全 文 ：第 23 卷　第 1 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2003年　1 月
Vol.23　No.1　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH Jan., 　2003
黑曲霉及其多糖组分诱导红豆杉叶子产生抗病反应之比较
李默怡 余龙江 陈 超　兰文智
(华中科技大学生命科学技术学院 , 武汉 430074)
摘　要　用一种从中国红豆杉树皮内分离得到的黑曲霉及其酸解物多糖组分处理离体红豆杉叶
子 ,发现经过两种不同处理的叶子干重和叶绿素含量均比对照下降 ,而丙二醛含量上升 ,但黑曲霉
处理的呈现更为明显的趋势。说明多糖和黑曲霉孢子对叶片均有损伤 ,但多糖造成的损伤较小 。
多糖组分处理提高酚类物质和可溶性蛋白的含量并激活过氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶的活性 ,而
黑曲霉却导致了相反的现象 ,因此认为多糖组分具有诱导红豆杉叶子产生抗病反应的能力 ,而黑
曲霉却具有致病性。
关键词　红豆杉;黑曲霉;抗病反应
DIFFERENT EFFECTSOF ASPERGILLUS NIGER AND ITS
POLYSCCHARIDES ON ELICITING DISEASE RESPONSES
OF TAXUS CHINENESIS LEAVES
LI Mo-Yi　YU Long-Jiang　CHENG Chao　LAN Wen-Zhi
(School of Life Science and Technology , Huazhong University of Science and Technology , Wuhan 430074)
Abstract　A fungus Aspergi llus niger st rain isolated from the inner bark of Taxus chinensis and its
hydrolyzed product polysaccharides were used to t reat Taxus chinensis leaves.Both t reatments de-
creased the dry weight and chlorophyll content of the leaves meanwhile increased malondialdehyde
(MDA)content compared w ith the control , and fungi led to more distinguishable outcome than
polysaccharides did , indicating that both fungus and fungal polysaccharides destroyed leaves w hile the
lat ter had less damaging ef fects.Furthermo re , Polysaccharides could notably increase content of pro-
tein and phenolics , evoke activity of pero xidase and pheny lalanine ammonia-ly ase , whereas the fun-
gus had the contrary effects.Thus , i t demonst rated that poly saccharides have inducing effects on de-
fense reaction of Taxus chinensis while the fungus st rain i tself does not.
Key words　Taxus chinensis;Aspergil lus niger;disease response
　　植物的抗病性是指植物避免 、中止或阻滞病原
物侵入与扩展 ,减轻发病和损失程度的一类特性 。
抗病性是植物与其病原生物在长期的协同进化中
相互适应 、相互选择的结果 ,病原物发展出不同类
别 、不同程度的寄生性和致病性 ,植物也相应地形
成了不同类别 、不同程度的抗病性[ 1] 。过敏性细
胞死亡(hypersensitive cell death)是植物产生抗病
反应的重要特征 ,该现象表现为受侵细胞及其邻近
细胞迅速死亡 ,病原物受到遏制或被杀死 ,或被封
第一作者简介:李默怡(1978-),女 ,硕士 ,主要从事植物次生代谢途径分子生物学研究。
收稿日期:2002-10-16
锁在枯死组织中[ 5]叶绿素的破坏则是导致植物细
胞死亡的又一关键因素[ 22] 。抗病反应还包括酚类
化合物含量的变化及一系列酚类氧化酶 ,如苯丙氨
酸解氨酶和过氧化物酶活性的变化[ 21] 。
