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VIGS 技术在植物基因功能研究中的应用



全 文 :植物生理学通讯 第 43卷 第 2期,2007年 4月 379
收稿 2006-12-20 修定  2007-03-09
资助 国家自然科学基金(30600422、30371006)和重庆市自
然科学基金(2 006 BB1 139 )。
* 通讯作者(E-mail:zhengguoli@cqu.edu.cn;Tel:023-
6 5 1 2 0 4 8 3 )。
VIGS技术在植物基因功能研究中的应用
杨迎伍,李正国 *,宋红丽,杨平
重庆大学生物工程学院基因工程研究中心,重庆市高校功能基因及调控技术重点实验室,重庆 400044
Application of VIGS in Plant Gene Function Study
YANG Ying-Wu, LI Zheng-Guo*, SONG Hong-Li, YANG Ping
Genetic Engineering Research Center, College of Bio-Engineering, Chongqing University, Key Laboratory of Functional Gene and
Regulation Technologies under Chongqing Municipal Education Commission, Chongqing 400044, China
提要:文章就病毒载体选择、目标基因插入片段设计、病毒嫁接技术、环境条件控制、沉默植株检测等方面对应用病毒
诱导的基因沉默(VIGS)技术研究植物基因功能应遵循的基本原则进行介绍,并讨论了其在应用中存在的一些问题。
关键词:病毒诱导的基因沉默(VIGS); 植物基因功能;应用;基本原则
病毒诱导的基因沉默(virus- induced gene
silencing,VIGS)是近年来发现的一种转录后基因
沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS)现
象,可引起内源mRNA序列特异性降解(Ratcliff等
1997;王宏芝等 2005)。即如果在病毒载体中插
入目标基因片段,侵染寄主植物后,植物会表现
出目标基因功能丧失或表达水平下降的表型,从
而可以确定基因功能。其作用机制为:含有目的
基因片段的病毒载体在被侵染的植物组织中大量复
制,病毒载体中的目的基因片段在 RNA引导的
RNA聚合酶(RNA-directed RNA polymerase,RdRP)
作用下合成大量的双链RNA (double-stranded RNA,
dsRNA); dsRNA在Dicer酶作用下产生21~25个核
苷酸的短干扰RNA (short interfering RNA,siRNA);
然后,siRNA的反义链与RNA诱导基因沉默复合
物(RNA-induced silencing complex,RISC)结合,
特异性识别细胞质中的目的基因的单链mRNA,
造成目的基因mRNA特异性降解,从而导致目的
基因在 RNA水平上的沉默(Bartel 2004;Burch-
Smith等 2004;Klahre等 2002;Martinez等 2002;
Waterhouse等 1998)。
与其它导致基因功能缺失的研究方法(如反义
抑制、基因突变等)相比,病毒诱导的基因沉默
具有研究周期短、不需要遗传转化、可在不同的
遗传背景下生效以及能在不同的物种间进行基因功
能的快速比较等优点,此种技术正在发展成为一
种简单、快速、有效、高通量的分析基因功能的
方法(Burch-Smith等 2004;王宏芝等 2005)。
但如何有效地在植物中应用VIGS技术,获
得可靠的数据,是人们在实际应用中最为关心的
问题。本文结合我们实验室的工作,介绍 VIGS
应用过程中应该遵循的一些基本原则。
1 选择合适的病毒载体
经过几年的发展,已有多种病毒载体在VIGS
上成功应用,如烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,
TMV)、马铃薯X病毒(potato virus X,PVX)、番茄
金色花叶病毒(tomato golden mosaic virus,TGMV)、
烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)、卫星
病毒诱导的沉默系统(satellite virus-induced silencing
system,SVISS)、大麦条状花叶病毒(barley stripe
mosaic virus,BSMV)、甘蓝缩叶病毒(cabbage
leaf curl virus,CbLCV)等(Burch-Smith等 2004;
