 CKs有很强的底
物专一性, 尤其是进行脱氢反应时, 一般只能催化
N6位置含有不饱和异戊烯类侧链的CKs的降解, 不
能识别带有饱和侧链[如二氢玉米素(dihydrozeatin,
diHZ)、iP]和芳环侧链[如激动素(kinetin, KT)、6-
BA]的 CKs。因此, iP、Z及其核苷[异戊烯基腺苷
(isopentenyladenine riboside, iPR)、玉米素核苷
(zeatin riboside, ZR)]是它的底物。在 pH 7.0条件
下, 玉米ZmCKX1与 iP、反式玉米素(trans-Z)和顺
式玉米素(c i s -Z)的 K m 值分别为 1 . 5、14 和 46
µmol·L-1, 而相应核苷的 Km值较高, 如 iPR为 11
µmol·L-1, 反式玉米素核苷(trans-ZR)为 54 µmol·L-1
(Bilyeu等 2001)。Km值还与 pH值有关, 如拟南芥
中AtCKX2与 iPR的Km值在 pH 6.5时为40 µmol·L-1;
在 pH 9.0时则为 15 µmol·L-1 (Frebort等 2002)。
CKX与不同底物发生氧化和还原两种反应过
程中的亲和力也可能有差异。如ZmCKX1与 iP发
生氧化和还原两种反应时的 Km值几乎相等, 但
ZmCKX1与Z、iPR和ZR发生还原反应的Km值比
氧化反应高很多(Kopecny等 2005)。
2 CKX的分子结构
单个AtCKX活性与CKX酶总活性有很大区别,
这种差异可能与CKX的三维结构有关, 包括其活性
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位点结构和糖基化程度。
2.1 CKX的三维结构 玉米 ZmCKX1蛋白三维结
构包含一个 FAD结合域和一个底物结合域, 其中
FAD通过黄素环上的 8-甲基与His105结合。X射
线显示催化反应中心由位于蛋白表面的漏斗状区域
和黄素环椭圆空洞构成 , 两者通过 A s p 1 6 9、
Trp397和Leu458组成入口的窄孔连接。发生反应
时, 异戊烯基腺嘌呤亚胺化合物的异戊烯基侧链与
空洞结合, 而腺嘌呤环则结合在漏斗状区域。一旦
结合后此结合体就封住窄孔, 异戊烯基分子紧密结
合于紧邻黄素反应位点的 C11原子而进行氧化作
用。除N1外, CKs的其他N原子都参与氢键结合,
Asp169的H原子在与N10原子和Glu288侧链结合
中起作用(图 1)。Malito等(2004)的研究表明, CKs
图 1 CKX活性位点的结构
a: 玉米 CKX单体结构(Malito等 2004)。FAD结合域(残基 40~244和 492~534); 红色部分为底物结合域(残基 245~491); 黄色
和黑色部分分别表示 FAD和氧化的 iPA; N和 C分别表示N端和 C残基。b: CKX底物结合域的分子结构(Galuszka等 2007)。ZmCKX1
中氧化态 iPA结合区周围的氨基酸残基是高度保守的, 但在拟南芥基因家族中个别氨基酸残基有差异。灰色方框表示的是 ZmCKX1
完全保守氨基酸残基。
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的胺基与Asp-Glu之间的极性氢键利于氧化反应进
行, 在三维结构图中未发现CKX活性部位的O2运
输通道以及电子受体(如 FAD分子附近的苯醌)的
结合部位。这表明黄素通过蛋白将电子传到蛋白
表面的电子受体上。
2.2 CKX蛋白的分子结构特征及基因保守区 不同
植物中的 CKX酶有一定的差异, 其分子量范围在
25.1~94.4 kDa之间(Jones等 1992)。CKX分子量
的差异可能由转译后的糖基化修饰引起, 糖基化利
