病毒诱导的基因沉默(VIGS)是植物基因功能研究的新技术。以组成型表达gusA基因的转基因番茄为材料,通过VIGS技术沉默gusA基因,对VIGS在番茄中的组织特异性进行了初步分析。结果表明,VIGS技术能有效地诱导gusA基因在番茄植株的叶片、花、果实、侧枝、主茎及茎分枝点等部位和组织中沉默,证明VIGS在番茄中具有较强的系统性沉默特征。
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a recently developed technique for gene function studies in plants. In this study, the gusA transgenic tomato plant which constitutively expressed gusA gene was used as material. The gusA gene was silenced by VIGS for the preliminary tissue specificity analysis of VIGS in tomato. The results showed that gusA could be silenced in leafs, flowers, fruits, branches, stems and the points between branch and stem of tomato by virus-induced gene silencing. So VIGS as a powerful tool for the study of gene function could induce target gene systematic silencing in tomato.
全 文 :园 艺 学 报 2008, 35 (2) : 233 - 238
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 07 - 09; 修回日期 : 2007 - 12 - 04
基金项目 : 国家自然科学基金项目 ( 30571265) ; 教育部博士点基金项目 ( 20040157004 ) ; 沈阳农业大学青年教师基金项目
(2005027)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: ltl@ syau1edu1cn)
番茄花柄脱落过程中超微结构及亚细胞钙分布的变
化
许 涛 , 李天来 3 , 齐明芳 , 陈伟之
(沈阳农业大学园艺学院 , 辽宁省设施园艺重点实验室 , 沈阳 110161)
摘 要 : 采用扫描电镜和焦锑酸钙沉淀的电镜细胞化学法 , 研究了番茄花柄脱落过程中离区细胞以及
钙分布的变化。结果表明 : 离区的分离开始于皮层与维管束周围小细胞 , 先在这两个区域出现少量不连续
的胞间空隙 , 并逐渐在维管组织区形成连续的断裂面 , 此后断裂面向中央的髓部组织延伸 , 先是维管组织
的分离 , 然后是最中间的髓部以及最外侧表皮组织。钙分布研究发现脱落发生之前钙主要分布在细胞壁、
质膜及液泡中。脱落发生后 , 钙颗粒主要分布在退化细胞壁和细胞间隙中 , 少量分布在细胞质中。皮层、
维管束以及髓部细胞在整个脱落过程中钙分布以及钙形态明显不同 , 这可能是造成离区各组织在脱落中有
不同分离程度的主要原因。
关键词 : 番茄 ; 花柄 ; 脱落 ; 钙分布 ; 超微结构
中图分类号 : S 64112 文献标识码 : A 文章编号 : 05132353X (2008) 0220233206
Changes in the Cell Ultra structure and Ca lc ium D istr ibution D ur ing Toma to
Ped icel Absc ission
XU Tao, L I Tian2lai3 , Q IM ing2fang, and CHEN W ei2zhi
(College of Horticu lture, Shenyang A gricu ltura l U niversity, L iaon ing P rovince Key Laboratory of Protected Horticulture, Shenyang
110161, Ch ina)
Abstract: Cell ultrastructure and calcium distribution during tomato pedicel abscission were studied by
using scanning electron m icroscopy and antimoniate p recip itate calcium electrom icroscop ic cytochem ical meth2
ods. Results showed that the abscission was initialed in cortex and cellule around vascular bundle on which
two inconsecutive cell interspaces appeared firstly, and later the cell interspaces of vascular bundle formed
consecutive separation parts gradually. A s the abscission p rocession happened, separation parts were extended
to m iddle of abscission p late, then vascular bundle rup tured, and the marrow tissue and outer ep iderm is sepa2
rated at latest. Ca2 + location analysis showed that before abscission calcium iron mainly concentrated within
vascular and vacuole, cell wall and cell membrane of cortex and marrow. After abscission there was a mass
calcium deposition in vascular bundle, when marrow separated, calcium grain mainly in degraded cell wall
and intercellular space, little detected in cytop lasm. In abscission there was a great difference in calcium loca2
tion and contents between cortex, vascular and marrow which would be mainly caused by different separation
p rocession of the abscission zone tissue.
