全 文 :71广东农业科学 2015年第 7期
收稿日期:2014-12-16
基金项目:广东省科技计划农业公关项目(2012A
020602038);广州市科技计划重点项目(11C32100704);广
东省中医药局科研项目(2010276)
作者简介:陈雪香(1981-),女,在读博士生,E-mail:
xuexiang811217@126.com
通讯作者:刘晓娟(1980-),女,博士,副教授,
E-mail:luxj@scau.edu.cn
山莓叶乙醇提取物与抗生素的
协同抑菌效果研究
陈雪香,刘晓娟,周丽萍,张瑞莲,杨 洋,曹 庸
(华南农业大学食品学院, 广东 广州 510642)
摘 要:采用K-B纸片法检测山莓叶乙醇提取物(RE)、抗生素对 3种致病菌(大肠杆菌、痢疾志贺氏菌、
沙门氏菌)的最低抑菌浓度(MIC),再将 RE与抗生素联合使用,用棋盘法与K-B 纸片法相结合进行抑菌效果
评价。结果显示:对于大肠杆菌、痢疾志贺氏菌、沙门氏菌,RE的MIC分别为 6.250、6.250、3.125 mg/mL;RE与
金霉素协同使用的分级抑菌浓度(FIC)最小值分别为 0.313、0.375 和 0.313,协同抑菌效果最好的配比分别为
1/8MIC1∶1/2MIC2、1/4MIC1∶1/2MIC2 和 1/8MIC1∶1/2MIC2;RE与净球散协同的 FIC 最小值分别为 0.375、0.313 和
0.375,协同抑菌效果最好的配比分别为1/4MIC1∶1/2MIC2、1/8MIC1∶1/2MIC2 和 1/4MIC1∶1/2MIC2。大肠杆菌、痢疾志
贺氏菌和沙门氏菌山莓叶乙醇提取物的浓度控制在1/4~1/8MIC1,金霉素和净球散浓度均为1/2MIC2,均有较强的
协同抑菌效果。
关键词:山莓叶;抑菌效果;抗生素;协同作用
中图分类号:S482.2+8 文献标识码:A 文章编号:1004-874X(2015)07-0071-06
Synergistic antimicrobial effects of ethanol extracts
of Rubus corchorifolius L.f leaves and antibiotics
CHEN Xue-xiang,LIU Xiao-juan,ZHOU Li-ping,ZHANG Rui-lian,YANG Yang,CAO Yong
(College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)
Abstract:The minimum inhibitory concentration(MIC)of RE and antibiotics on Escherichia coli,Shigella
dysenteroae,and Salmonella were measured by Kirby-Bauer text(K-B). Then Rubus corchori folius L.f leaves(RE) was
used to combine with antibiotics. Fractional inhibitory concentration(FIC) was measured by checkerboard microevolution
and K-B method. The results showed that E. coli,S. dysenteroae and Salmonella were used as microbial strains to test
the antibacterial activity,the MICs of RE were 6.250 mg/mL,6.250 mg/mL,3.125 mg/mL,respectively. The minimum
FICs of combined use of RE and aureomycin were 0.313,0.375,0.313,and the best ratios were 1/8MIC1∶1/2MIC2,
1/4MIC1∶1/2MIC2,1/8MIC1∶1/2MIC2,respectively. The minimum FICs of combined use of RE and Jingqiusan were 0.375,
0.313,0.375,and the best ratios were 1/4MIC1∶1/2MIC2,1/8MIC1∶1/2MIC2,1/4MIC1∶1/2MIC2,respectively. When the
concentration of RE was 1/4~1/8MIC1,and the concentrations of aureomycin and Jingqiusan were 1/2MIC2,the synergistic
antimicrobial effects on E. coli,S. dysenteroae and Salmonella were strong.
