全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 4期，2007年 8月 761
用氨基酸分析仪测定棉花幼苗叶片中的还原型谷胱甘肽含量
曹让 1,2，张林生 1，张旺锋 2，梁宗锁 1,*
1西北农林科技大学生命科学学院，陕西杨凌 712100；2石河子大学新疆兵团绿洲生态农业重点实验室，新疆石河子
832003
Determination of Reduced Glutathione in Cotton (Gossypium hirsutum L.) Seed-
ling Leaves by Amino Acid Autoanalyzer
CAO Rang1,2, ZHANG Lin-Sheng1, ZHANG Wang-Feng2, LIANG Zong-Suo1,*
1College of Life Sciences, Northwest A & F University, Yangling, Shaanxi 712100, China; 2Key Laboratory of Oasis Ecology
Agriculture of Xinjiang Bingtuan, Shihezi University, Shihezi, Xinjiang 832003, China
提要：以 3%三氯乙酸提取棉花幼苗叶片中还原型谷胱甘肽(GSH)，在 2.8 mm×80 mm色谱柱、柱温 54 ℃、缓冲液流速
10 mL·h-1、茚三酮溶液流速5 mL·h-1、波长570 nm的条件下，用Beckman 121 MB型氨基酸自动分析仪测定含量为40~500
µmol·L-1的GSH，与色谱峰面积呈良好的线性关系，GSH回收率为99.5%~100.4%，检出限为4 µmol·L-1，测定结果的相对
标准偏差为0.51%~1.05%。
关键词：还原型谷胱甘肽；棉花；氨基酸自动分析仪
收稿 2007-06-08 修定 2007-07-05
资助 教育部西部高等农林院校博士生访学基金(01082005)、
国家自然科学基金(9 0302 005 )、教育部新世纪优秀人
才支持计划(2 0 0 5 2 7 )。
* 通讯作者(E-mail：l iangzs@ms.iswc.cn)。
在植物细胞中，还原型谷胱甘肽( r educed
glutathione，GSH)是一种重要的抗氧化物质，对
维持活性氧的平衡有作用。在水分胁迫下，GSH含
量下降，而氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione，
GSSG)含量增加，二者呈负相关；由于GSSG水
平与膜脂过氧化及溶质泄漏水平呈正相关，因此
可用作为表示氧化胁迫的指标(孙群和胡景江
2005；Aina等 2007) ；此外，GSH也与植物忍耐重
金属毒害有关系(Kuzniak和 Sklodowska 2001) ；
外源GSH还有促进小麦细胞分化的作用(廖祥儒等
2002)，并可调节植物木质化过程中的酶活性和组
织的木质化进程(刘尊英和姜微波 2005)。
常用的测定生物样品中GSH方法有分光光度
法、荧光光度法、高效毛细管电泳法和高效液相
色谱法。分光光度法简单易行，所用仪器较简单
而常为人们采用，但在检测中如果某些组织样品
量太少，其应用即受到限制(任春兰等 2003) ；高
效毛细管电泳法和高效液相色谱法的检测范围在紫
外区，受溶剂的影响较大(刘约权 1998)。本文根
据阳离子交换树脂分离GSH效果好、定量准确、
速度快的特点，可以避免上述缺点。按照被分离
GSH中氨基在弱酸性溶液中与茚三酮反应生成的
蓝紫色化合物在波长 570 nm处有最大吸收峰的原
理(宋治军和纪重光 1994)，可以用于GSH的定性
定量分析。本文以棉花幼苗为试材，用氨基酸分
析仪测定了 GSH，效果较好。
材料与方法
1 材料
棉花(Gossypium hirsutum L.)品种为‘新陆早
24’(cv. ‘Xinluzao 24’)，幼苗完全展开的 2片真
叶用于测定 GSH。
2 试剂
GSH购自 Sigma公司，配制成 1 mmol·L-1。
氨基酸自动分析仪的流动相用柠檬酸钠(AR)、氯
化钠(AR)、盐酸(GR)、苯酚(AR)和重蒸水配制成
pH 3.20的缓冲液(其中柠檬酸三钠为 0.07 mol·L-1，
氯化钠为 0.20 mol·L-1，盐酸为 0.14 mol·L-1，苯
酚为 0.1%) 。显色剂为酸性茚三酮溶液(其中醋酸
锂为 1.00 mol·L-1，醋酸为 0.22 mol·L-1，二甲基
亚砜为 10.56 mol·L-1，水合茚三酮为 0.11 mol·L-1)。
再生液为 0.2 mol·L-1 NaOH。
3 仪器
仪器为美国贝克曼公司制造的 Beckman 121
植物生理学通讯 第 43卷 第 4期，2007年 8月762
MB型氨基酸自动分析仪。色谱条件：色谱柱为
