全 文 ：笋 ;
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卷 第 2期
2N 3o
.
2
植 物 研 究
T U LL B E】N O F BON T I A A CL R ESH A R E C
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年 4月
2《洲 ) 3
杂种落叶松扦插生根过程中可溶性蛋白的比较分析 ’
刘桂丰 , 庄振东“ 由香铃 ` 姜 静
( 1
. 东北林业大学 , 哈尔滨 l 50( 科0 )
( 2
. 内蒙古兴安盟五岔沟林业局 ,五岔沟 13 7 803 )
摘 要 杂种落叶松 (长 白落叶松 x 日本 落叶松 ) (切 ixr 。妙二 is x 加心 几。 e n lfeP ir )插穗在生根
过程中 , 可溶性蛋白的 SD S 一 PA G E 图谱分析推刚 : 24 K D 、 26 K D 和 39 KD 蛋白 , 与根原基的发
生 、 分化有关 ; 28 K D 蛋白具有促进根原基继续发育长 出不定根的作用 ; 47 K D 蛋白队遏根原基
的发生或抑制不 定根的生长 。
关键词 杂种落叶松 ;扦插 ;可溶性蛋白
T H E S O L U B L E P R O T E IN A N A L Y S I S O F H Y B R I D
L A R C H D U R I N G C U T T IN G R O O T I N G S
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( 1
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( 2
.
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e s o l u b le p or t e i n s o f h y b r id l a cr h (玩瓜 o lxe o is x 玩 ixr k a e n 1feP ir ) d u ir n g e u t ti n g or -
o ti n gs w e er an
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r t h a t ht er e k i n d o f p or t e in s ( 2 4 K D
,
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u m o r ht e g or w ht of a d v e n t i t io u s or
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.
K ey wo
r ds h yb ir d l a cr h ; e u t ti n g ; so l u b l e p or te i n s
20 世纪 50 年代英国最先开始了落叶松的扦
插繁殖研究 。 到目前为止 , 研究者们主要从插穗
的母树年龄 、插穗采集的冠位 、扦插基质 、外源激
素处理 、内源激素含量 、生根过程的组织切片等方
面开展了研究 ,并取得了很大的成就 〔’ 〕 。 有资料
显示 , 19 9 4 年欧洲许多国家杂种落叶松扦插苗的
生产已形成相当大的规模 , 英国杂种落叶松扦插
苗年产量 10 万株 , 比利时 9 万株 ,加拿大和德国
也有一定量的扦插苗应用于生产【’ 」。 但插穗生
根机理 ,基因调控这一发育过程的文章仍未见报 。
本文试图从杂种落叶松 (长白落叶松 x 日本落叶
松 )生根过程中可溶性蛋白的变化 ,探讨插穗生
根的分子机理 。
1 材料与方法
1
.
1 材料
试验于 19 9 9 年 7 月 16 日 一 9 月 2 0 日在东北
· 第一作者简介 :刘桂丰 ( 19 60 一 ) , 男 ,教授 ,主要从事林木遗传育种工作 。
收稿日期 : 2X() 2 一 04 一 29
植 物 研 究 3 2卷
林业大学帽儿山实验林场进行 。 从 7年生杂种落 多肤分子量用与样品共电泳的标准蛋白质确定
叶松 (长白落叶松 x 日本落叶松 )实生苗的采穗 之 ,所用标准蛋白质的分子量分别是 :兔磷酸化酶
圃内选取 9 株母树采穗 ,组成 9 个无性系 。 扦插 B( R a b bi t p ho sP ho 班as e b , 97 . 4KD ) , 牛血清白蛋
时采用完全随机区组试验设计 ,每小区 10 株 ,重 白 ( B vo in e se ur m 砒~
, “ . ZKD ) ,兔肌动蛋白
复 4 次 。 自扦插开始 ,每隔 7 一 l o d 取样一次 ,每 ( Rab b i t ac ti o n , 4 3K D ) , 牛碳酸配酶 ( B o v in e e ~ar
个无性系取材 10 个插穗 ,切取穗条基部 0 . sc m bon ic an h y d ar se , l3 K D ) , 胰蛋白酶抑制剂 (物p -
长 , 混合后放人 一 2 0℃ 冰箱保存 。 9 月 2 0 日统计 s i n i n h ib i ot r , 2 0 . I KD ) , 鸡蛋清溶菌酶 ( H e n e邵
余下的 9 个无性系的扦插生根率 。 ’ w hit 。 ly se yz m e , 14 . 4 K D ) 。 用 u v P 凝胶成像系统
1
.
