全 文 ：植物生理学通讯 第 40卷 第 6期，2004年 12月 1
农杆菌抑菌剂的抑菌效果及其对小黑杨叶片不定芽产生率的影响
詹立平 姜静* 赵鑫 程贵兰 李淑娟 惠楠 刘桂丰
东北林业大学林学院，哈尔滨 150040
提要 研究了几种抗生素及 AgNO3 对农杆菌的抑菌效果和对小黑杨花粉植株叶片不定芽产生率的影响。确定首选抑菌抗
生素是头孢噻肟钠，AgNO3 的抑菌效果也很好，两者的有效抑菌浓度分别为 200 和 3.0 mg·L-1，抑菌时间均为 9 d，此浓
度下小黑杨叶片的不定芽产生率为 88% 和 89%。
关键词 小黑杨；抗生素；AgNO3；不定芽
Effects of Antibiotics on Agrobacterium and the Formation Rate of Adventi-
tious Buds from Leaves of Populus simonii×P. nigra
ZHAN Li-Ping, JIANG Jing*, ZHAO Xin, CHENG Gui-Lan, LI Shu-Juan, HUI Nan, LIU Gui-Feng
College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040
Abstract Effects of several antibiotics and AgNO3 on Agrobacterium and the formation rate of adventitious
buds from leaves of Populus simonii×P. nigra were studied. The results showed that the cefotaxime sodium
was the best among the three antibiotics when they were used to inhibit Agrobacterium strain EHA105, and
AgNO3 was also good. The optimal concentrations of cefotaxime sodium and AgNO3 were 200 and 3.0 mg·L
-
1 respectively. The inhibiting time for Agrobacterium was 9 d、Under these optimal concentrations, the forma-
tion rates of adventitious buds were 88% and 89%.
Key words Populus simonii×P. nigra; antibiotics; AgNO3; adventitious buds
收稿 2004-03-01 修定 2004-08-09
资助 国家转基因植物研究与产业化专项基金(J2002-B-004)
和黑龙江省科技计划项目(GB01B603-04)。
* 通讯作者(E-mail: jiangjing1960@126.com，Tel：
0451-82190607)。
用于林木转基因的方法很多，有农杆菌介导
法、基因枪法、PEG 法等[1,2]。其中，农杆菌介
导转化法以其简单、易于开展等优点而被广泛应
用[3]。但采用此方法时，植物材料受农杆菌侵染
后，需用抗生素及时、有效地杀死或抑制农杆菌
的生长，以防止其危害植物组织并影响植株再
生，但培养基中加入抗生素势必影响植物组织的
正常生长与分化[4]。因此，研究抗生素对农杆菌
的抑制效果和对植物叶片不定芽产生率的影响，
确定抗生素的种类及适宜浓度，是建立高效转基
因体系的关键。虽然杨树已成为林木转基因中的
模式植物[3]，但由于杨树种类众多，变异丰富，
不同株系之间遗传差异明显，因而在进行组织培
养及遗传转化过程中，应针对不同杨树品种选用
不同植株再生优化组培体系和遗传转化体系。本
文是在小黑杨组培再生植株优化体系建立的基础
上，研究转基因体系的优化问题的继续[5]。
材料与方法
小黑杨(Populus simonii×P. nigra)花粉植株无
菌苗为我们实验室保存。
农杆菌菌株为 EHA105，内含 pRBA 质粒，该
质粒含有nptⅡ基因和betA基因(山东师范大学馈
赠)。头孢曲松钠(ceftriaxone sodium)购自哈尔滨
制药总厂；头孢噻肟钠(cefotaxime sodium)购自北
京鼎国生物技术有限责任公司；头孢唑林钠
(cefazolin sodium)分别购自上海制药四厂(上药)和
哈尔滨制药总厂哈药；利福平(rifampicin，Rif)和
卡那霉素(kanamycin，Km)均购自 Sigma 公司。
在无菌条件下，将活化的农杆菌在叶片分化
培养基(MH+0.5 mg·L-1 6-BA+0.05 mg·L-1 NAA+50