Key words:Rubus corchori folius L.f. leaves;antimicrobial activity;antibiotic;synergistic effect
抗生素的应用是长期以来治疗腹泻的主要措
施,并取得了良好的效果。但随着抗生素的大量使
用,尤其是不合理滥用,出现了病原菌抗药性增强、
畜禽产品药物残留增加等问题,从而间接危害人体
健康。因此,寻找高效、安全的抗生素替代品已成为
防治腹泻迫切需要解决的问题[1-3]。我国中草药种类
多,来源广泛,中草药来替代或部分替代抗生素成为
防治腹泻的新领域。山莓(Rubus corchori folius L.f)
DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2015.07.028
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是蔷薇科悬钩子属植物,在我国分布广泛,野生资源
蕴藏量相当大,并且作为药用植物在国内外已有很
长的历史,是湘西、鄂西北等地区少数民族长期用来
治疗腹泻的传统中草药[4]。山莓的根、茎、叶、果实
皆可入药,其中叶的抗腹泻效果最强[5]。山莓叶的抗
腹泻效果与山莓叶乙醇提取物的抑菌活性有很大关
系[6]。研究表明,山莓叶乙醇提取物对腹泻致病菌
(大肠杆菌、痢疾志贺氏菌、沙门氏菌等)均具有较
强的抑制作用,并具有良好的稳定性[7-8]。为此,我
们研究了山莓叶乙醇提取物与抗生素的协同抑菌效
果,寻找抑菌效果最佳的配比,从而为山莓叶作为抗
腹泻中草药的应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
山莓叶,采于湖南吉首大学张家界校区后山,经
廖博儒教授鉴定为蔷薇科悬钩子属植物山莓(Rubus
corchori folius L.f)。将采集的山莓叶自然阴干,粉碎,
过 0.180 mm 筛,备用。
大肠杆菌(Escherichia coli)、痢疾志贺氏菌
(Shigella dysenteroae)和沙门氏菌(Salmonella)均由
华南农业大学食品学院微生物室提供。
主要仪器:SW-CJ-1G型超净工作台(苏州净化
设备有限公司);HZS-H型水浴振荡器(哈尔滨东联
电子技术开发有限公司);U-3010 紫外可见分光光
度计(上海仪电分析仪器有限公司);LRH-250A型
恒温培养箱(广东省医疗器械厂);AL104 型电子天
平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司);移液枪
(芬兰百得公司);高压蒸汽灭菌锅(上海云泰仪器
仪表公司)。
主要试剂:金霉素和净球散均由康瑞德生物科
技有限公司提供,甲醇、卡那霉素、氯化钠、琼脂购
于广州化学试剂厂,胰蛋白胨和酵母提取物购于广
州环凯微生物科技有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 山莓叶乙醇提取物的制备 称取100 g 山莓叶
粗粉置于瓶中,用10 倍体积的 80%乙醇浸提 48 h,
倒出浸提液,重复浸提 2 次,合并浸提液并过滤,用
旋转蒸发仪于60℃、120 r/min 浓缩至原体积的1%,
冷冻干燥 72 h(-45℃,-30 Pa)得山莓叶乙醇提取
物[7]。
1.2.2 溶菌肉汤(LB)培养基的配制 将胰蛋白胨
(10 g)、酵母提取物(5 g)、氯化钠(10 g)、琼脂(15
g)和蒸馏水(1 L)混匀后,将 pH 值调至 7.0,灭菌
备用。
1.2.3 菌种的活化 在紫外杀菌过的超净工作台
中,将接种环在酒精灯上灼烧灭菌,在斜面培养基
上轻轻划取一环菌种,接种至已灭菌的液态LB培养