Key words: tomato; pedicel; abscission; calcium distribution; cell ultrastructure
钙是植物体内必需元素 , 密切关系到植物的生长发育 , 它不仅影响叶片等营养器官的发育 , 而且
是影响花、果实等器官脱落的最重要的矿质元素之一 (Hep ler, 2005)。Samp son (1918) 研究发现用
园 艺 学 报 35卷
草酸去除钙后能明显促进脱落的发生 , 而且脱落过程中还伴随着离区的钙含量减少。 Iwahori和 van
Steveinck (1989) 通过 X射线技术定位分析证明 , 柠檬叶片外植体脱落时 , 离层细胞壁与液泡中
Ca2 +总量降低 , IAA延缓叶片脱落 , 维持离层较高 Ca2 +的含量。但是关于脱落过程中的亚细胞钙分
布以及钙在各部位的作用还不是很清楚。
番茄的落花落果严重影响生产效益 , 研究番茄花脱落中细胞超微结构以及亚细胞水平的钙定位变
化有助于了解番茄花脱落的机理 , 同时对指导生产实践也有一定意义。
1 材料与方法
111 材料
供试番茄品种为 ‘辽园多丽 ’。
2004年 2月 18日播种 , 4月 9日定植于日光温室内 , 常规栽培管理。5月上旬 , 当植株第 1花序
开花时 , 取各株相同或相近位置花序上的小花 (小花花柄离层上下长度和子房、雌雄蕊大小均正常 ,
花瓣全部呈 90°开张或者只有一瓣未开张 , 花瓣鲜黄色 ) , 剪去花柄上端花冠 , 只留 4 cm花柄 , 插入
装有 1%琼脂培养基的培养皿中 , 并将其放入 39 cm ×24 cm ×20 cm底部开口的玻璃培养箱中 , 底部
用水密封每个培养皿插入 50个小花柄。
试验设 3次重复。
112 扫描电镜观察
取培养 0、8、16、20、24和 32 h且具有各时刻典型形态学特征的花柄外植体用于固定 , 作为扫
描电镜观察样品。
具体的标准是 : 0 h, 外植体的直径 , 长度相同 , 远轴端与近轴端的角度一致 ; 8和 16 h, 除具有
0 h取样的标准外 , 外植体离区部位具有相同粗细的白色凹痕线 ; 20 h, 除具有 8和 16 h取样的标准
外 , 处于半分离状态的外植体倾斜相同角度 , 已经分离的部分具有相同的裂口 ; 24 h, 除具有 8和 16
h取样的标准外 , 处于分离状态的外植体倾斜相同角度 , 外植体离区四周的相应部位具有相同的裂
口 ; 32 h, 完全分开。
剪切含花柄离区上下 2 mm范围的整段花柄 , 用 215%戊二醛 [含 2%焦锑酸钾的 011 mmol·L - 1
磷酸钾缓冲液 (pH 718) ] 固定样品 , 排气使其快速被固定液浸透。采用扫描电镜常规临界点干燥方
法处理样品 : 乙醇浓度从 30% ~100%进行间隔 10%系列梯度脱水 , 日立 HCP22型临界干燥仪对样品
进行临界点干燥处理 , 在样品干燥后 , 继续加温烘烤 , 到样品可塑性最小时在离区中心断裂样品 , 将
离区细胞裸露在表面 , 在大量样品中选择准确在离区中心断裂的样品 ,
每种样品重复 5次以上比较观察拍照。用 E IKO公司生产的 IB25型离子镀膜仪溅射镀金膜 , 用日
立公司生产的 S2450型扫描电镜观察拍照。
113 钙分布电镜观察
Ca2 +分布的电镜观察参照 Borgers等 (1982) 的焦锑酸钾沉淀技术略作修改。取培养 8、16和 32
h具有各时刻典型形态学特征的花柄外植体用于钙分布分析 , 标准同上。
截取含花柄离区的 115 mm3小块组织 , 迅速投入初固定液中 , 经注射器抽真空后 , 4 ℃固定 4 h
以上。用 1%锇酸 [含有 2%焦锑酸钾的 011 mmol·L - 1磷酸钾缓冲液 (pH 718) ] 固定 , 4 ℃过夜 ,
经丙酮系列脱水 , Epon树脂包埋 , 切片。为避免染色对焦锑酸钙颗粒观察的干扰 , 没有染色 , 在锇
酸固定时用新配药品 , 延长固定时间以增加电子反差。试验中注意到植物在受到切口伤害后 , 自身反
应切口附近钙离子增多 , 所以在切片时修掉切口附近 012 mm样品 , 保证被观察的离区不受切口钙离
子变化的影响。
在 JSX2100CXⅡ型透射电镜下进行钙的细胞化学和超微结构的观察与照相。
