全 文 ：园艺学报，2015，42 (1)：31–37.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-0554；http：//www. ahs. ac. cn 31
查尔酮合酶基因对桃果实花色苷代谢的影响
张 蕾，朱立新，徐 川，崔春梅，盛宏亚，李 瑞，王红清*
（中国农业大学农学与生物技术学院果树系，北京 100193）
摘 要：从桃（Prunus persica）果皮中克隆了 493 bp 的查耳酮合酶（Chalcone Synthase，CHS）基因
片段，利用病毒诱导的基因沉默技术（VIGS）构建干扰载体 TRV-LIC-CHSi，通过农杆菌渗入法沉默目的
基因 CHS 的表达，从而研究 CHS 在桃果实花色苷代谢途径中的功能。干扰 CHS 基因的表达后，CHS 的
表达量降低 88.8%，果皮中花青素糖苷含量下降 87%，槲皮素糖苷含量下降 35%，绿原酸含量升高 57%，
原花青素含量、儿茶素含量和山奈酚糖苷含量无显著变化。研究结果表明，沉默 CHS 基因，会使整个花
色苷代谢途径转向绿原酸及其复合物方向。CHS 基因调控着类黄酮类物质的代谢方向，是花色苷代谢途
径中的重要基因。
关键词：桃；查尔酮合酶（CHS）；病毒诱导的基因沉默（VIGS）；花色苷；绿原酸
中图分类号：S 662.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）01-0031-07

The Effect of Silencing Chalcone Synthase on Anthocyanin Metabolism in
Peach
ZHANG Lei，ZHU Li-xin，XU Chuan，CUI Chun-mei，SHENG Hong-ya，LI Rui，and WANG Hong-qing*
（College of Agronomy and Biotechnology，China Agricultural University，Beijing 100193，China）
Abstract：In this study，we cloned a 493 bp CHS fragment from the peach（Prunus persica）peal and
constructed interference vector TRV-LIC-CHSi using virus-induced gene silencing（VIGS）to study the
function of PpCHS in anthocyanin pathway in peach skin by Agrobacterium infiltration. The interference
successfully decreased CHS expression by 88.8% and remarkably modified anthocyanins content in peach
skin，specifically，anthocyanin content and quercetin content decreased by 87% and 35% respectively；
Chlorogenic acid content increased by 57% up；The content of procyanidin，catechin and kaempferol did
not show significant change. Our results demonstrated that the whole anthocyanin pathway was turned to
chlorogenic acid and its complexes synthesis when the expression of CHS was severely repressed. CHS is
an important gene in anthocyanin synthesis and regulates the relative amount of specific flavonoids.
Key words：peach；chalcone synthase（CHS）；virus-induced gene silencing（VIGS）；anthocyanin；
chlorogenic acid

桃（Prunus persica）果实色泽是其外观品质的重要因素之一，着色情况会直接影响其商品价值。
一般从套袋、喷施激素（杜纪红，2007；杨娜 等，2011）等方面研究其对桃果皮花色苷积累的影

