全 文 ：植物生理学通讯 第41卷 第4期，2005年8月 449
影响农杆菌介导狗牙根遗传转化的因素
张振霞*
韩山师范学院生物系，广东潮州521041
提要 农杆菌 LBA4404/pCAMBIA1301 介导转化狗牙根的体系中，遗传转化的最佳优化条件是：胚性愈伤组织预培养
10 d，农杆菌菌液浓度为 OD600 0.5~0.8 ，共培养时间为 2 d。共培养基中添加 100 mmol·L-1 乙酰丁香酮能有效地提高植物
瞬时表达率。侵染处理方法中滤纸滴加法比浸泡法效果更好。黑暗条件下的瞬时表达率比 12 h 光照 /12 h 黑暗培养条件
下的高。在最佳优化条件下狗牙根的 GUS 瞬时表达率达到 36.36%。
关键词 狗牙根；农杆菌介导转化；GUS 基因；影响因子
Factors Influencing Agrobacterium-mediated Transformation of Cynodon
dactylon (L.) Pers.
ZHANG Zhen-Xia*
Department of Biology, Hanshan Normal College, Chaozhou, Gongdong 521041, China
Abstract Agrobacterium tumefaciens mediated transformation system of Cynodon dactylon (L.) Pers. was
studied by using GUS gene transient expression method. Mature seed derived callus from C. dactylon was
transformed by GUS gene containing A. tumefaciens LBA4404/pCAMBIA1301. Frequency of the transforma-
tion was detected, and the optimal conditions for C. dactylon genetic transformation were determined. In this
system, it was found that the optimal conditions to get higher transformation efficiency were co-cultivation
with OD600 0.5–0.8 A. tumefaciens solution for 2 d under dark after pre-culture for 10 d. The transformation
frequency was significantly improved by adding 100 mmol·L-1 acetosyingone into co-cultivation medium. Add-
ing A. tumefaciens solution on surface of filter paper was found to be a better infecting method of A. tumefaciens
rather than suspending in A. tumefaciens solution. The transformation efficiency in dark condition to cocultivation
was higher than that of 12/12-h photoperiod. Under these optimal conditions, the rate of transient expression of
GUS gene in C. dactylon was 36.36%.
Key words Cynodon dactylon (L.) Pers.; Agrobacterium-mediated transformation; GUS gene; factor
收稿 2005-02-28 修定 　 2005-07-12
资助　 国家转基因植物研究与产业化专项(J2002-B-006)。
*E-mail: zzx8411@163.com，Tel: 0768-3849061
在狗牙根[(Cynodon dactylon (L.) Pers.)]的转
基因研究中，Li和 Qu[1]及 Zhang等[2]曾用基因枪
方法对狗牙根进行过遗传转化，而以农杆菌介导
遗传转化狗牙根的研究还未见报道。为此，本文
就狗牙根的农杆菌遗传转化进行了探索，旨在建
立一种稳定而有效的转基因技术体系，为采用此
方法培育狗牙根优良品种(系)奠定基础。
材料与方法
试验材料为狗牙根[(Cynodon dactylon (L.)
Pers.)]草种子，由Clover公司提供。制备转化受
体时，将成熟的狗牙根种子用20% NaClO浸泡 60
min，用无菌水冲洗 3~4 次，接种在植物培养基
上；待长出愈伤后，进行继代培养；每 3 ~ 4 周
继代 1 次，直到形成大量结构致密、颗粒状、黄
白色的胚性愈伤组织。根癌农杆菌(Agrobacterium
tumefaciens)菌株 LBA4404/pCAMBIA1301 由大
连理工大学安利佳先生提供。载体 pCAMBIA1301
的 T-DNA 区含有潮霉素抗性基因(HYG)和 b- 葡萄
糖苷酸酶基因(GUS)，在 GUS 基因编码区内有一
内含子，GUS 基因只能在植物中而不能在细菌中