432
2期 许 涛等 : 番茄花柄脱落过程中超微结构及亚细胞钙分布的变化
2 结果与分析
211 番茄花柄脱落的过程
在番茄花柄脱落之前 , 人为折断的横断面上 , 所有细胞的细胞壁都呈现出外力撕裂状 , 说明皮层
薄壁细胞、维管束及其周围小细胞和髓部薄壁细胞都保持完整状态 , 各部位未发生水解现象 (图版
Ι, 1)。脱落开始后 , 首先是表皮内侧和维管束周围的小薄壁细胞的细胞壁以及胞间层水解 , 断裂面
的皮层部位细胞呈圆涨颗粒状 (图版Ι, 2)。
随着脱落的进行 , 皮层与维管束之间的薄壁细胞间全部发生水解 , 细胞间附着力降低 , 断裂面上
皮层与维管束之间的细胞呈圆涨颗粒状 , 但维管束仍保持完好 (图版Ι, 3)。
脱落发生到中后期 , 皮层外侧细胞水解更加严重 , 并且形成了保护层 , 而部分维管束组织发生断
裂 , 但这一现象不是发生在所有的维管束组织当中 (图版Ι, 4)。脱落发生后期 , 大部分维管束组织
发生断裂 , 皮层与维管束之间的组织形成保护层 , 但是最外侧表皮细胞以及髓部薄壁细胞仍保持完好
(图版Ι, 5)。
髓部细胞完成分离后 , 花柄脱落过程即完成 , 整个离区形成保护层 , 并且断面上保留有完整圆形
的髓细胞 (图版Ι, 6)。
212 花柄脱落过程中离区各部位钙分布的变化
钙离子分布定位的电镜观察结果显示 , 脱落发生之前皮层细胞的细胞质中充满了大量的小絮状焦
锑酸钙 , 少量出现在质膜上 , 而在细胞壁上很少见钙的出现 (图版 Ⅱ, 1)。丰富的钙颗粒出现在维
管束的导管中 (图版 Ⅱ, 2)。髓部细胞有少量大的钙颗粒出现在质膜和细胞壁上 (图版 Ⅱ, 3)。但
是在维管束和皮层部位的钙形态与髓组织中的不同 , 前者呈细小弥散状 , 后者呈大颗粒状。
脱落发生后 , 皮层部位细胞水解 , 细胞壁和细胞间隙以及细胞质中都有大量小焦锑酸钙颗粒出
现 , 表明皮层细胞的细胞壁以及细胞器发生水解 , 钙被释放出来 (图版 Ⅱ, 4)。此时导管中的焦锑
酸钙颗粒变化不大 , 其相邻的筛管中有少量大的焦锑酸钙颗粒出现 (图版 Ⅱ, 5)。而髓组织有少量
的焦锑酸钙颗粒出现在质膜和细胞壁中 , 表明细胞壁开始降解 (图版 Ⅱ, 6)。
当脱落完成时 , 离区所有细胞都发生水解 , 大量小的焦锑酸钙颗粒出现在已水解的皮层薄壁组织
的细胞壁、细胞间隙以及细胞质中 (图版 Ⅱ, 7 )。导管内部也出现大量小而弥散的焦锑酸钙颗粒 ,
但导管组织保持完好 (图版 Ⅱ, 8)。降解的髓组织部位 , 有大量的小焦锑酸钙颗粒出现在细胞间隙
和降解的细胞壁中 (图版 Ⅱ, 9)。
3 讨论
多数番茄可以直接用肉眼观察到花柄表皮部分凹陷 , 类似 “关节 ”的离区 , 生理脱落均发生在
此处。离区部分是由 5~30层小细胞组成 , 不同类型的组织 (表皮、皮层、维管束区域以及中央薄
层细胞 ) 构成离区细胞的层数差异很大。田渊俊人 (1999) 认为番茄花柄的脱落 , 起始于表皮组织
的细胞增大 , 随后这种细胞增大的特征逐渐扩展到皮层区、维管束区、中央皮层薄壁细胞和髓部 , 最
后扩大的细胞之间形成空腔 , 脱落完成。本研究发现 , 离区的分离开始于皮层与维管区小细胞 , 逐渐
在维管组织区形成连续的断裂面 , 此后断裂面向中央的髓部组织延伸 , 先是维管组织的分离 , 然后是
最中间的髓部组织以及最外侧的表皮组织。这一脱落过程的差别可能是由于不同品种的番茄其细胞壁
组成不同而造成的。此外 , 在脱落过程中不同组织的分离方式也不同。表皮、皮层和髓部细胞主要是
细胞壁的中间层水解 , 偶尔伴随着细胞壁的水解 , 其细胞很少发生解离 , 维管束部位则是由于其邻近
细胞的膨大或重力的影响而机械断裂。Thomp son和 O sborn (1994) 研究认为 , 在菜豆的离区组织中
维管组织区在对脱落信号发生响应后 , 皮层部位就可以独立完成脱落 , 因此维管组织区可能在脱落的
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园 艺 学 报 35卷
信号转导中具有特殊作用。
研究表明 , 钙对植物器官脱落有重要的调控作用。 Iwahori等 (1994) 利用焦锑磷酸钾沉淀法验