收稿日期：2014–08–06；修回日期：2014–10–13
基金项目：国家科技支撑计划项目（2013BAD20B01）；国家‘863’计划项目（20132013AA103002-2）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：wanghq1011@163.com）
Zhang Lei，Zhu Li-xin，Xu Chuan，Cui Chun-mei，Sheng Hong-ya，Li Rui，Wang Hong-qing.
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响，在色泽形成机理上的研究还较少。
花色苷代谢途径中的前体物质是苯丙氨酸，通过一系列转化形成 p–香豆酰辅酶 A，一方面可
以继续参与苯丙烷代谢途径，经酶催化形成绿原酸；另一方面也可以与三分子的丙二酰辅酶 A 经查
尔酮合酶等催化生成各类不同结构的类黄酮类物质（赵秀林，2012）。花合成花色苷等类黄酮类物
质涉及的酶中，查尔酮合成酶（CHS）催化一分子 4–羟基香豆素辅酶 A 和三分子丙二酰辅酶 A 缩
合，生成查尔酮及其衍生物，最终形成类黄酮，包括黄酮醇、黄烷酮、花色苷等（Almeida et al.，
2007；周君 等，2009）。CHS 是花色苷生化合成途径中的第一个酶，但 CHS 基因在桃果实中如何
控制花色苷的合成尚不十分清楚。
病毒诱导的基因沉默（VIGS）是一种高效、特异性强的基因沉默技术。作为一种新的基因鉴定
和功能研究的工具，已越来越广泛地应用于植物基因功能研究中（徐幼平 等，2008）。自 Kumagai
等（1995）首次利用重组烟草花叶病毒在本氏烟中成功沉默了植物内源八氢番茄红素脱氢酶基因以
来，已有源于 15 种病毒的 VIGS 载体相继得到开发和应用。Dong 等（2007）开发了改进后的 TRV-LIC
载体，引入致死基因 ccdB，提高了阳性克隆的效率；克隆目的片段时无需连接步骤，使得载体构建
过程简单化；接头片段的利用，相比传统的含内含子的 RNA 发夹结构干扰技术所需要的 7 个酶切
位点（Hoffmann et al.，2006）简便得多，又减少了酶切工程的成本，因而适宜于大规模高通量 VIGS
筛选研究。利用此项技术构建载体，已被成功应用在烟草（Dong et al.，2007）、番茄（马红珍，2010）、
草莓（Li et al.，2013）、桃（Jia et al.，2010）等基因功能研究，沉默效果良好。
本研究中利用病毒诱导的基因沉默技术，构建干扰载体 TRV-LIC-CHSi，通过农杆菌渗入法沉默
桃果实目的基因 CHS 的表达，从而研究 CHS 在桃花色苷代谢途径中的功能。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验于 2013 年 4—12 月进行。试验材料为晚熟桃品种‘晚蜜’，栽培于北京市昌平区，常规栽
植和管理。
1.2 桃果实总RNA的提取及其反转录
用植物 RNA 快速提取试剂盒（天根）提取幼果期桃果皮总 RNA，在除蛋白步骤中加 DNaseⅠ
和缓冲液（TaKaRaBio），室温静置 15 min 以除去基因组 DNA。RNA 纯度和完整性用琼脂糖凝胶电
泳、A260/A280 和 A260/A230 比值鉴定。
取 1.2 μg RNA、oligod（T15）和反转录酶（Promage）反转录得到 cDNA。利用桃的内参基因
TEF2（序列号：JQ732180.1）；（正向：5′-GGTGTGACGATGAAGAGTGATG-3′，反向：5′-TGAA
GGAGAGGGAAGGTGAAAG-3′）验证 cDNA 反转录成功。
1.3 桃CHS的克隆
以第一条 cDNA 为模板，参考 NCBI 上桃（Prunus persica）基因组推断的 CHS 序列（序列号：
JN391444.1）设计引物。正向：5′-cgacgacaagaccctACATGGCTCCGTCCCTGGAT-3′；反向：5′-gaggagaa
gagccctTGTCGGGAAGGATGGTTTGG-3′（小写部分为接头序列）。PCR 扩增合成 CHS 的保守型片
段，然后进行测序和同源性比对验证。
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1.4 干扰载体TRV-LIC-CHSi的构建及鉴定
干扰载体由清华大学刘玉乐教授惠赠。用限制性内切酶 PstⅠ将 TRV2-LIC 质粒进行单酶切，然
后用 T4 DNA 聚合酶分别在 dTTP 和 dATP 中处理 TRV2-LIC 质粒单酶切产物和 CHS 片段 PCR 产物，
将处理产物进行连接反应。连接产物转化感受态 DH5α，涂布 LB 平板（含有 Kna 50 mg · L-1）培养，
37 ℃倒置过夜培养形成单菌落，即可获得重组载体 TRV-LIC-CHSi。
挑斑，摇菌，将携带重组载体的菌液进行测序和同源性比对验证。
1.5 农杆菌转染及注射
将干扰载体质粒 TRV-LIC-CHSi 和 TRV-LIC 质粒分别转入农杆菌 GV3101 感受态。农杆菌在 LB
固体培养基（含有 Kna 50 mg · L-1、Rif 50 mg · L-1）上 28 ℃倒置培养 2 d。挑取单菌落，摇菌，并
利用质粒 PCR 筛选出携带 TRV-LIC-CHSi 的 GV3101 农杆菌菌株。将鉴定为阳性克隆的菌液接种
于 30 mL LB 液体培养基上，28 ℃震荡培养至 OD600 = 0.8，离心，弃上清液，用注射缓冲液（10
μmol · L-1 MES，10 μmol · L-1 MgCl2，200 μmol · L-1 乙酰丁香酮）重悬农杆菌，至 OD600 的值达到 0.8
左右。
于桃果实大绿果期（即果实已膨大成熟未着色时）在果实向阳面用 1 mL 注射器倾斜插入，针
头约在果皮下 1 mm 处（针管插入 1 cm 左右），注射侵染携带病毒载体的农杆菌。侵染 2 周后采收
果实。以注射器的针头所在位置为中心，半径约 1 cm 的侵染区域，用手术刀削取果皮，将侵染部分
切成 0.5 g 左右小块状，液氮速冻后于–80 ℃冰箱保存备用。
1.6 荧光定量法检测目的基因表达量
根据 NCBI 上登录的桃（Prunus persica）CHS 序列（序列号 JN391444.1）设计克隆 CHS 基因
片段的正反方向引物（正向：5′-AGGGCTACGAAGAAAGGA-3′，反向：5′-ACGAAGCAGACGCATAA
A-3′），片段长度 173 bp。以 TEF2 基因为内参基因，引物同反转录验证内参引物。采用荧光定量 PCR
法（相对定量法）检测 CHS 在干扰果和对照果中的表达量。
1.7 高效液相色谱法检测花色苷物质代谢
分别称取 TRV-LIC-CHSi 干扰果及对照果果皮混合样品 1 g 左右，每个混合样品 2 个果，重复
3 次，液氮冷冻并研磨成粉末状，用 2 mL 1%盐酸—甲醇溶液于 4 ℃冰箱黑暗状态下浸提 24 h 至
无色，10 000× g、4 ℃、离心 20 min，经微孔滤膜（0.22 μm 有机膜）过滤后，用于高效液相色谱检测。
采用 HP1100 系列高效液相色谱仪进行定量分析。HPLC 的条件为柱温 35 ℃，流动相为 100%
乙腈和 2%甲酸水溶液，流速为 0.5 mL · min-1，进样量为 20 µL，线性梯度洗脱设计。
采用高效液相色谱串连质谱仪（HPLC/Q-TOF MS/MS）定性分析。质谱分析条件及结构物质分
析参考 Tomás-Bárberán 等（2001）、Seeram 等（2006）和 Lopes-da-Silva 等（2007）的方法。结果
采用 MassLynx V4.0 色谱分析软件进行分析。（+）–儿茶素、（–）–表儿茶素、绿原酸、槲皮素–3–
半乳糖苷等标准物质采购于美国 Sigma 公司。
花色苷类物质在 515 nm 处分析，以花青素 3–葡萄糖苷为外标定量分析；黄酮醇类物质在 355
nm 处分析，以槲皮–3–半乳糖苷为外标定量分析；酚酸类物质在 320 nm 处分析，以绿原酸为外
标；黄烷 3–醇类物质在 280 nm 处分析，以儿茶素作外标定量分析。各类物质总量为在相应波长处
有最大吸收的各组成物质质量之和。