于 CKX酶转运、定位和蛋白稳定。如玉米 CKX
酶约有8个糖基化位点, 每个糖基化位点平均有10
个己糖分子(Schmulling等2003)。并非所有的CKX
都被糖基化, 如烟草和菜豆属植物中糖基化与未糖
基化CKX的最适pH存在差异, 这表明糖基化差异
可能与 CKX酶定位有关(Kaminek和 Armstrong
1990; Motyka等 2003)。玉米 ZmCKX1酶有 4个
糖基化位点和 5个糖残基。其中 3个糖残基分别
与Asn63、Asn89和Asn294结合, 另 2个残基侧链
与Asn134相连(Malito等 2004)。Kopecny等(2005)
报道去糖基化的 CKX可保持原酶的大部分活性。
虽然不同来源的 CKX结构有差异, 但它们
约有 1/3的氨基酸序列高度保守。原核生物保守
区大多位于束缚态 FAD区域, 在Motif 的N端和
C端存在高度保守的短序列, 其序列 390附近包含
GlWeVPHPWLNL模式和 C端的 PGQxIF信号
(Schmulling等 2003) (图 1-b)。保守区序列变化幅
度很大, 表明保守的氨基酸在功能上起作用, 其中
有些序列可能是CKX所特有的, 它们可能在底物识
别和电子链传递中起作用。高等植物的CKX基因
保守区中常含有 2~4个内含子, 如玉米和兰花有 4
个基因含 2或 3个内含子, 而杜鹃花、低等生物念
珠藻属 CKX基因中则没有内含子(Schmulling等
2003)。
3 CKX基因家族
迄今为止, 已经鉴定出多个 CKX编码基因的
完全序列和表达序列标签。玉米ZmCKX基因家族
至少有 5个成员(ZmCKX1~ZmCKX5), 它们均在
玉米粒的早期发育过程中起作用, 其中 ZmCKX1
是重要的一员, 也是首个得到克隆的 CKX 基因
(Massonneau等2004)。目前已知拟南芥有7个CKX
基因(AtCKX1~AtCKX7)。其中 AtCKX2和 AtCKX4
紧密相连, 它们可能与复制相关。AtCKX7基因序
列与拟南芥其他CKX蛋白的相似性很小(Schmulling
等 2003)。拟南芥AtCKX蛋白间氨基酸序列同源
性在34.3%~65.9%之间, 而AtCKX与ZmCKX蛋白
氨基酸序列同源性在 34.5%~44.9%之间。水稻
O s C K X 基因组至少有 1 1 个成员( O s C K X 1 ~
OsCKX11)(Werner等 2006)。其中 OsCKX4和
OsCKX5与拟南芥CKX蛋白的联系比与水稻其他
蛋白的联系更密切, 这说明同一物种中CKX基因的
分离先于不同物种的分离。此外, 在大麦、兰
花、棉花、豌豆和小麦等植物中也克隆出CKX基
因(Bilyeu等2001; Schmulling等2003; Yang等2003;
Galuszka等 2004; Massonneau等 2004; Feng等
2008)。低等生物念珠藻(Nostoc sp. PCC 7120)也
存在 CKX基因(NsCKX1) , 其与植物 CKX仅有
16%~22%的同源性, 在 CKs分解代谢中的功能还
不明确(Kaneko等 2001)。
把拟南芥 7个 CKX基因(AtCKX1~AtCKX7)分
别转入烟草植物后, 以异戊烯类CKs为底物时只有
AtCKX2和与其关系最密切的 AtCKX4基因的酶活
性很高, 其活性与 ZmCKX1相当。其他 AtCKX
(AtCKX1、AtCKX3、AtCKX5、AtCKX6和
At CKX7 )也具有 C KX 活性, 但其催化速率比
AtCKX2和AtCKX4低很多。所有 7个AtCKX酶
均以脱氢而不是氧化的方式发生作用。这些差异
可能是由于CKX的结构多样性而导致电子传递受
体这一过程产生差异所致(Galuszka等 2007)。转