证了柑橘叶片外植体脱落之前 , 大量钙分布在质膜周围 , 胞质和细胞壁的中胶层中 , 少量分布在液泡
内。TFP促进脱落时 , 大量钙分布于退化的细胞壁中胶层中 ; 而 IAA处理抑制脱落时 , 仅发现有少量
钙分布于细胞质中。这说明细胞壁特别是中胶层的水解释放出 Ca2 +早于细胞器水解 , 因此中胶层的
状态可以看作是否发生脱落以及脱落快慢的重要标志。本研究发现脱落发生前各组织中钙主要分布在
离区组织的细胞壁、质膜及液泡中。维管束细胞在脱落后其内部有部分钙离子颗粒沉淀 , 而在整个脱
落过程中未发现其细胞壁发生变化 , 这一结果暗示维管束在脱落过程中的断裂并不是由于自身的水解
而很可能是由于其相邻细胞的膨胀力或是重力造成的。而随着脱落的进行 , 髓细胞质膜和细胞壁上大
的钙颗粒消失 , 变成细小弥散状钙颗粒存在于细胞间隙中 , 而在细胞质中没有检测到钙沉淀。不同部
位的钙积累方式暗示着在脱落过程中可能有不同的降解方式 , 皮层以及维管束周围的小细胞以胞壁和
细胞器的降解为主要方式 , 而髓细胞则主要是胞壁的降解 , 很少涉及其内部细胞器的解离 , 维管束部
位则很少观察到其结构变化。因此 , 脱落过程中皮层与维管束周围的小细胞的降解是脱落的主要原因
或者说是脱落的启动子 , 而维管束断裂和髓细胞解离是脱落必须因子或者说是脱落的完成。
Poovaiah等 (1987) 的研究证明 , Ca2 +在植物细胞内充当信使具有传递胞外信号的作用。Knight
和 Campbell (1991) 发现胞内 Ca2 +浓度的区域化分布能被外界物理或化学信号改变 , 这种 Ca2 +浓度
分布的改变继而引发一系列的生理生化反应 , 最终导致植物的外部反应。本试验结果显示 , 在脱落的
整个过程中离区各组织的钙分布明显不同 , 这可能是导致离区各组织在脱落过程中有不同分离水平的
主要原因。根据本研究结果可以推测 , 来自胞外的脱落信号会使细胞质与细胞核中的 Ca2 +水平升高 ,
启动某些与脱落相关的基因转录与表达如膨胀蛋白的出现 , 水解酶如多聚半乳糖醛酸酶和纤维素酶等
活性升高从而加速细胞器以及细胞壁降解 , 但各组织内的钙分布决定了这一反应的快慢 , 从而表现出
离区各组织有不同的分离程度。本试验结果初步表明 , 番茄花柄外植体的钙分布在脱落过程中明显不
同 , 这种变化与脱落进程密切相关。
References
BorgersM, Thone F J M, Xhonneux B J M. 1982. Location of calcium in red blood cells. Journal of H istochem istry and Cytochem istry, 31 (1) :
109 - 116.
Hep ler P K. 2005. Calcium: a central regulator of p lant growth and development. Plant Cell, 17: 2142 - 2155.
Iwahori S, Kai R, N ishiM. 1994. Subcellular localization of calcium ion within cells of the abscission layer of citrus leaf exp lants during abscis2
sion. J Japen Soc Hort Sci, 63: 45 - 50.
Iwahori S, van Steveinck R F M. 1989. Location of calcium within cells of the abscission layer of lemon leaf exp lants. Acta Hort, 239: 431 - 434.
Knight M R, Campbell A K. 1991. Transgenic p lant aepuorin reports the effects of touch and cold2shock and elicitors on cytop lasm ic calcium. Na2
ture, 352: 524 - 530.