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2 结果与分析
2.1 桃果实RNA提取及CHS基因的克隆
用 RNA 快速提取试剂盒提取桃果实总
RNA，RNA 纯度和完整性用琼脂糖凝胶电泳检
测，然后将 RNA 反转录为 cDNA。以桃果实的
cDNA 为模板，利用 RT-PCR 克隆得到了 CHS
基因的序列（图 1），经测序显示序列长为 493
bp。与 NCBI 上记载的桃果实 CHS 序列进行比
对，同源性高达 99%，表明基因片段克隆成功。
图 1 CHS 基因克隆电泳检测
Fig. 1 The electrophoretogram of CHS gene
2.2 干扰载体的构建及鉴定
将连接得到的重组沉默载体 TRV-LIC-
CHSi 转化感受态 DH5α，挑取单克隆摇菌，提
取质粒进行 PCR 鉴定。结果显示，以重组质
粒 TRV-LIC-CHSi 为模板进行 PCR 扩增，在目
标片段处存在目的条带，且与 CHS 基因克隆片
段的大小一致，而以空质粒 TRV2-LIC 为模板
则没有条带出现（图 2）。提取质粒并送测序，
在 NCBI 的 Nucleotide 上比对，与桃 CHS 基
因（登录号 JN391444.1）中部（981 ~ 1 473 bp）
序列一致，表明干扰载体已构建成功。
图 2 基因沉默载体 TRV-LIC-CHSi 的鉴定结果
Fig. 2 Identification of TRV-LIC-CHSi gene
silencing vector results
2.3 TRV-LIC-CHSi干扰对果实外观表型的影响
含有干扰载体的农杆菌注射桃果实后 10 ~ 14 d 观察发现，所有 TRV-LIC-CHSi 干扰果的侵染部
位（箭头）表皮着色变浅，有些甚至未着红色（图 3，A、B），而注射空载体 TRV-LIC 的对照果的
果皮呈现红色（图 3，C）。



图 3 TRV-LIC-CHSi 干扰果（A，B）和 TRV-LIC 对照果（C）的果皮着色表型
Fig. 3 Phenotypes of the TRV-LIC-CHSi infiltrated（A，B）and TRV-LIC control（C）fruits