基中,将密封好的培养基置于37℃摇床中,振摇12 h
进行活化。
1.2.4 菌悬液的制备 以灭菌后的液态 LB培养基作
为空白对照,用紫外分光光度计在 620 nm 下测定
菌悬液的吸光值为 0.053,此时菌液浓度为1.5×106
CFU/mL。
1.2.5 最低抑菌浓度(MIC)的测定 用连续二倍稀
释法与K-B纸片法相结合[9]:将 6支离心管按顺序
编号,各加入甲醇 l mL,在第1管内加入12.5 mg/mL
的山莓叶乙醇提取物1 mL,混匀后吸取1 mL 到第 2
管,混匀再取 1 mL 到第 3 管,依次类推至第 6 管,
最后一管弃去1 mL。同时设一支1 mg/mL的卡那霉
素为阳性对照,在每支离心管中加入 4 片直径为 6
mm 的纸片,浸泡 2 h 后,烘干待用。然后配制固态
LB培养基,高压蒸汽灭菌后,倒好平板,待凝结后,
吸取 0.15 mL 的菌悬液在培养基表面,用涂布棒涂
布均匀。在每块平板内等距离放入 7 片滤纸,其中
6 片不同浓度的山莓叶乙醇提取物滤纸片,另1片
为阳性对照。将培养基置于 37℃培养箱培养 12 h,
观察纸片周围是否有透明的抑菌圈。如果有抑菌圈
产生(+),则表示该浓度下的山莓叶乙醇提取物有
抑菌作用,如果没有抑菌圈(-),则表示该浓度下
的山莓叶乙醇提取物没有抑菌作用。产生抑菌圈的
最小浓度则为山莓叶乙醇提取物对该细菌的MIC。
金霉素和净球散的MIC的测定方法与山莓叶提取物
相同。
1.2.6 分级抑菌浓度(FIC)的测定 用棋盘法与
K-B纸片法相结合:将山莓叶乙醇提取物和抗生素
配成 2 MIC的浓度,分别用连续二倍稀释法依次稀
释成 6个梯度(2 MIC、1 MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8
MIC、1/16 MIC)。取 36支离心管,按 6×6排列,首先
在第一行加入 2 MIC山莓叶乙醇提取物1 mL,第二
行加入1 MIC山莓叶乙醇提取物1 mL,依次类推;
然后在第一列加入 2 MIC 抗生素1 mL,第二列加入
1 MIC抗生素1 mL,依次类推。另设一支1 mg/mL 卡
那霉素作阳性对照。在每支离心管中加入 5片滤纸
片,浸泡 2 h,烘干待用。之后操作与MIC测定相同。
FIC指数的计算及结果判断[10]:
FIC 指数 =A 药联用MIC/A 药单用MIC+B药
联用MIC/B 药单用MIC
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当 FIC≤0.5时为协同作用,0.5< FIC≤1时为
部分协同或相加作用;1<FIC≤2时为无关作用;
FIC>2时为拮抗作用。
2 结果与分析
2.1 山莓叶乙醇提取物RE和抗生素MIC值的测定
为了评价 RE 与抗生素的协同抑菌效果,首先
对 RE和抗生素的MIC 值进行测定。采用连续二倍
稀释法与K-B纸片法相结合,有抑菌圈(+)产生的
最低浓度即为MIC。由表 1~表 3可知,对于大肠杆
菌、痢疾志贺氏菌、沙门氏菌,RE的 MIC 值分别为
6.250 、6.250 、3.125 mg/mL,金霉素的MIC 值分别
为 3.125 、1.563 、3.125 mg/mL,净球散的MIC 值分
别为 3.125 、6.250 、6.250 mg/mL。
表 1 山莓叶乙醇提取物的最低抑菌浓度(MIC)
供试菌种 山莓叶乙醇提取物浓度(mg/mL)12.500 6.250 3.125 1.563 0.781 0.391 阳性对照
大肠杆菌 + + - - - - +
痢疾志贺氏菌 + + - - - - +
沙门氏菌 + + + - - - +
注:“+”表示产生抑菌圈,“-”表示无抑菌圈。表 2~表 9同。