2 SDS 聚丙烯酞胺凝胶电泳 ( SDS 一 PA G E ) G D 7S 60() ( G e l D o e u m e n ta 6 o n S y s t e m s )照像 。
1
.
2
.
1 可溶性蛋白的提取及浓度测定
参照谷瑞升等图的方法提取可溶性蛋白 , 采 2 结果与分析
用考马斯亮蓝 G 一 250 染色法测定其浓度 [’] 。
1
.
2
.
2 S D S 一 P AG E 2
.
1 杂种落叶松各无性系的扦插生根率比较
采用垂直板 s D s 一 聚丙烯酞胺凝胶电泳 5j[ , 9 月 20 日 ,对 9 个无性系余下的穗条生根情
浓缩胶 T 二 5% , C 二 3% , 分离胶 T = 12 % , C = 况进行统计 , 1 号无性系生根率最高 , 2 号 、 3 号和
3%
。 各样品上样量为 40 泌 ( 2卜岁卜L ) , 电压 13 0 4 号无性系次之 , 5 、 6 、 7 、 8 号无性系生根率较低 , 9
一 13 5V
, 电泳时间为 4 . s h 左右 ,直到澳酚蓝到达 号无性系生根率为零 (表 1 ) 。
分离胶底部后停止电泳 , 考马斯亮蓝染色 。 蛋白
表 1 7 年生杂种落叶松稚条扦插生根率比较
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插穗生根率 (% ) 无性系 cl on e
c u t t in g树 i n g 扭 t e 1 2 3 4 5 6 7 8 9高 iH hg
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3 1 3 4 3 7
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.
3 2
.
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.
4 2 9
2
.
2 杂种落叶松扦插生根过程中可溶性蛋白图
谱的变化
本实验分别对杂种落叶松插穗生根率高 、 中
和没有生根的 3 个无性系即 : 1 号 、 3 号和 9 号无
性系扦插生根过程中可溶性蛋白图谱进行比较分
析 。
1号无性系生根率最高 , 可溶性蛋白的 SD S
一
PA GE 图谱揭示了从扦插开始到不定根长出过
程中可溶性蛋白的变化 ( 图 1 ) , 在生根过程中清
晰的蛋白谱带有 5 条 , 即 : 24 K D 、 26 KD 、 2 8 KD 、
3 9 K D
、
4 7 K D
。 从扦插开始直到第 13 d , 都能清楚
的看到 2 4 KD 、 2 6 K D 、 3 9 K D 蛋白谱带 ,随后 2 4 K D 、
39 K D 消失或谱带减弱 , 26 K D 在扦插第 5 d9 又清
晰显示直到生根结束 。 扦插第 1 3 d 时 , 出现了
2 8K D 蛋白谱带 ,直到生根结束 。 47 K D 是在扦插
第 59 d 显示的蛋白谱带 。
3 号无性系插穗生根率次于 1 号无性系 , 生
根过程中可溶性蛋 S D S 一 P AG E 电泳谱带变化与
l 号无性系的基本相同 (见图 2 ) , 在生根过程中
清晰的蛋 白谱带有 5 种 , 即 :抖 K D 、 2 6 K D 、 Zs K D 、
3 3 KD
、
3 9 K D
。 其中拼 K D 、 2 6 K D 和 3 9 K D 蛋白谱
带与 1 号无性系的变化完全一样 , 与 1 号无性系
蛋白谱带不同的是 : 28 K D 蛋白表达比 1 号无性系
晚十几天出现 ; 47 K D 蛋白谱带明显弱于 1 号无
性系 ;最明显的差别是 3 号无性系扦插 13 d 的后
出现了 3 KD 的电泳谱带 ,该条带可能是不同无
性系间差异的结果 。
9 号无性系插穗在生根过程中 , 虽然插穗初
期产生了大量的愈伤组织 ,但没有产生不定根 , 生
根率为 0 ,其可溶性蛋 S DS 一 PA G E 电泳图谱只有
2 6 K D
、
2 8 K D 和 4 7 KD 三种条带清晰 , 4 7 K D 条带
在扦插第 3 7 d 清晰可见 , 与 1 号 、 3 号无性系的
S DS 一 PA G E 图谱差异明显 (见图 3 ) 。
刘桂丰等对长白落叶松嫩枝扦插生根过程的
解剖观察表明 :扦插后 巧 d 左右插穗切 口产生愈
伤组织 ,在愈伤组织形成的过程中分化出不定根
原基 , 由不定根原基再继续发育长出不定根61[ 。
因此 ,根原基的发生是形成不定根的必要条件 。
2 期 刘桂丰等 :杂种落叶松扦插生根过程中可溶性蛋白的比较分析 1 97
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图 1 1 号无性系插穗生根各时期可溶性
蛋白的 SD S一P A G E 图谱
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M 表示标准蛋白质 M ark e r 所在的泳道 ;标有数字的泳道表示扦
插的天数 , 1 . l d ; 2 . 6 d ; 3 . 13 d ; 4 . 2 0 d ; 5 . 2 6 d ; 6 . 37 d : 7 . 4 d ; 8 .