王宏芝等2005)。但每种病毒载体都存在一定的宿
主范围,诱导沉默效果也不同。例如 PVX 病毒
虽然具有较好的稳定性,但只有 3个植物宿主家
族,而TMV则有9个植物宿主家族(Brunt等1996;
Burch-Smith等 2004)。而且,有些病毒载体感染
植物后会引起较强烈的疾病表型,干扰目标基因
沉默的表型,以致目标基因的功能分析很困难,
如 TMV和 PVX等病毒载体(Ratcliff等 2001)。另
外,许多病毒不能侵染宿主植物的生长点或分生
组织,以致这些组织的目标基因无法有效沉默
(Ratcliff等 2001)。但采用TRV病毒载体能有效的
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使目标基因在生长点或分生组织中沉默,产生系
统的沉默效果(Liu等 2002b)。
因此,在应用 VIGS研究植物基因功能时,
所选择的病毒载体应对实验植物有很好的侵染性、
在寄主植物中不产生疾病表型或只有轻微的疾病表
型,最好能在寄主植物中产生系统的沉默效果。
2 选择正确的目的基因片段和适当的长度
根据VIGS的作用机制,理论上引起目的基
因沉默的最小插入片段为 2 3 个核苷酸( B a r t e l
2004),但在实际操作中 23个核苷酸长度常常不
能够有效地启动目标基因沉默的发生,所以需要
选择更长的目标基因片段(数倍于 23 nt) (Ekengren
等 2003;Ratcliff等 1997)。但如果插入片段太
长,可能会导致病毒不能在宿主植物体内传播,
也可能导致插入片段易于丢失,如PVX或TRV的
病毒载体允许的最大插入片段为1.5 kb (Thomas等
2001)。为了使目标基因能够有效的沉默,有人
对此研究的结果表明以 300~500 bp插入片段的沉
默效果最佳(Burch-Smith等 2004;Ekengren等
2003;Lu等 2003b)。当然,也可能存在其它影
响沉默效果的因素,如目标基因序列的核苷酸组
成(Thomas等 2001)、siRNA及目标序列的碱基对
的热力学特性等(Khvorova等 2003;Schwarz等
2003)。
由于VIGS可能引起任何与目标序列存在至少
23个核苷酸一致的转录产物的降解,所以在选择
目标基因的插入序列区域时必须非常慎重。通常
事先进行BLAST序列比对或DNA杂交分析以核实
是否可能引起基因家族的其他成员的沉默是非常必
要的(Burch-Smith等 2004)。当然,对于单拷贝
的基因,理论上开放阅读框(open reading frame,
ORF)内的任何区域都可以用于基因沉默。然而,
如果要使基因家族中的单个基因沉默,必须要谨
慎选择插入病毒载体的基因片段区域,保证不能
含有与家族其他成员具有23个或更多核苷酸的一
致序列。如果家族基因之间具有高度保守的开放
阅读框,则可以选择非翻译区(untranslated region,
UTR)作为目标基因的插入片段。相反,要想同
时沉默一个基因家族中的多个基因,则可以选择
高度保守的区域,同时还可克服可能存在的基因
功能冗余(Lu等 2003a)。VIGS在沉默基因家族中
单个基因或几个基因方面的灵活性,可能会成为研
究基因家族中基因之间交迭功能非常有用的工具。
根据目前的研究及VIGS的作用原理,目标
基因片段在病毒载体中的插入方向对基因的沉默效
果没有影响,即正向插入或反向插入都能达到同
样的沉默效果。
3 同时使几个不同基因沉默的方法
对于几个基因之间不存在多于23 nt保守序列
或几个基因根本就不属于一个基因家族,易于想
到的方法是分别构建几个不同基因的病毒载体,
然后共感染植物。但此方法在目前的情况下很难
获得满意的结果,这主要是由于目前病毒诱导的
基因沉默技术并不能保证所有被感染的植物都能产
生系统的沉默效果,即几个病毒载体同时感染植
物后可能产生基因沉默的部位不一致;另外,此
方法也很难确保病毒在植物体内的传播和作用的同
步性。所以,对于不具有保守序列的几个不同基
因来说,有效的方法是把几个基因的片段串联构
建到同一个病毒载体上,这样可保证VIGS作用部
位和时期的同步性。如Peele等(2001)用TGMV病
毒载体使编码镁离子螯合酶亚组分的基因(su)和增
殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,
PCNA) (或称为细胞周期蛋白)的基因共沉默;
Turnage等(2002)用CbLCV病毒载体在拟南芥中共
沉默 Chlorate 42和 PDS基因。
4 病毒载体的嫁接技术
如何有效地使病毒载体转入植物细胞,是病
毒在植物体内复制与转移,以及发生目标基因沉
默的关键。目前通常把含目标基因的病毒载体转
入农杆菌中,然后通过农杆菌介导法感染宿主植