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2.4 TRV-LIC-CHSi干扰对CHS基因表达量的
影响
荧光定量 RT-PCR 分析桃果皮侵染部位
CHS 基因的相对表达量，结果表明，与对照果
相比，TRV- LIC-CHSi 干扰果 CHS 的表达量明
显下降，仅为对照果的 11.2% ，这说明
TRV-LIC-CHSi 起到了强烈的干扰效果，使得
CHS 基因沉默（图 4）。
图 4 TRV-LIC-CHSi 干扰果和对照果 CHS 基因的
相对表达量
Fig. 4 CHS gene expression of TRV-LIC-CHSi
transfected fruit and control fruit
** P = 0.01.
2.5 TRV-LIC-CHSi干扰对花色苷代谢的影响
利用高效液相色谱法对成熟期果实进行检
测，检测到多种物质，包括花色苷类及其代谢
途径中类黄酮类和羟基肉桂酸类等。为便于分
析比较花色苷物质含量，采用了对数坐标表示（图 5）。与对照果相比，TRV-LIC-CHSi 干扰果中花
青素糖苷和槲皮素糖苷含量显著下降，绿原酸含量显著升高，原花青素、儿茶素和山奈酚糖苷含量
无明显变化。

图 5 TRV-LIC-CHSi 干扰果和对照果的花色苷物质含量
Fig. 5 Anthocyanins content of TRV-LIC-CHSi transfected fruit and control fruit
** P = 0.01.
3 讨论
大量研究表明果树中的苹果、葡萄、桃等花色苷合成途径与玉米、矮牵牛、拟南芥、金鱼草中
的合成途径基本相同，包括 CHS 基因在内的结构基因同源性很高，功能上也有相似性（张学英 等，
2004）。Tsuda 等（2004）研究发现，CHS 基因在桃果实发育后期大量表达。Ju 等（1995）研究发
现，尽管套袋苹果的果皮不能形成花青苷而不能着色，但查尔酮合酶仍保持着较高的活性。外施乙
烯可以促进黄酮醇和花色苷类物质的合成，但却对查尔酮合酶活性的影响不大，论述了 CHS 基因不
是苹果花青苷合成的限制性基因。本研究中，干扰 CHS 基因的表达会使得桃果皮中花青素糖苷含量
和槲皮素糖苷含量极显著下降。说明桃果实花色苷代谢中 CHS 基因起到关键的调节作用。

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Hoffmann 等（2006）报道，干扰草莓的 CHS 基因表达后，整个类黄酮途径转向苯丙烷途径，
而本研究中干扰桃果实 CHS 基因表达，整个途径向绿原酸及其复合物方向转移，部分代谢也转向苯
丙烷途径。由于各个分支途径中相关酶的动力学特征，基因细胞内的定位和组织不同，从而使得向
各个分支途径的产物分配率不同（Silvia et al.，2001），所以当下游产物的花色苷代谢途径合成受
到抑制，而上游产物苯丙烷代谢途径的就会逐渐积累，使得整个途径分流至苯丙烷代谢途径，最终
整个代谢途径会向绿原酸及其复合物方向发展。Lin 等（2013）报道，干扰草莓果实二氢黄酮醇
4–还原酶（DFR）基因表达，花色苷代谢途径转向槲皮素糖苷方向，本研究中的物质走向与其不同，
可能草莓与桃的花色苷代谢途径的不同，草莓中花色苷代谢途径相对桃复杂，不仅多了一个花葵素
糖苷代谢分支，所形成的物质种类也相对多；另一方面可能是两个基因调控的分支不同。由于 CHS
是 DFR 的上游基因，而且在花色苷代谢途径中的上游被干扰表达时会直接影响花色苷代谢的整个支
路；而干扰 DFR 表达时，虽然花色苷代谢相关基因也是协同表达（Tsuda et al.，2004；王会良 等，
2013），导致物质在花色苷代谢途径中的某个分支受到抑制；但桃果实中各个相关基因之间究竟是
如何协同表达的，各基因表达对物质合成的影响有多大，还需要进一步研究分析。
CHS 基因的表达方式不仅和植物物种自身的遗传特性有关，还和温度、光照、激素等多种外界
因素有关。如 CHS 基因所编码的查尔酮合酶作为光诱导酶，UV-A、UV-B 会促进其酶活性增加，从
而促进花色苷的表达（Ubi et al.，2006；Guo & Wang，2010）。在果实成熟过程中，乙烯和 ABA 含
量增加，通过促进调节基因直接或间接影响着 CHS 基因的表达（陈文龙 等，2013）。总之，花色苷
的生物合成是一个十分复杂的过程，不同的因子对花色苷的生物合成都会产生不同的影响，而且各
种因子通常都是共同参与代谢调控过程。

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