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.
5 9 d ; 10
.
6 6 d
。 另 , 为了便于分析比较 , 左边一排 M a ke r
是中间一排 M o ke r 的拷贝。
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.
2 6 d : 6
.
37 d : 7
.
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.
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.
5 9 d ; 10
.
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.
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图 2 3 号无性系插穗生根各时期可溶性
蛋白的 S D S一 P AGE 图谱
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M 表示标准蛋白质 Mar ker 所在的泳道 ;标有数字的泳道表示扦
插的天数 , 1 . 6 d ; 2 . 13 d ; 3 . 2 0 d ; 4 . 2 6 d ; 5 . 37 d ; 6 . 4 d ; 7 . s l d ; 8 .
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.
6 d
。 另 ,为了便于分析比较 ,左边一排 Mak e r 是中间一
排 M ak er 的拷贝 。
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n u m b e r i n d i e a t e th e ti m e ofr m
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.
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.
综合上述 3 个无性系插穗在生根过程中可溶
性蛋 S D S 一 P AG E 图谱 , 结果表明 : 1 号和 3 号无
性系扦插开始出现的 2 4 K D 、 2 6 K D 和 3 9 K D 蛋白 ,
可能对根原基的发生 、 分化至关重要 , 而扦插第
图 3 9 号无性系插穗生根各时期
可溶性蛋白的 S DS一P A C E 图谱
F ig
.
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M 表示标准蛋白质 M akr er 所在的泳道 ;标有数字的泳道表示扦
插的天数 , 1 . 6 d ; 2 . 13 d : 3 . 2 0 d ; 4 . 2 6 d ; 5 . 37 d ; 6 . 4 d ; 7 . s l d : 8 .
5 9 d ; 9
.
6 6 d
。 另 , 为了便于分析比较 , 左边一排 M a k e r 是中间一
排 M a k e : 的拷贝 。
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.
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. 肠d . In ad di t ion , ofr t h e e o n v en i e n e e of
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om p面 s o n , t he m iddl e lan e o f p烈 e in m ark ers 15 t h e s帅 e Of t he left .
13 d 后出现的 28 K D 蛋白可能具有促进根原基继
续发育长 出不定根的作用 , 扦插第 59 d 出现的
47 K D 蛋白其作用可能与之相反 , 阻遏根原基的
发生或抑制不定根的生长 ,此时 ,插穗生根已经完
成 。
没有生根的 9 号无性系 , 扦插早期 24 K D 、
2 6 KD 和 39 K D 蛋白谱带微弱 ,这些低量表达的蛋
白不能促进根原基的形成 , 同时扦插的第 3 7 d 就
出现了对根原基的发生 、分化起抑制作用的 47 KD
蛋白谱带 ,使 9 号无性系不能生根 。
参 考 文 献
1
. 杨书文 , 王秋玉 , 夏德安 . 落叶松的遗传改良 . 哈尔滨 :
东北林业大学出版社 , 1994 . 2 54 一 27 9
2
. 马常耕 ,世界松类无性系林业发展策略和现状 . 世界林
业研究 , 1994 , 7 ( 2 ) : 11 一 18
3
. 谷瑞升 , 刘群录 , 陈雪梅 ,等 . 木本植物蛋 白质提取和
SD S 一 P A G E 分析方法的比较和优化 . 植物学报 , 19 9 ,
16 ( 2 )
: 17 1
一 1 7 7
4
. 彭秀铃 . 基因工程实验技术 . 长沙 :湖南科学技术出版
社 , 1 998 . 2 6 1 一 2 65
5
. 卢圣栋 . 现代分子生物学实验技术 . 北京 : 中国协和医
科大学出版社 , 199 9 . 382 一 384
6
. 刘桂丰 ,杨书文 ,杨春华 ,等 . 长白落叶松嫩枝扦插生根
的解剖研究 . 东北林业大学学报 , ] 9咒 , 20 ( 1 ) : 9 一 13