物。迄今已发展了几种病毒嫁接方式,如牙签接
种(Lu等 2003a)、注射渗透(Fu等 2005)、高压喷
射(Liu等 2002a)及真空渗透(Ekengren等 2003)等。
但对于不同的植物和不同的病毒载体来说,每种
嫁接技术的效果也不同,所以在实际工作中应根
据植物和病毒载体的种类选择合适的方法(Ekengren
等 2003;Liu等 2002a)。例如,用 PVX病毒侵
染烟草只需用牙签挑取含 PVX载体的农杆菌,刺
伤叶片即可引发足够强的感染(Lu等 2003a),但此
方法在应用 T R V 感染番茄时的效果却不好
(Ekengren等 2003)。对于 TRV在番茄和烟草中的
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应用,实验证明真空渗透和高压喷射幼叶都能获
得很好的感染效果(Ekengren等 2003;Li u等
2002a)。如果要在植物的局部区域获得有效的沉
默,注射渗透技术比较理想(Fu等 2005)。例如,
可以通过注射花柄或果梗的方式获得基因在花或果
实中的沉默。虽然各种方法在方式上存在很大的
差异,但引发 VIGS发生的基本原理是一致的,
即含有目标基因片段的病毒载体被接种到幼嫩的植
物体内,然后随着植物的生长,病毒从接种的部
位传播到生长区域,进而引发PTGS (Dinesh-Kumar
等 2003;Liu等 2002a,2002b;Ekengren等2003)。
迄今,病毒载体的接种技术还没有形成一套
非常成熟有效的方法,已有的报道也只是在少数
物种中获得成功,如烟草、番茄、拟南芥等,
许多接种条件还需要进一步优化,如农杆菌株系
的选择、农杆菌的感染活力、感染缓冲液的选
择、农杆菌感染液浓度的确定以及接种方式的优
化等。所以,在实际应用中,尤其对于尚无VIGS
报道的植物,预备试验是必不可少的。
5 VIGS环境条件的控制
成功的基因沉默依赖于病毒在植物体内的传
播和植物生长之间的相互作用,而这 2个方面都
受到环境条件的影响(Burch-Smith等 2004)。对于
病毒的传播和有效的沉默,温度是最重要的影响
因子之一。而对于不同的植物,有效沉默所需要
的温度也可能不同。例如,用TRV感染番茄,较
好的沉默表型在 22 ℃或更低的温度下发生;而用
TRV感染烟草,合适的温度则在25℃左右(Burch-
Smith等 2004;Ekengren等 2003;Liu等 2002a;
Nethra等 2006)。目前的研究证明,植物培养室
(growth chamber)是进行VIGS实验较为理想的选
择,而控温较差和温度波动大的温室不适宜于做
VIGS实验。另外,Fu等(2006)发现,低温和低
湿的条件可以增强基因沉默的强度和延长沉默的持
续时间。
6 设计合理的实验对照
对于每个VIGS实验,都必须要有合适的对
照来监控沉默的效果。阳性对照通常采用八氢番
茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)基因的
沉默,因为 PDS 沉默能引起沉默区域发生光漂
白,并迅速产生可见的表型(Kumagai 1995)。也
有一些研究选用镁离子螯合酶(magnesium chelatase)
基因作为阳性对照(Kjemtrup等 1998;Peele等
2001)。实验中,为了说明病毒自身是否会引起
表型,还必须用空病毒载体接种植物作为阴性对
照。另一方面,阴性对照也可以显示接种技术对
植物生长的影响。我们在实验中观察到,较强烈
的接种处理对植物自身生长可能会产生一定的影
响,如真空渗透处理番茄幼苗 10 d左右的时间
内,对番茄植株的生长具有较明显的抑制(未发表
资料)。如果阴性对照(空病毒载体接种的植物)出
现非正常的表型,往往还需要添加新的阴性对
照,即以不含病毒载体的水或侵染缓冲液采用相
应的接种技术处理植株。以便明确非正常的表型
是来自于病毒自身的原因,还是由于接种方式引
起的,从而可以进一步选择合适的方法或优化条
件来消除此不利影响。另外,阴性对照对后继的
沉默检测也是必不可少的,所有的检测都应该以
接种空病毒载体的阴性对照材料作为检测的阴性对
照。
7 沉默植株的检测
植物接种含病毒载体的农杆菌后,随着植物
的生长,病毒从接种位点传播到植物的生长区域
并引发目标基因的沉默。从接种到引发基因沉默
所需的时间与多种因素有关,如病毒载体的类
型、植物的种类和植物生长条件等。而随着植物
体内防御系统的启动,VIGS将被减弱或消除,从
而恢复目标基因的表达。所以,病毒诱导的基因
沉默通常只能存在于当代的植物中,甚至只是病
毒感染后的某个阶段。因此,选择沉默植株检测
的时机非常重要。另外,检测材料的选择也非常
重要,通常应选取植株上端的新生叶(Burch-Smith
等 2004;Ekengren等 2003;Liu等 2002a)。