表达(图 1)。
培养基有：(1)植物培养基：MS 基本培养基+
5 mg·L-1 2,4-D+0.05 mg·L-1 6-BA+2 mg·L-1 ABA+30
g·L-1蔗糖+4 g·L-1 植物凝胶(phytegal)，pH 5.8；
(2)农杆菌培养基：5 g·L-1胰蛋白胨+5 g·L-1牛肉
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浸膏+1 g·L-1酵母提取物+0.493 g·L-1 MgSO4·7H2O+
5 g·L-1 蔗糖，pH 7.0。
培养农杆菌和植物转化时，挑取 -70℃保存
的农杆菌转化子在 YEB 培养基上划线，28℃下暗
培养；挑取单菌落于YEB液体培养基里，于28℃、
200 r·min-1摇床振荡培养。于波长600 nm处用分
光光度计测定农杆菌菌液紫外吸收值OD600 为 0.8
时，将菌液按 1/50 稀释后进行 2 次培养。菌液
OD600 值达到 0.5~0.6 时，按 1/20 稀释接种至MS
液体培养基(不添加激素)，经培养后测得OD600值
0.5~0.6 时直接用于转化。转化材料浸没于菌液
中，28℃下 100 r·min-1 振荡 20 min，再静置10
min。后将转化材料放在无菌滤纸上吹干，转移
到共培养基上，于25℃下共培养后，进行GUS 组
织化学染色以检测 GUS 基因瞬间表达，并计算瞬
间表达率。按GUS阳性发生率(%)=(目测到有GUS
斑点的外植体数/检测的外植体数)×100 计算。
经与农杆菌共培养后的愈伤组织中 GUS 基因
的瞬间表达按Jefferson[3]的组织化学染色法进行染
色。取植物组织置于1.5 mL离心管中，加入1 mL
GUS 缓冲液浸没组织块，再加入 5%(V/V)用量的
GUS 染色液，混匀后于 37℃下保温 16~24 h，用
70% 乙醇固定后，取出组织置于解剖镜下观察染
色结果(图 2)。
共培养时间长短对狗牙根转化率的影响实验
设置1、2、3、4 d 等 4 个处理。在转化过程中，
通过添加和不添加 100 mm o l ·L- 1 乙酰丁香酮
(acetosyingone，AS)处理，测定AS对狗牙根愈
伤转化率的影响。比较 2 种侵染方式的转化率：
一种是菌液直接浸染愈伤；另一种是培养基上铺
1 层无菌滤纸，愈伤转至滤纸上，然后将菌液滴
加到愈伤。将狗牙根胚性愈伤组织转置于高渗培
养基(植物培养基+30 mg·L-1 甘露醇)中，预培养
10 d后进行农杆菌转化，观察预培养对转化效率
的影响。在农杆菌菌液浓度对转化效率的影响实
验中，设置OD600 0.5、0.8、1.0 和 1.5 的 4个处
理；共培养时的不同光照条件影响狗牙根转化率
的实验中，采用全黑暗和12 h光照/12 h黑暗两
种培养条件。每个实验重复 3 次，所得数据用
SAS8.0 软件作差异显著性检测。
图2 pCAMBIA1301 转化狗牙根检测 GUS 瞬时表达
Fig.2 Transient expression of pCAMBIA1301/GUS in calli transformation of C. dactylon
图 1 pCAMBIA1301 质粒的 T-DNA 区域
Fig.1 T-DNA segment of vector pCAMBIA1301
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结果与讨论
1 共培养时间的影响
农杆菌和外植体的共培养在整个转化过程中
是非常重要的环节，T-DNA 的转移及整合都在共
培时间内完成。共培养时间对转化频率有很大的
影响，而且不同的植物最佳共培养时间不同[4]。
狗牙根与农杆菌分别共培养 1、2、3、4 d 后的
瞬间转化率见表1。转化受体与农杆菌共培养1 d
后的 GUS 基因瞬间表达率较低，2 d 后显著提高，
3 d后显著降低，这可能是继续延长共培养时间之
果。细菌生长过度抑制了植物细胞生长，导致转
化受体的瞬间表达率下降。
2 AS的影响
从表2可见，添加AS可提高狗牙根转化受体
的转化率，差异显著。植物和农杆菌相互作用的
基础是细菌具有趋化性，即细菌对植物细胞所释
放的化学物质产生趋化反应。AS已经证明是诱导
效果最好的酚类化合物[5]。在水稻转化中添加100
µmol·L-1 的 AS可大大提高转化效率[6]。但在某些
植物的转化上，AS 的使用则是无效甚至有害[7]。
AS 诱导并不是农杆菌介导转化所必需的，但可提
高一般植物的转化效率[8]。我们在农杆菌浸染液
和共培养基中都加入了100 µmol 的 AS 后，狗牙
根的GUS瞬时表达率比未处理的高39.92%，转化
效果较好。
3 预培养的影响
黄益洪等[9]认为预培养10~15 d的幼胚愈伤组
织具有较高的瞬时表达率和再生能力，是较好的
转化受体。预培养可以减轻伤害胁迫，调整细胞
状态，还可能减少伤害胁迫而有利于农杆菌感
染[10]。同时，添加 30 mg·L-1 甘露醇的高渗处理
还可以使细胞失水形成内高外低的渗透压梯度，
有利于植物细胞在极短时间内吸收其周围的农杆
菌，对转化有利[11]。我们在实验过程中发现，不
加甘露醇引起的低渗作用对愈伤组织的细胞膜可能
会造成一定的伤害，而且过度吸水后的愈伤组织
转到有一定渗透压的筛选培养基上后，往往又会
发生一定程度的脱水作用，引起愈伤组织表面出
现水泡状，而不利于其生长。我们观察到，在
农杆菌浸染前，培养10个月左右的愈伤组织进行
10 d预培养可以明显改善愈伤组织的转化状态和提