表 2 金霉素的最低抑菌浓度(MIC)
供试菌种 金霉素浓度(mg/mL)12.500 6.250 3.125 1.563 0.781 0.391 阳性对照
大肠杆菌 + + + - - - +
痢疾志贺氏菌 + + + + - - +
沙门氏菌 + + + - - - +
表 3 净球散的最低抑菌浓度(MIC)
供试菌种 净球散浓度(mg/mL)12.500 6.250 3.125 1.563 0.781 0.391 阳性对照
大肠杆菌 + + + - - - +
痢疾志贺氏菌 + + - - - - +
沙门氏菌 + + - - - - +
2.2 山莓叶乙醇提取物(RE)与抗生素协同作用的
FIC值测定
2.2.1 RE与金霉素的 FIC值测定 RE与金霉素对
大肠杆菌、痢疾志贺氏菌和沙门氏菌协同作用的FIC
值测定结果见表 4~表 6。由表 4可知,对于大肠杆
菌,RE浓度为1/2~1/8 MIC1、金霉素浓度为1/2 MIC2
时,FIC 值均小于或等于 0.5,说明在此浓度配比下,
两者具有协同抑菌效果。其中当 RE 的浓度为 1/8
MIC1,金霉素浓度为 1/2 MIC2 时,FIC 值最小,说明
此时RE与金霉素的协同抑菌效果最好,即RE与金
霉素协同使用对大肠杆菌的抑制效果最好的配比是
1/8 MIC1·1/2 MIC2。
由表 5 可知,对于痢疾志贺氏菌,RE 浓度为
1/2~1/4 MIC1、金霉素浓度为 1/2 MIC2 时,FIC 值均
小于或等于 0.5,说明在此浓度配比下,两者具有协
同抑菌效果。其中当RE的浓度为1/4 MIC1,金霉素
浓度为 1/2 MIC2 时,FIC 值最小,说明此时 RE 与
金霉素的协同抑菌效果最好,即 RE 与金霉素协同
使用对痢疾志贺氏菌的抑制效果最好的配比是 1/4
MIC1∶1/2 MIC2。
由表 6可知,对于沙门氏菌,RE 浓度为 1/2~1/8
MIC1、金霉素浓度为1/2 MIC2 时,FIC 值均小于或等
于 0.5,说明在此浓度配比下,两者具有协同抑菌效
果。其中当RE的浓度为1/8 MIC1,金霉素浓度为1/2
MIC2 时,FIC 值最小,说明此时 RE与金霉素的协同
抑菌效果最好,即RE与金霉素协同使用对沙门氏菌
的抑制效果最好的配比是1/8 MIC1∶1/2 MIC2。
从以上分析结果可以看出,山莓叶乙醇提取物
的浓度控制在1/4~1/8 MIC1,金霉素浓度为1/2 MIC2,
对于大肠杆菌、痢疾志贺氏菌和沙门氏菌,均有较好
74
的协同抑菌效果。
2.2.2 山莓叶乙醇提取物(RE)与净球散的 FIC值测
定 RE与净球散对大肠杆菌、痢疾志贺氏菌和沙门
氏菌协同作用的 FIC 值测定结果见表 7~表 9。由表
7可知,对于大肠杆菌,RE浓度为1/2 MIC1、净球散
浓度为1/4 MIC2 和 RE浓度为1/4 MIC1、净球散浓度
为 1/2 MIC2 时,FIC 值均为 0.375,说明在此浓度配
比下,两者均具有协同抑菌效果,其中前者RE所占
的比例大于后者,在协同效果相同的情况下,应优先
选择抗生素少的组合,因此 RE 与净球散协同使用
对大肠杆菌的抑制效果最好的配比是 1/2 MIC1·1/4
MIC2。
由表 8 可知,对于痢疾志贺氏菌,RE 浓度为
1/2~1/8 MIC1、净球散浓度为1/2 MIC2 时,FIC值均小
于或等于 0.5,说明在此浓度配比下,两者具有协同
抑菌效果。其中当RE的浓度为1/8 MIC1,净球散浓
度为1/2 MIC2 时,FIC 值最小,说明此时 RE与净球
散的协同抑菌效果最好,即RE与净球散协同使用对
痢疾志贺氏菌的抑制效果最好的配比是1/8 MIC1·1/2
MIC2。
由表 9可知,对于沙门氏菌,RE 浓度为 1/2~1/4