抗病性是植物的遗传潜能 ,其表现受寄主与病
原的相互作用和环境条件的共同影响。根据基因
对基因学说 ,植物表现抗病性在于植物具有抗性基
因(resistance genes)而侵染病原物具有无毒基因
(avirulence genes)[ 2] 。不同的植株对同一病原菌 ,
同一植株对不同种的病原菌可具有不同的抗病
性[ 3 ,4]病原物的寄生专化性越强 ,则寄主植物的抗
病性分化也越明显 。一般而言 , 植物遭到锈菌 、白
粉菌 、霜霉菌以及其它专性寄生物和稻瘟病菌等部
分兼性寄生物的侵染可产生较强的抗病性[ 5] 。本
文研究离体红豆杉叶子对从红豆杉树皮中分离到
的一种黑曲霉 (Aspergi llus niger)侵染后的抗病
反应情况 ,并分析侵染时叶子叶绿素 、可溶性蛋白 、
酚类物质含量和酚类氧化酶活性以及叶子的受损
伤等生理变化。前期实验结果已经证实高温酸解
该黑曲霉得到细胞壁多糖组分可诱导红豆杉悬浮
细胞产生抗病性[ 11] ,因此本文亦用该多糖组分处
理离体红豆杉叶子 ,与用活体真菌处理时的叶子受
感染后的生理变化相比较 ,结果发现多糖组分可以
诱导红豆杉叶子产生抗病性 ,而黑曲霉孢子无此诱
导效应。
1 材料与方法
1.1　材料
红豆杉叶子取材于武汉植物园 4月份的中国
红豆杉嫩叶 。黑曲霉真菌从湖北神农架红豆杉树
皮分离得到 ,由本实验室保存 。
1.2 真菌多糖组分的制备
参考文献[ 11]的方法。
1.3 材料处理
红豆杉嫩叶以无菌水冲洗干净后 , 将 200g 嫩
叶接入含有 500mL 无菌 MS改良培养基[ 11] 2L 三
角瓶;加入叶子后 ,取 108/mL 的孢子悬浮液和真
菌多糖加入三角瓶 , 调节孢子和浓度大约为
10
6/mL和 10 mg/L。培养过程中 ,摇床转速为 130
～ 140 r/mim ,培养温度为 24±1oC ,暗培养。在不
同的培养时间取样 ,用于测定丙二醛 、叶绿素 、酚类
物质 、可溶性蛋白含量和酚类氧化酶活性的变化。
1.4 红豆杉叶子干重的测定
将冲洗干净的 2g 嫩叶接入含有 20mL 无菌
MS改良培养基的 50mL 三角瓶 ,其他条件与材料
处理相同 。在不同的时间点收获叶子后 ,将叶子在
70℃条件下烘干 ,作为叶子干重。
1.5 叶绿素含量的测定
参照文献[ 12]的测定方法 。
1.6 可溶性蛋白含量的测定
参照文献[ 12]的测定方法 。
1.7　过氧化物酶及苯丙氨酸解氨酶活性的测定
参照文献[ 12]的测定方法 。
1.8 丙二醛(MDA)的测定
参考文献[ 13]的测定方法 。
1.9 总酚类化合物分析
50mg 鲜重的细胞和 2.5mL 的预冷的乙醇混
合匀浆 ,匀浆液在 13000r/mim 离心 10min。1mL
的上清液(乙醇层)与 5mL 的重蒸水混合后 ,加入
0.5mL 的 Folin-Ciocalteu s酚试剂并混匀。静置
5min后 ,加入 1mL 5%(W/V)Na2CO3并混匀 。在
黑暗中静置 1h 后 ,混匀 ,于λ725处测其吸收值 ,以
没食子酸标准曲线为对照 ,算出酚类化合物的含
量。
2 结果
2.1 对细胞的损坏
三个实验组的干重均呈现下降趋势 ,但 12hr
后真菌处理组的下降速率最快 ,多糖组分处理组次
之 ,对照组下降最慢 。三个实验组的丙二醛含量均
呈上升趋势 , 真菌处理组的上升速率最快 ,并在
72hr 时达到三个实验组中的最大值 ,多糖组分处
理组次之 ,对照组上升最慢 ,且 72hr时含量为三个
试验组中最低的。
2.2 　叶绿素的变化
用真菌和多糖组分处理叶片后 30 小时以内 ,
叶绿素的总量都比对照有所下降 ,而且真菌处理组
中叶绿素总量比多糖组分处理组叶绿素总量下降
更快 。在 36hr至 48hr 之间 ,经多糖组分处理的叶
片叶绿素总量有所回升 ,甚至高出对照 ,之后又在
60hr 时下降至对照组叶绿素含量以下;而经真菌
处理过的叶片叶绿素含量始终低于对照组 , 但在
60hr 时有所回升 ,并且高出此时多糖组分处理的
叶片叶绿素总量。
2.3 可溶性蛋白
12hr以内 ,三个实验组的可溶性蛋白大致处
于相同水平 ,之后对照组和真菌处理组都呈下降趋
势 ,并且真菌处理组的下降较对照组更为显著。多
731 期　　　　　　　　　　　李默怡等:黑曲霉及其多糖组分诱导红豆杉叶子产生抗病反应之比较
图 1 真菌和多糖组分对中国红豆杉叶子干重(A)和丙二醛含量(B)的影响
Fig.1 Effects of the fungus and fungal poly saccharides on dry weight(A)and MDA content(B)in Taxus chinensis leav es
图 2 真菌和多糖组分对叶绿素总量的影响
Fig.2 Effects of the fungus and fungal poly saccharides
on total content of Chlorophyll