高转化率(表3); 预培养后狗牙根的GUS瞬时表达
率比未经过预培养的高 56.36%。
4 农杆菌菌液浓度的影响
如表4所示，农杆菌菌液浓度在OD600 0.5和
0.8 时 GUS 瞬时转化率最高，且差异不显著，都
在30% 左右；OD600 1.0 时显著降低，而OD600 1.5
时下降更低。很多实验表明，农杆菌液的浓度、
农杆菌细胞的生长状态也是转化成功的关键因
素[12,13]。如果农杆菌菌液浓度过高，菌体本身易
相互聚结，而影响其在外植体上的附着；浓度过
低时，不利于基因的转入[14]。但是使用高浓度的
农杆菌时还可能存在以下问题：一是共培养后农
杆菌难以被有效抑制，导致转化失败；二是筛选
培养基中加入抑制农杆菌的抗生素量要大大增加，
而且控菌效果难以把握。本文中，农杆菌菌液浓
度在OD600 0.5和0.8时的GUS瞬时转化率都在30%
表1 共培养时间对狗牙根愈伤组织转化瞬间表达率的影响
Table 1 Effect of co-culture time on transient expression
in calli transformation of C. dactylon
共培养 转化愈伤 瞬间表达愈伤 瞬间转
时间/d 组织数/个 组织数/个 化率/%*
1 53 9 16.98c
2 53 17 32.07a
3 59 12 20.34b
4 27 6 22.22b
　　* LSD 检验同品种内不同小写字母表示共培养时间处理间差
异显著(P<0.05)。表 2~6 同此。
表2 AS对狗牙根愈伤组织转化瞬间表达率的影响
Table 2 Effect of AS on efficiency of GUS transient
expression in calli transformation of C. dactylon
处理 转化愈伤 瞬间表达愈伤 瞬间转 组织数/个 组织数/个 化率/%
不加 AS 48 11 22.92b
加 A S 53 17 32.07a
表3 预培养对狗牙根愈伤组织转化瞬间表达率的影响
Table 3 Effect of pre-culture on efficiency of transient
expression of GUS in calli transformation of C. dactylon
处理 转化愈伤 瞬间表达愈伤 瞬间转 组织数/个 组织数/个 化率/%
未经预培养 39 8 20.51b
预培养 53 17 32.07a
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左右，差异不明显，其效果最佳；随着菌液浓
度的增加，瞬时转化率不断下降，到OD600 1.5时
GUS 瞬时表达率只有 12.46%。
5 共培养时光照条件的影响
表5显示，共培养 2 d 时，全黑暗培养下的
愈伤组织转化率为32.07%，比12 h光照/12 h黑
暗培养条件下的高 38.65%；共培养 3 d 时，二
者的差异不明显，都为 20%。这说明黑暗条件下
共培养2 d的农杆菌对植物受体浸染的效果最好，
原因可能是在黑暗条件下农杆菌对植物受体的浸染
更容易些。
6 不同侵染方法的影响
如表6 所示，铺滤纸滴加法的 GUS 瞬时表达
率明显高于浸泡法，共培养 2和 3 d 的 GUS 阳性
瞬时表达率分别增加 13.38% 和 53.64%。滤纸的
存在不影响农杆菌对植物受体的转化，还可同时
防止农杆菌在共培养过程中的大量增殖。
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表4 农杆菌浓度对狗牙根愈伤组织转化瞬间表达率的影响
Table 4 Effect of concentration of A. tumefaciens on
efficiency of transient expression of GUS in
calli transformation of C. dactylon
农杆菌菌液 转化愈伤 瞬间表达愈伤 瞬间转
浓度(OD600) 组织数/个 组织数/个 化率/%
0.5 53 17 32.07a
0.8 47 15 31.91a
1.0 48 11 22.92b
1.5 49 6 12.46c
表5 光照条件对狗牙根愈伤组织转化瞬间表达率的影响
Table 5 Effect of light period on efficiency of transient
expression of GUS in calli transformation of C. dactylon
共培养 共培养 转化愈伤 瞬间表达愈伤 瞬间转
时间/d 光条件 组织数/个 组织数/个　　 化率/%
2 光照 26 6 23.08b
黑暗 53 17 32.07a
3 光照 30 6 20.00b
黑暗 59 12 20.34b
表6 不同转化方法对狗牙根愈伤转化瞬间表达率的影响
Table 6 Effect of different transformation methods with A.
tumefaciens on GUS transient expression in calli
transformation of C. dactylon
共培养 方法 转化愈伤 瞬间表达愈伤 瞬间转 时间/d 　　　 组织数/个 组织数/个 　 化率/%
2 浸泡法 53 17 32.07b
滤纸滴加法 33 12 36.36a
3 浸泡法 59 12 20.34c
滤纸滴加法 32 10 31.25b