VIGS技术并不能使接受侵染的全部植株都发
生目标基因的沉默,因此首先必须筛选出沉默植
株。对于目标基因的沉默能引起植株产生较为明
显的表型,则可以通过表型分析初步确定沉默植
株,再采用分子生物学的方法进一步验证。但对
于目标基因的沉默后没有明显表型的植株,则只
能通过分子生物学的方法确认。分子生物学的方
法筛选沉默植株有 2种方式:一是直接通过半定
量或定量RT-PCR技术检测目标基因的表达量来确
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定(Liu等2002a); 二是在病毒侵染后的早期阶段(如
番茄约 1周左右)提取新生叶 RNA,并反转录成
cDNA,PCR检测病毒序列来确定病毒是否侵染
成功,从而缩小半定量或定量 RT-PCR鉴定沉默
植株的范围,减少检测的工作量(Fu等 2006)。
值得注意的是,采用半定量或定量 RT-PCR
检测目标基因的表达量时,引物应该设计在目标
基因转录本内,且至少有一条引物必须设计在
VIGS载体中目的基因片断之外,以避免扩增出病
毒中的目标基因序列。另外,还必须选择植物中
组成型表达的基因作为半定量或定量RT-PCR的内
参照,如 u b i 3、a c t i n 等。
沉默植株确定后,即可进行目标基因功能的
相关研究,如沉默植株的表型分析、生理生化指
标测定、通过半定量或定量 PCR检测相关基因的
表达情况等。
8 结语
二十一世纪的分子生物学已经进入后基因组
时代,植物功能基因研究已成为植物分子生物学
研究的热点。但由于植物的生长周期长,传统的
植物基因功能研究方法越来越不能满足植物功能基
因组研究。而病毒诱导的基因沉默技术具有简
单、快速、高通量等优点,可望解决植物基因
功能研究周期长的瓶颈问题。虽然VIGS技术短短
几年中取得较大的发展,但此种技术目前仍然存
在一定的缺陷。
首先,VIGS引起目标基因的沉默特征不具
有遗传性(Burch-Smith等 2004),以致VIGS技术
并不能彻底揭示基因的功能,这是此种技术自身
最大的局限性。但VIGS技术可以对植物 EST序
列进行快速的高通量筛选,初步确定功能基因,
再通过传统的植物基因功能研究手段对基因功能进
行进一步的研究,从而节约大量的时间、人力和
物力。另外,由于 VIGS采用幼苗或植株局部接
种的方式,且不具遗传性,所以无法应用于种子
萌发和在幼苗生长早期表达的功能基因研究。
其次,如何获得目标基因的系统性沉默仍然
是VIGS技术目前需要解决的问题。据目前的研究
发现,VIGS虽然可以引发目标基因的系统性沉
默,但植株各个部位的沉默效率往往表现出不一
致性(Ekengren等 2003),即有些部位沉默效率很
高,但有些部位只有轻微的沉默表型。我们用组
成性表达GUS基因的转基因番茄植株为材料,研
究VIGS的组织特异性也获得了相似的结果(未发
表资料),有些沉默植株甚至只在局部组织有表
型。如果目标基因沉默不能引起植株的明显表
型,判断是否系统性沉默将是非常困难的工作,
这也往往会对研究结果产生一定的影响。
第三,沉默持续的时间问题。目前的研究发
现,VIGS持续的时间可达到2~3个月(Liu等2002a,
2002b;Lu等 2003b;Ratcliff等 2001),这对于
生长周期较长的植物显然还不够。虽然在番茄中
采用低温和低湿的方法可适当延长VIGS的作用时
间(Fu等 2006),但过低温度和湿度对植物本身生
长将会产生影响,并延长植物的生长周期,以致
目标基因的沉默仍然不能维持到植物生长的后期。
通过病毒载体的选择或改造来增强病毒的活性,
从而延长VIGS的作用时间和增强目标基因的沉默
效果,可能是今后值得尝试的工作。
第四,目前最稳定和最有效的VIGS载体都
有一定的宿主范围限制,其中绝大部分都只是在
烟草和茄科植物(如番茄)中应用(Burch-Smith等
2004)。发展更宽宿主范围的VIGS载体,尤其是
能易于在拟南芥和水稻上有效应用,对植物功能
基因组研究将是非常有用的。另外,应用 VIGS
研究特定的基因需要相关序列信息,使此技术在
目前只有相对小的 EST库的物种中的应用将受到
限制。
第五,病毒载体如何有效地接种入植物体
内,并产生较强的沉默效果,是 VIGS技术实验
操作中的关键性步骤。接种过程中的多种因素都
可能影响接种效果,如接种方式、农杆菌的活性
及浓度、缓冲液的类型等。针对不同的植物和病
毒载体,探索出相应的有效接种方法将是VIGS技
术应用中需要解决的问题。
虽然VIGS技术目前还存着一些问题,但随
着VIGS技术研究的深入必将得到逐步完善。相信
VIGS技术必将在更多的植物物种中得到应用,并
将成为植物功能基因组学研究中广泛应用的技术。
参考文献
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