Poovaiah B W , Mcfadden J J, Reddy A N. 1987. The role of calcium ions in gravity signal percep tion and transduction. Physiol Plantarum, 71:
401 - 407.
Samp son H C. 1918. Chem ical changes accompanying abscission in Coleus blum ei. Bot Gaz, 66: 32 - 53.
Stosser R L, Deway D H, Shull V E. 1972. Calcium crystals in app le stem, petiol and fruit tissue. HortSci, 7: 492 - 493.
Thomp son D S, O sborn D J. 1994. A role for the stele in intertissue signaling in the initiation of abscission in bean leaves ( Phaseolus
vulgaris L. ) . Plant Physiology, 105: 341 - 347.
Toshihito Tabuchi. 1999. Comparison on the development of abscission zones in the pedicels between two tomato cultivars. Japan Soc Hort Sci, 68
(5) : 993 - 999. ( in Japanese)
田渊俊人. 1999. ¨ ¾¨ の小花柄における離層の形成と発達. 園芸学会雑誌 , 68 (5) : 993 - 999.
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2期 许 涛等 : 番茄花柄脱落过程中超微结构及亚细胞钙分布的变化
图版Ⅰ说明 : 1. 近轴端脱落前人为断裂面 ; 2. 处理 8 h, 近轴端 1 /4面积自然分离时人为断裂面 ; 3. 处理 16 h, 近轴端 1 /3面积自
然分离时人为断裂面 ; 4. 处理 20 h, 近轴端 1 /2面积自然分离时人为断裂面 ; 5. 处理 24 h, 近轴端 4 /5面积自然分离时人为断裂面 ;
6. 处理 32 h, 近轴端完全自然脱落后断裂面。Pi: 髓 ; Ep: 表皮 ; Cx: 皮层 ; Vb: 维管束 ; Cp21: 维管束周围小细胞。
Explana tion of pla teⅠ: 1. Intact abscission p late in p roximal distal of pedicel before abscission rup tured by artificial; 2. Incubated for 8 h 25%
p roportion naturally abscised abscission p late in p roximal distal of pedicel rup tured by artificial; 3. Incubated for 16 h 3313% p roportion naturally
abscised abscission p late in p roximal distal of pedicel rup tured by artificial; 4. Incubated for 20 h 50% p roportion naturally abscised abscission
p late in p roximal distal of pedicel rup tured by artificial; 5. Incubated for 24 h 80% p roportion naturally abscised abscission p late in p roximal distal
of pedicel rup tured by artificial; 6. Incubated for 32 h abscission p late in p roximal distal of pedicel after abscission. Pi: Pith; Ep: Ep iderm;
Cx: Cortex; Vb: Vascular bundle; Cp21: Cell p roximal cortex.
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园 艺 学 报 35卷
图版Ⅱ说明 : 1. 脱落前皮层细胞钙分布 ( ×8 000) ; 2. 脱落前维管束细胞钙分布 ( ×10 000) ; 3. 脱落前髓细胞钙分布 ( ×10
000) ; 4. 脱落过程中皮层细胞钙分布 ( ×8 000) ; 5. 脱落过程中维管束细胞钙分布 ( ×10 000) ; 6. 脱落过程中髓细胞钙分布 ( ×
10 000) ; 7. 脱落后皮层细胞钙分布 ( ×10 000) ; 8. 脱落后维管束细胞钙分布 ( ×10 000) ; 9. 脱落后髓细胞钙分布 ( ×10 000)。
Cp: 细胞质 ; Is: 细胞间隙 ; Pm: 质膜 ; Vm: 液泡膜 ; V: 液泡 ; Cw: 细胞壁 ; Sw: 导管壁次生增厚。
Explana tion of pla tes Ⅱ: 1. Calcium distribution in cortex before abscission ( ×8 000) ; 2. Calcium distribution in vascular before abscission
( ×10 000) ; 3. Calcium distribution in marrow before abscission ( ×10 000) ; 4. Calcium distribution in cortex during abscission ( ×8 000) ; 5.
Calcium distribution in vascular during abscission ( ×10 000) ; 6. Calcium distribution in marrow during abscission ( ×10 000) ; 7. Calcium dis2
tribution in cortex after abscission ( ×10 000) ; 8. Calcium distribution in vascular after abscission ( ×10 000) ; 9. Calcium distribution in mar2
row after abscission ( ×10 000) . Cp: Cytop lasm; Is: Intercellular space; Pm: Plasma membrane; Vm: Vacuole membrane; V: Vacuole;
Cw: Cell wall; Sw: Second wall.
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