MIC1、净球散浓度为1/2 MIC2 时,FIC 值均小于或等
于 0.5,说明在此浓度配比下,两者具有协同抑菌效
果。其中当RE的浓度为1/4 MIC1,净球散浓度为1/2
MIC2 时,FIC 值最小,说明此时RE与净球散的协同
抑菌效果最好,即RE与净球散协同使用对沙门氏菌
的抑制效果最好的配比是1/4 MIC1·1/2 MIC2。
从以上分析结果可以看出,RE 的浓度控制在
1/4~1/8 MIC1,净球散浓度为 1/2 MIC2,对于大肠杆
菌、痢疾志贺氏菌和沙门氏菌,均有较好的协同抑菌
表 4 山莓叶乙醇提取物与金霉素对大肠杆菌的 FIC
浓度 2MIC2 1MIC2 1/2MIC2 1/4MIC2 1/8MIC2 1/16MIC2 FIC 值
2MIC1 + + + + + - 1.063
1MIC1 + + + + - - 0.625
1/2MIC1 + + + - - - 0.500
1/4MIC1 + + + - - - 0.375
1/8MIC1 + + + - - - 0.313
1/16MIC1 + - - - - - 1.031
注:山莓叶乙醇提取物对大肠杆菌MIC1为 6.250 mg/mL,金霉素对大肠杆菌MIC2 为 3.125 mg/mL。
表 5 山莓叶乙醇提取物与金霉素对痢疾志贺氏菌的 FIC
浓度 2MIC2 1MIC2 1/2MIC2 1/4MIC2 1/8MIC2 1/16MIC2 FIC 值
2MIC1 + + + + + - 1.063
1MIC1 + + + + - - 0.625
1/2MIC1 + + + - - - 0.500
1/4MIC1 + + + - - - 0.375
1/8MIC1 + + - - - - 0.563
1/16MIC1 + - - - - - 1.031
注:山莓叶乙醇提取物对痢疾志贺氏菌MIC1为 6.250 mg/mL,金霉素对痢疾志贺氏菌MIC2 为 1.563 mg/mL。
表 6 山莓叶乙醇提取物与金霉素对沙门氏菌的 FIC
浓度 2MIC2 1MIC2 1/2MIC2 1/4MIC2 1/8MIC2 1/16MIC2 FIC 值
2MIC1 + + + + + - 1.063
1MIC1 + + + + + - 0.563
1/2MIC1 + + + - - - 0.500
1/4MIC1 + + + - - - 0.375
1/8MIC1 + + + - - - 0.313
1/16MIC1 + + - - - - 0.531
注:山莓叶乙醇提取物对沙门氏菌MIC1为 3.125 mg/mL,金霉素对沙门氏菌MIC2 为 3.125 mg/mL。
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表 7 山莓叶乙醇提取物与净球散对大肠杆菌的 FIC
浓度 2MIC2 1MIC2 1/2MIC2 1/4MIC2 1/8MIC2 1/16MIC2 FIC 值
2MIC1 + + + + + - 1.063
1MIC1 + + + - - - 0.750
1/2MIC1 + + + + - - 0.375
1/4MIC1 + + + - - - 0.375
1/8MIC1 + + - - - - 0.563
1/16MIC1 + - - - - - 1.031
注:山莓叶乙醇提取物对大肠杆菌MIC1为 6.250 mg/mL,净球散对大肠杆菌MIC2 为 3.125 mg/mL。
表 8 山莓叶乙醇提取物与净球散对痢疾志贺氏菌的 FIC
浓度 2MIC2 1MIC2 1/2MIC2 1/4MIC2 1/8MIC2 1/16MIC2 FIC 值
2MIC1 + + + + + - 1.063