mg·L-1 Rif+50 mg·L-1 Km)上划线培养，同时分别
加入头孢噻肟钠、头孢曲松钠和头孢唑林钠，设
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置的浓度为50~1 250 mg·L-1。
AgNO3 的抑菌实验培养基同上，参考文献6，
其浓度梯度设置为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg·L-1。
上述实验每个处理重复 3 次，以不加处理物
为对照，比较不同浓度的抗生素和AgNO3 的抑菌
效果，以选择适宜的抑菌剂。
以小黑杨花粉植株无菌苗叶片为外植体，用
MH+0.5 mg·L-1 6-BA+0.05 mg·L-1 NAA分化培养基，
分别附加头孢噻肟钠、头孢曲松钠、头孢唑林钠
和 AgNO3，浓度与上述相同。对照组不加抗生素
和 AgNO3，每个处理 40~50 片小黑杨叶片。21 d
后观察统计叶片的不定芽产生率，即不定芽产生
率 = 产生不定芽的叶片数 / 总叶片数 ×100%。
结果与讨论
1 不同头孢类抗生素对农杆菌的抑制作用
头孢类抗生素是目前农杆菌介导的转化实验
中广泛使用的抑菌抗生素，由于种类较多，对其
作用效果不能一概而论，应根据不同的实验作具
体分析。
将农杆菌分别涂在含不同浓度的头孢噻肟
钠、头孢曲松钠和头孢唑林钠的叶片分化培养基
上，连续观察10 d 的结果表明，几种抗生素的抑
菌能力明显不同(表1)。未加抗生素的平板(对照)
在第 2天即形成菌落，含50 mg·L-1 头孢噻肟钠的
平板在第7天才形成菌落。大于或等于200 mg·L-1
头孢噻肟钠的平板， 培养9 d未见农杆菌菌落形
成；头孢曲松钠的浓度在150~200 mg·L-1 时，培
养7 d未见农杆菌菌落形成；而头孢唑林钠若在8 d
内无农杆菌菌落形成，其浓度应大于750 mg·L-1。
本着经济而有效的原则，从连续10 d记录菌
落形成的情况来说，我们认为首选抗生素应是头
孢噻肟钠，头孢曲松钠次之，最后是头孢唑林
钠 。
2 AgNO3对农杆菌的抑制作用
表 2 表明，在含 AgNO3 的培养基上培养 6 d
均未见农杆菌菌落形成，而不加 AgNO3 的平板在
培养第 2 天就出现菌落。从第 7 天起，AgNO3 浓
度为 1.0 mg·L-1 的培养基上开始形成菌落；第8、
9天时，AgNO3 浓度为 1.5 和 2.0 mg·L-1 的培养基
上依次出现菌落；第 10 天时，AgNO3 浓度为 2.5
和 3.0 mg·L-1的培养基上均出现菌落。说明AgNO3
对农杆菌生长的抑制作用随其浓度的递增而明显加
强。
3 不同头孢类抗生素对小黑杨花粉植株叶片不定
芽产生率的影响
在植物遗传转化研究中，常使用头孢类抗生
表2 不同浓度AgNO3对农杆菌的抑制作用
Table 2 Effect of different concentrations
of AgNO3 on Agrobacterium
培养时间/d
AgNO3浓度/mg·L-1
0 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
2 + － － － － －
3 + － － － － －
4 + － － － － －
5 + － － － － －
6 + － － － － －
7 + + － － － －
8 + + + － － －
9 + + + + － －
10 + + + + + +
“+ ”表示出现菌落，“－”表示未出现菌落。
表1 不同抗生素对农杆菌的抑制效应
Table 1 The inhibitory effects of different antibiotics on
Agrobacterium
浓度/
菌落形成所需时间/d
mg·L-1
头孢唑林钠
头孢噻肟钠 头孢曲松钠
哈药 上药
0 2 2 2 2
50 2 2 7 7
100 3 3 8 7
150 3 3 9 8
200 3 3 10 8
250 3 3 － 10
300 4 4 － －
350 4 4 － －
400 5 5 － －
450 6 6 － －
500 8 8 － －
750 8 10 － －
1 000 － － － －
“－”表示在观察的时间范围内无菌落产生。
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素进行抑菌。在一定浓度范围内，抑菌剂能够促
进植物离体叶片产生不定芽[7]; 若浓度过大，抑菌
剂会对植物叶片组织分化产生一定的负作用。因
此，筛选出有效抑制农杆菌生长和对植物叶片组
织无伤害的最佳抗生素浓度是重要的。表 3、表
4 和图 1 表明：
(1)不同浓度头孢唑林钠对小黑杨叶片不定芽
产生率的影响无显著差异，叶片不定芽产生率在
88%~95% 之间(表 3、图 1)。但在有效的抑菌浓
度(750 mg·L-1)范围内，愈伤组织褐化率较高，因