2.8 mm×80 mm，树脂为 Beckman 121 MB型氨基
酸自动分析仪AA10型专用树脂，柱温为 54 ℃，
缓冲液流速为 10 mL·h-1，茚三酮溶液流速为 5
mL·h-1，检测波长为 570 nm，进样量为 50 µL。
4 样品的提取
从培养的棉花苗床中取棉花幼苗的顶部 2片
展开叶 40 g左右，带上乳胶手套用剪刀剪成约
0.5 cm×0.5 cm的小方片，每个重复精确量取
2.0000 g剪碎的叶片于预冷的研钵中，加入含有
3%三氯乙酸的柠檬酸缓冲液(pH 2.20，其中柠檬
酸三钠为 0.07 mol·L-1，盐酸为 0.20 mol·L-1，苯
酚为 0.1%)，在冰浴中研磨提取(孙群和胡景江
2005)，用中速定量滤纸过滤并定容至 25 mL。取
此滤液 12.5 mL置于 25 mL容量瓶中，用 10%柠
檬酸钠溶液(约 3 mL)调 pH至 2.20，并定容。取
5 mL于 4 ℃条件下以 12 000×g离心 15 min，上清
液用于氨基酸自动分析仪的测定(宋治军和纪重光
1994)。
结果与讨论
1 GSH的定性分析
用 Beckman 121 MB型氨基酸自动分析仪分
析除天门冬酰氨和谷酰氨以外的 18种氨基酸，以
不连续的 pH值梯度缓冲液为流动相，以pH 3.28、
3.90和 5.26的柠檬酸缓冲液分别洗脱出酸性氨基
酸(天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯
氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸)、中性
氨基酸(蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、
苯丙氨酸)和碱性氨基酸(色氨酸、赖氨酸、组氨
酸、精氨酸)，与茚三酮溶液混合显色后，用比
色法进行定性和定量分析。在此条件下分析混合
有GSH的 18种氨基酸，由于GSH和天门冬氨酸
合为一个峰，所以分离GSH和天门冬氨酸应改变
流动相的pH值，或者改变流动相的流速并提高色
谱柱温度。两者之中以改变流动相的pH值较为简
便，且对仪器伤害最小。故本文在反复实验的基
础上，以 pH 3.20的柠檬酸缓冲液为流动相洗脱
含有GSH的样品。由于洗脱液的 pH值下降，以
致苏氨酸和丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸分离度减
小，胱氨酸和缬氨酸合为一个色谱峰，但对中性
氨基酸和碱性氨基酸的分离无影响。所以本文所
设计的分析程序只分析了GSH、天门冬氨酸、苏
氨酸、丝氨酸、谷氨酸和脯氨酸，而其他氨基
酸均为再生液洗脱除去；另一种分析程序为只分
析GSH，其分析时间还可进一步缩短。分析时注
入 50 µL 100 µmol·L-1 GSH标准溶液，结果(图 1-
a)表明能很好分离GSH，其保留时间为 18.4 min，
峰型完整，与其他氨基酸的峰型相同。
一种方法则是将GSH加入到含有18种标准氨
基酸的混合溶液中，在同样分离条件下分析的结
果(图 1-b)表明，GSH与其他氨基酸可以完全分
离。与此同时，另将 GSH 加入到棉花叶片提取
溶液中，结果(图 1-c)是 GSH 的出峰时间仍为
18.4 min。这些说明氨基酸自动分析仪能很好地分
离棉花幼苗叶片中的 GSH。
2 GSH的保留时间和峰面积的重复性
用GSH的标准溶液和棉花幼苗提取液分别以
50 µL进样分析 5次，测定保留时间、峰面积值
的重复性，并计算其相对标准偏差的结果(表 1)表
明，GSH的保留时间、峰面积值的相对标准偏差
分别为 0.46%、0.38%和 1.05%、0.51%，明显
小于仪器规定的1%和3%指标要求，说明GSH的
出峰位置和峰面积都有很好的重复性。
3 GSH的回收率
将标准 GSH液(1 mmol·L-1)精确稀释至 160
µmol·L-1，置于 250 mL容量瓶中，摇匀；再精
确吸取棉花幼苗叶片提取液(其GSH含量见表 2)
12.5 mL共 5份，置于 25 mL容量瓶中，加入 160
µmol·L-1 GSH标准液 12.5 mL组成混合样，于上
述色谱条件下测定GSH含量，根据理论值和测定
值计算回收率(%)。用本法测得的GSH回收率为
99.5%~100.4% (表 2)，表明回收效果非常好。
4 标准曲线和最小检测值
将GSH标准溶液(浓度为1 mmol·L-1)稀释成系
列溶液，即 40、80、160、240、320、400和
500 µmol·L-1溶液后分置于 10 mL容量瓶中，取
各溶液分别进样 3次，每次 50 µL，以GSH的浓
度(µmol·L-1)为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，进
行回归分析，得到线性方程：y=4.7957x+65.326，
R2=0.9983。从工作曲线的形状和线性相关系数的