1MIC1 + + + + + - 0.563
1/2MIC1 + + + - - - 0.500
1/4MIC1 + + + - - - 0.375
1/8MIC1 + + + - - - 0.313
1/16MIC1 + + - - - - 0.531
注:山莓叶乙醇提取物对痢疾志贺氏菌MIC1为 6.250 mg/mL,净球散对痢疾志贺氏菌MIC2 为 6.250 mg/mL。
表 9 山莓叶乙醇提取物与净球散对沙门氏菌的 FIC
浓度 2MIC2 1MIC2 1/2MIC2 1/4MIC2 1/8MIC2 1/16MIC2 FIC 值
2MIC1 + + + + + - 1.063
1MIC1 + + - - - - 1.000
1/2MIC1 + + + - - - 0.500
1/4MIC1 + + + - - - 0.375
1/8MIC1 + + - - - - 0.563
1/16MIC1 + - - - - - 1.031
注:山莓叶乙醇提取物对沙门氏菌MIC1为 3.125 mg/mL,净球散对沙门氏菌MIC2 为 6.250 mg/mL。
效果。
3 结论与讨论
近年来,国内外学者一直致力于寻找防治腹泻
的抗生素替代品,如植物提取物、酶制剂、酸化剂、
微生态制剂、抗菌肽等。天然植物提取物由于具有非
特异性抗菌作用、无有害残留、病源微生物不易产生
耐药性、资源丰富等优点,成为最有潜力的替代抗生
素的抗腹泻药物,不过完全取代抗生素往往比部分
替代抗生素效果要差一些,因此植物提取物与抗生
素联合使用的效果是目前亟需解决的问题[11]。山莓
叶乙醇提取物中含有有机酸、糖类、黄酮、甙类、鞣
质、酚类、强心甙、香豆素、甾体、萜类等物质,其中
抑菌活性较强的是黄酮类、三萜类及挥发油[12-13]。
扫描电镜下观察,山莓叶乙醇提取物主要抑制了大
肠杆菌对数生长期的菌体分裂,菌体缩短,菌体表
面粗糙,部分出现缢痕,或在缢痕处发生断裂或缢
缩。SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明,加入山莓
叶乙醇提取物后大肠杆菌有两条蛋白带没有出现,
从而表明大肠杆菌中的某些蛋白质受到破坏[12]。
山莓叶中分离出三萜化合物 2α、3β、23α- 三羟
基 -12- 烯 -28- 乌苏酸具有很强的抑菌活性,其最
低抑菌浓度为 256 μg/mL,作用大肠杆菌 4.5 h 后
其菌体表面粗糙、皱缩,其生长和分裂明显受到抑
制[13]。
大肠杆菌、痢疾志贺氏菌、沙门氏菌是引起腹
泻的主要致病菌,畜禽或人体感染这些病菌导致腹
泻,成为引发腹泻的主要因素。金霉素和净球散是
畜禽养殖抗腹泻常用抗生素。金霉素加入饲料的作
用是防病促生长,虽然现有文献对其促生长的机理
76
还不明确,但大多数认为其对调节肠道菌群有关。
金霉素能显著降低 21 d 前肉鸡小肠和盲肠中的大
肠杆菌数,但到 42 d 时均未见明显变化[14],从而说
明金霉素能抑制肠道大肠杆菌的繁殖,但随着饲喂
时间的延长,细菌逐渐产生了耐药性。净球散是一
种防治鸡球虫病的药物,其配方根据生产厂家的不
同略有不同。其中王新等用十几种中草药配制成净
球散,添加进饲料中喂养雏鸡,发现净球散可以通
过杀虫止痢,减少肠道出血,能有效的防治鸡球虫
病[15]。本试验结果表明,山莓叶提取物的浓度控制
在1/4~1/8MIC1,金霉素和净球散浓度均为1/2MIC2,
均有较强的协同抑菌效果,从而表明山莓叶可在一
定程度上替代抗生素,且与抗生素能够起到协同抑
菌效果,这将对山莓叶在抗腹泻方面的应用具有重
要指导作用,山莓叶与抗生素的协同抑菌作用机理
还需进一步研究。
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(责任编辑 杨贤智)