AtCKX启动子-GUS融合基因表达分析表明基因家
族各个成员在根与茎部的表达有差异, 其功能重叠
很少, 表明不同生长阶段的不同CKX酶的功能不同
(Werner等 2003)。目前植物中的主要CKX分支关
系已基本明确(图 2)。
4 CKX基因的功能及其表达调控
4.1 CKX基因的生理作用 CKX在调控植物生长发
育进程中作用的报道较少, 目前在一些方面已取得
了一定的进展。
谷类种子发育过程中CKX活性及作用研究得
较为清楚。在发育的小麦种子中最高 CKs含量与
高CKX活性相关, 然后在苗期CKs含量和CKX活
性不断下降(Galuszka等 2001)。玉米生长发育过
程中CKX活性授粉后最初 10~12 d增加 9倍, 同时
其 CKs含量也相应增加。授粉 20~25 d后, CKX
活性与 CKs含量达到一个稳定的低水平状态。而
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每个细胞产生 CKs为本细胞独用。而且, CKX降
解细胞外 CKs, 使其 CKs感受系统恢复到原始水
平。在细胞周期进程中, CKX活性随着有丝分裂
G1/S和S/G2转变期出现的最高内源CKs浓度的变
化而有规律地变化。CKs含量和CKX活性同时增
加, 表明CKs通过其自身快速降解而调控细胞周期
(Hartig和 Beck 2005)。
CKX还参与植物衰老过程。相对于幼嫩叶片
而言, 烟草老叶片中CKX活性较低, CKs的降解能
力也较低, 这表明CKs降解力增强并不直接参与叶
片有序衰老的调控过程( Werner 等 2 0 03 )。但
AtCKX5在拟南芥衰老叶片中过量表达后会导致
CKs含量降低(Werner等 2006)。大麦叶片CKX活
性可被外施KT大大提高, 并且衰老期间无论是否
存在KT, CKX糖基化/未糖基化比例都提高(Conrad
等 2007)。
CKX可能在线粒体和叶绿体中发挥作用, 尽管
其中具体作用机制尚不清楚。线粒体中 CKs的功
能了解甚少, 线粒体呼吸链的部分能量产生系统由
CKs控制。但对 CKs启动叶绿体相关的反应了解
较清楚, 包括脱黄化现象及叶绿体蛋白编码基因的
调控。叶绿体蛋白质提取物含有相对较高的CKX
活性(Benkova等 1999)。目前仍不清楚的是 CKX
是否存在于叶绿体上。
转 CKX基因可用来验证细胞内外CKs在调
节植物发育中的不同功能。在转CKX基因苔藓植
物中, 细胞外 iP和 iPR浓度显著降低, 但其细胞内
CKs含量变化不大, 而 CKX活性大幅增加。对
野生型植株和转 CKX基因植株的分析表明, 细
胞外 iP和 iPR是诱导苔藓植物芽形成的主要 CKs
(Schwartzenberg等 2007)。CKX基因过量表达植
株的一些性状变化明显, 如芽形成减少或缓慢、丧
失有性繁殖功能和产生不正常的丝状体细胞。
转 AtCKX基因植物表现出 CKX活性增强和
CKs浓度降低, 随之引起植物茎生长受抑制。转
AtCKX1或AtCKX3烟草植株的CKX活性比野生型
增加 3 倍, 茎生长受到强烈抑制。A t C K X 2 和
AtCKX4基因过量表达后, CKX活性增加约 10倍,
但对茎生长的抑制不明显(Werner等 2003)。这种
茎生长抑制程度差异的原因可能与CKX亚细胞定
位或其底物特异性有关。相对于茎生长受抑制而
言, 转AtCKX基因植物的根生长会大大促进。CKs
图 2 CKX基因的系统分支(Feng等 2008)
聚类图上的数字表示各个基因序列的相似度。
且, 玉米穗顶部籽粒的缺失和胁迫导致的结穗减少
现象可以用 CKs处理得到改善。发育中的玉米粒
胚胎内CKX可通过抑制CKs水平而抑制种子提早
萌芽; 玉米中CKX的另一个作用是保护粒穗不受真