数值可以看出，GSH浓度在 40~500 µmol·L-1内符
植物生理学通讯 第 43卷 第 4期，2007年 8月 763
合线性方程(图 2)。
将GSH标准液逐级稀释成浓度为：20、10、
表 1 标准和样品的GSH保留时间与峰面积的变化
样品重复号 标准保留时间 /min 样品保留时间 /min 样品峰面积 /mV·s 标准峰面积 /mV·s
1 18.3 18.4 736.771 1 195.342
2 18.4 18.5 741.873 1 187.151
3 18.4 18.4 714.318 1 199.777
4 18.5 18.4 750.507 1 185.327
5 18.3 18.3 756.187 1 188.091
RSD % 0.46 0.38 1.05 0.51
色谱峰面积单位为色谱峰高对电压的响应值(mV)与峰积分时间(s)的乘积(mV·s)。
4、2和 1 µmol·L-1的溶液，用上述色谱条件进行
测定，按峰高为噪音2倍计算GSH的检出限，GSH
图 1 氨基酸分析仪分离GSH的图谱
a：单个标准 G SH。1：G SH 保留时间为 1 8 .4 0 mi n。b：标准 G S H 加入其他氨基酸。1：G SH 保留时间为 1 8 .4 0 mi n；
2：天门冬氨酸保留时间为 2 0 . 3 1 m in；3：苏氨酸保留时间为 2 2 . 2 3 m in；4：丝氨酸保留时间为 2 3 . 4 2 m in；5：谷氨酸保
留时间为 28.37 min；6：脯氨酸保留时间为 30.12 min。c：加有标准 GSH 的棉花叶片提取液。1：GSH 保留时间为 18.40 min；
2：天门冬氨酸保留时间为 2 0 .3 2 mi n；3、4：苏氨酸和丝氨酸浓度太高而合为一个峰，保留时间为 2 3 .3 1 mi n；5：谷氨酸
保留时间为 28 .36 min；6：脯氨酸保留时间为 3 0 .1 3 min。d：棉花叶片提取液中的 G SH。1：G SH 保留时间为 1 8 .4 0 min；
2：天门冬氨酸保留时间为 2 0 .3 2 mi n；3、4：苏氨酸和丝氨酸浓度太高而合为一个峰，保留时间为 2 3 .3 2 mi n；5：谷氨酸
保留时间为 2 8 .3 7 min；6：脯氨酸保留时间为 3 0 .1 3 min。
植物生理学通讯 第 43卷 第 4期，2007年 8月764
表 2 GSH的回收率
样品号 样品浓度 / 混合样的GSH浓 实测的混合样中GSH 加入GSH的浓度 / 回收率 /%
µmol·L-1 度理论值 /µmol·L-1 浓度 /µmol·L-1 µmol·L-1
1 85.8 165.8 164.9 8 0 99.5
2 84.9 164.9 165.2 8 0 100.2
3 84.7 164.7 165.4 8 0 100.4
4 85.2 165.2 165.7 8 0 100.3
5 84.8 164.8 164.3 8 0 99.7
的最小检出值为 4 µmol·L-1。
参考文献
廖祥儒, 刘小丽, 陈彤, 袁京云, 李业英, 王俊丽, 杜建芳(2002). 谷
图 2 GSH的标准曲线
色谱峰面积单位为色谱峰高对电压的响应值(mV)与峰积分
时间( s)的乘积(mV· s)。
胱甘肽对小麦幼穗胚性愈伤组织形成以及几种相关酶活性
的影响. 植物生理学通讯, 38 (4): 327~329
刘约权主编(1998). 现代分析仪器. 北京: 中国农业出版社, 303
刘尊英, 姜微波(2005). 谷胱甘肽对采后石刁柏木质化和食用品
质的影响. 植物生理学通讯, 41 (3): 305~308
任春兰, 陆建峰, 白洁(2003). 还原型谷胱甘肽微量测定法的研
究. 卫生毒理学杂志, 17 (4): 245~246
宋治军, 纪重光主编(1994). 现代分析仪器与测试方法. 西安: 西
北大学出版社, 22
孙群, 胡景江主编(2005). 植物生理学研究技术. 陕西杨凌: 西北
农林科技大学出版社, 170
Aina R, Labra M, Fumagalli P, Vannini C, Marsoni M, Cucchi U,
Bracale M, Sgorbati S, Cittero S (2007). Thiol-peptide level
and proteomic changes in response to cadmium toxicity in
Oryza sativa L. roots. Environ Exp Bot, 59: 381~392
Kuzniak E, Sklodowska M (2001). Ascorbate, glutathione and
related enzymes in chloroplasts of tomato leaves infected
by Botrytis cinerea. Plant Sci, 160: 723~731