此不是最佳的除菌剂。
(2)不同浓度头孢噻肟钠对叶片不定芽产生率
的影响有显著差异：浓度为 150~200 mg·L-1 时，
叶片不定芽产生率高达 88%，并且愈伤组织无褐
化现象；浓度大于500 mg·L-1 时，叶片不定芽产
生率明显下降，所形成的愈伤组织褐化程度较高
(表 4、图1)。根据抑菌实验结果，我们认为头孢
噻肟钠作为除菌剂的适宜浓度为200 mg·L-1。
(3)头孢曲松钠的浓度在150 mg·L-1时虽然可
有效抑制农杆菌生长，但叶片不定芽产生率仅为
33%，比未经头孢曲松钠处理的低 60%(表 4、图
1)，所以不宜作为小黑杨选择培养的抑菌剂。
4 AgNO3 对小黑杨花粉植株叶片不定芽产生率的
影响
AgNO 3 应用于遗传转化实验，已多有报道，
但在杨树的遗传转化中的报道尚未见。表 5 表
表3 头孢唑林钠对小黑杨花粉植株叶片不定芽产生率的影响
Table 3 Effect of cefazolin sodium on the formation rate of adventitious buds from
leaves of Populus simonii×P. nigra pollen plantlets
抗生素浓度/mg·L-1
外植体叶片数/片 愈伤组织诱导率/% 叶片不定芽产生率/% 愈伤组织褐化率/%
哈药 上药 哈药 上药 哈药 上药 哈药 上药
0 46 46 93 93 93 93 0 0
250 41 38 95 92 88 92 5 8
500 40 40 87 97 92 95 13 3
750 39 41 95 98 95 95 5 3
1 000 40 40 90 88 90 88 10 13
1 250 40 40 90 95 88 93 10 5
表4 头孢噻肟钠和头孢曲松钠对小黑杨花粉植株叶片不定芽产生率的影响
Table 4 Effect of cefotaxime sodium and ceftriaxone sodium on the formation rate of adventitious buds
from leaves of Populus simonii×P. nigra pollen plantlets
抗生素浓度/ 外植体叶片数/ 片 愈伤组织诱导率/% 叶片不定芽产生率/% 愈伤组织褐化率/% mg·L-1 头孢噻肟钠 头孢曲松钠 头孢噻肟钠 头孢曲松钠 头孢噻肟钠 头孢曲松钠 头孢噻肟钠 头孢曲松钠
0 46 46 93 93 93 93 0 0
50 48 40 96 100 75 70 4 －
100 54 48 100 100 74 67 0 －
150 52 54 96 96 88 33 0 －
200 50 46 96 87 88 39 0 －
250 40 46 77 96 68 47 23 －
500 41 46 83 0 71 0 17 －
750 40 50 65 0 50 0 36 －
1 000 40 44 30 0 23 0 60 －
1 250 40 44 15 0 10 0 85 －
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3.0 mg·L-1 时，叶片不定芽产生率为 89%，略高
于未经 AgNO3 处理的对照组。这再次证明 AgNO3
不仅能有效地抑制农杆菌的生长[8,9]，而且对植物
叶片不定芽产生也有明显的促进作用[10]。我们根
据实验结果确定使用 AgNO3 作为小黑杨花粉植株
选择培养除菌剂的适宜浓度为3.0 mg·L-1。
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图1 不同头孢类抗生素对小黑杨花粉植株
叶片不定芽产生率的影响
Fig.1 Effects of different antibiotics on the formation
rate of adventitious buds from leaves of Populus
simonii×P. nigra pollen plantlets
表5 AgNO3对小黑杨花粉植株叶片不定芽产生率的影响
Table 5 Effect of AgNO3 on the formation rate of
adventitious buds from leaves of Populus
simoni i ×P. nigra pollen plantlets
浓度/mg·L-1
外植体叶 愈伤组织 叶片不定芽
片数/片 诱导率/% 产生率/%
0 59 97 84
1.0 46 96 87
1.5 46 96 70
2.0 52 96 85
2.5 68 94 76
3.0 56 96 89
明，AgNO3 浓度在 1.0 ~3.0 mg·L-1 范围内对小黑
杨花粉植株叶片不定芽产生率影响不大；浓度为