菌病原体入侵, 它通过降解真菌中CKs的产生来实
现(Bilyeu等2001)。但发育中的玉米粒不同组织的
CKs含量和 CKX活性有显著差别。CKs水平和
CKX活性在发育的玉米花梗 /胎座中都很高, 但二
者在胚乳中却较低; 而果皮与胚中的CKX活性比胚
乳中的高, 它们的 CKs水平较低。因此, 细胞外
CKX的作用之一可能是调节外源CKs向植物组织
输入, 如库组织中 CKs输入可能经过质外体, 此部
位的 CKX可能调节 CKs水平(Jones等 1992)。
细胞外CKX的另一个作用可能是降解细胞周
期产生的 CKs。在细胞周期中 CKs含量短时间内
迅速增加, 目前还不清楚其含量水平是如何迅速增
加的。细胞周期相关的 CKs向细胞外运输必须在
其降解之前进行, CKX蛋白可能参与此过程。分
裂细胞可能通过向外运输 CKs向其相邻细胞传达
细胞正在分裂这一信号。也许在细胞分裂区, 细胞
外CKX作为相邻细胞产生的CKs的保护者以保证
每个细胞能够独立产生 CKs。这表明细胞分裂期
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在根分枝和不定根形成等生长发育中起负调控作
用。CKs缺乏会促进植物根生长和分枝, 根中CKs
的一个作用是调节分生组织细胞转变为其他细胞;
另一个作用是抑制根原基的形成。CKs含量长期
增加会抑制拟南芥初生根的伸长, 因为它会破坏生
长素在侧根原基中的分配规律, 干扰生长素极性运
输, 减缓根原基的发育(Kuderova等 2008)。CKs受
体突变体会促进拟南芥根的生长, 表明胁迫条件下
CKs增加对根形成不利(Riefler等 2006)。目前, 关
于 CKX基因与植物根生长关系的研究越来越多,
CKX在调控初生根诱导及发育中所起的作用越来
越受重视。转 AtCKX基因烟草的根鲜重增加约
60%, 主要由于根分生组织分化细胞数量增加, 从
而导致初生根数量增加(Werner等 2001)。侧根原
基中 AtCKX的激活会促进侧根的形成(Laplaze等
2007)。
此外, CKX通过调节CKs含量水平成为影响豌
豆根瘤形成的关键因素。豌豆根瘤突变体 R50的
根瘤形成较少, 这与其营养器官中CKs含量提高有
关。分析表明, 其成熟茎和根瘤中的 PsCKX活性
比野生型的显著下降, CKs含量增加, 因而根瘤形
成异常(Held等 2008)。但进一步研究表明, 根瘤形
成突变体R50中PsCKX1和PsCKX2基因表达被上
调, 这可能用来补偿其体内 CKX的缺乏。
研究表明, CKX通过对植物形态建成的调节而
影响植物生产力。如水稻OsCKX2基因表达降低
会引起花序组织中CKs积累, 从而促进籽粒数增加,
导致产量提高(Ashikari等 2005)。
4.2 CKX基因表达调节
4.2.1 CKX基因表达的组织特异性 每个CKX基因
都有其特有功能, 如拟南芥不同的CKX蛋白在亚细
胞水平上定位不同, AtCKX1~AtCKX6蛋白合成后
通常进入内质网。在亚细胞水平上, AtCKX1和
AtCKX3蛋白定位于液泡膜, AtCKX2蛋白仍存在于
内质网, 也可能会进入质外体。CKX基因表达还
呈现组织特异性, 拟南芥茎尖大量表达的 AtCKX1
和AtCKX2均可抑制幼嫩组织细胞的生长; AtCKX4
在托叶、气孔及根冠中强烈表达; AtCKX5在根分
生组织中表达; AtCKX6在雌蕊的发育过程中表达
(Werner等 2003, 2006)。AtCKX7有可能存在于细
胞中, 其蛋白的 N端终止序列没有信号肽。玉米
ZmCKX1基因在籽粒中表达最高, 授粉后11 d内达
到高峰, 而ZmCKX2~ZmCKX5主要在营养体组织中
表达(Massonneau等 2004)。大麦HvCKX1存在于
所有的器官组织中, 而HvCKX2在 7 d苗龄的幼叶
中表达(Galuszka等 2004)。
4.2.2 植物激素对CKX基因表达的调节 在外界信
号刺激下, 激素之间的互作和平衡可通过激素代谢
基因的转录调控实现。AtCKX启动子 -GUS标记
表明, CKs会使CKX基因表达区域扩大, 如CKs处
理可使 AtCKX5-GUS表达部位从叶柄延伸到叶片,
AtCKX6-GUS活性从根分生组织的维管束扩展到中
柱(D’Agostino等 2000)。CKX对 CKs平衡的调控
是负反馈机制, 它也负向调控CKs合成, 如外施10-4
mol·L-1 KT会大幅度提高大麦叶片CKX活性(Conrad
等 2007)。
CKs还可与其他激素互作共同调节植物生长
发育。增加内源或外源生长素时, 植物体内CKs水
平下降, 这可能与生长素抑制CKs合成或者CKX活
性提高后促进其降解有关, 如在离体条件下萘乙酸
(naphthylacetic acid, NAA)可增强CKX活性。生长
素对不同 A t C K X 基因表达的影响不同, 其对
AtCKX2、AtCKX4和 AtCKX7转录产物有微弱下
调( G oda 等 2 0 04 )。与此不同的是, 吲哚乙酸
(indoleacetic acid, IAA)可提高AtCKX1和AtCKX6基
因的表达水平 2.9和 7.9倍(Werner等 2006)。
赤霉素(gibberellic acid, GA3)对 AtCKX基
因转录的影响不大, 但 GA合成抑制剂如多效唑
(paclobutrazol, PP333)会降低 AtCKX3、AtCKX4和
AtCKX6的转录水平(Werner等 2006)。脱落酸
(abscisic acid, ABA)对AtCKX1、AtCKX3、AtCKX4
和 AtCKX6基因表达有下调作用。AtCKX基因的
表达还会受茉莉酸(jasmonic acid, JA)和表油菜素
内酯(epi-brassinolide, epi-BR)的影响。这些结果表
明 AtCKX基因的表达调控与植物激素间的互作有
关系。
5 结语
CKs几乎参与调控了植物所有的生长发育过
程, 特别是细胞分裂与分化过程, 如参与配子细胞
与胚胎发育、促进芽的分化、参与根的形态建
成、延缓叶片衰老、调控顶端优势、促进维管
束形成、促进叶绿体成熟等(黄升谋等 2 0 0 7 ;
Armstrong 1994)。CKX是目前所知的惟一的降解
CKs的关键酶, 它通过调节植物体内CKs水平而参
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与调控植物的生长发育过程。
CKX基因是研究 CKs功能的一种有力工具。
如通过筛选和分析CKX基因突变体可以帮助了解
各个 CKX基因的作用; 用 CKX转基因植物利于阐
明CKs和CKX基因的关系及其生理作用; 分析CKX
基因在组织和不同发育阶段的表达查明具体组织器
官中 CKs的功能等。
鉴定并利用重要的农艺基因是作物育种的一
个有效途径。在植物基因组中发现隐藏着的有用
基因来改善农艺性状是植物育种的新方法。近年
来对CKX的研究不仅加深了其在调节植物发育机
制方面的了解, 而且发现通过调节CKX基因表达可
提高水稻产量。由于该策略是一种环境友好、不
需要外界高投入、效率高的改良作物性状的手段,
因此, Ashikari等(2005)预测 CKX基因将对 “新的
绿色革命 ”做出重大贡献。此外, 研究水稻、玉米、
小麦等禾本科作物中CKX基因功能及其作用机制
对于抗逆性等重要农艺性状改良也有意义。
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