糖组分处理组却在 12hr 至 36hr 之间显著上升 ,并
在36hr 达到最大值 ,之后又逐渐下降 ,直至 72hr
时降至与真菌处理组及对照组相同的水平。
2.4 过氧化物酶
过氧化物酶活性的变化在两个处理组中也有
明显不同。真菌处理组在 12hr内的过氧化物酶活
性较对照组显著下降 ,然后始终处于极低的水平
上;多糖组分处理组在 24hr 内则较对照组显著上
升 ,之后又逐渐下降;对照组在 36hr时达到最大 ,
但低于 36hr时多糖组分处理组的水平 ,之后又以
比多糖组分处理组更快的趋势下降至与真菌处理
组同一水平 ,而多糖组分处理组的过氧化物酶水平
始终高于另外两个实验组 。
2.5 苯丙氨酸解氨酶
图 3 真菌和多糖组分对可溶性蛋白的影响
Fig.3 Effects of fungus and fungal poly saccharides
on total content of resoluble protein in Taxus chinensis leaves
真菌处理组和多糖处理组的苯丙氨酸解氨酶
的活性变化趋势比较一致 ,并且三个处理组都在
24小时达到最大值 ,但真菌处理组的活性始终低
于对照组 , 而多糖处理组的活性却在零至 24小时
内上升并高于对照组和真菌处理组 ,其后真菌处理
组和多糖处理组的活性均在 36小时低于对照组 ,
至 72小时时又回升至于对照相当的水平。
2.6 酚类化合物
真菌处理组与对照组的酚类化合物含量均呈
下降趋势 ,且真菌处理组 12hr 内的下降趋势更加
明显 ,真菌处理组的酚类化合物含量始终低于对照
74 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　23 卷
图 4　真菌和多糖组分对过氧化物酶活性及苯丙氨酸解氨酶活性的影响
F ig.4 Effects of fungus and fungal polysaccharides on activities of Perox idase
(A)and PAL(B)in Taxus chinensis leaves
组。多糖组分处理组在 12hr内也呈现出明显的下
降趋势 ,下降速率快于对照组但不及真菌处理组 ,
但随后又上升 ,并在 24hr 时达到最大值 ,之后又迅
速下降 ,至 72hr时 ,酚类化合物含量低于对照组但
仍高于真菌处理组。
图 5 真菌和多糖组分对酚类化合物的影响
Fig.5 Effects of the fungus and fungal poly saccharides
on phenolics in Taxus chinensis leaves
3 讨论
实验结果表明黑曲霉侵染红豆杉嫩叶时 ,导致
叶绿素降解(图 2)。叶绿素降解可造成植物碳源
代谢紊乱[ 15] ,是植物病变时叶片黄化或白化的主
要原因[ 16] 。而且黑曲霉的侵染导致红豆杉嫩叶干
重降低和丙二醛含量升高 ,进一步证明黑曲霉侵染
引起红豆杉叶子发生病变 。另外 ,黑曲霉的侵染降
低红豆杉嫩叶中酚类物质的含量 ,来源于黑曲霉细
胞壁的多糖组分反而提高嫩叶中酚类物质的含量
(图 5)。酚类化合物可与活性氧反应形成网状聚
合物 ,从而降低细胞中的活性氧含量及提高抵御病
原微生物侵染的能力[ 17] 。我们还发现多糖组分提
高叶片中酚类物质合成关键酶———苯丙氨酸解氨
酶和相关酶 ———过氧化物酶的活性(图 4)。多糖
组分处理植物提高苯丙氨酸解氨酶和过氧化物酶
的活性 ,从而提高在酚类物质含量的现象在多个文
献中已有报道[ 18] 。酚类物质含量和酚类代谢相关
酶的活性增强是植物抗病性的重要组成 ,而黑曲霉
的侵染并不能提高苯丙氨酸解氨酶和过氧化物酶
的活性。除此以外 ,多糖组分还可以提高叶子中可
溶性蛋白含量 ,上述实验结果皆说明多糖组分具
有较强的诱导红豆杉叶子产生抗病反应的能力 ,而
黑曲霉并未产生此效应 。
过敏性细胞死亡(hypersensitive cell death)与
细胞坏死(necrosis)是植物遭到病原菌侵染后两种
不同的细胞死亡方式 ,前者是由基因所控制的 ,后
者是由多种致病因子(物理 、化学和生物因子)作用
而产生的急性损伤所致[ 19] 。结果显示尽管黑曲霉
侵染及多糖处理皆可导致细胞坏死 ,但多糖处理的
此种效应较为轻微 ,而主要导致中国红豆杉叶子过
敏性细胞死亡并诱导细胞发生防御反应 ,黑曲霉孢
子侵染导致细胞坏死而非诱导产生防御反应的原
因可能主要是黑曲霉分泌的纤维素酶和果胶酶等
酶类物质严重破坏了细胞的细胞壁[ 14] ,因此在细
胞防御反应还未来得及响应前便造成了细胞的大
量死亡 , 而多糖成分仅作为一种信号分子对细胞
并无明显的机械损伤 ,却迅速传达了外来物质侵入
的信息从而导致了细胞的过敏反应[ 10] 。 Jurgen 和
Axel也报道除可溶性寡聚多糖外 ,真菌细胞壁多
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糖组成成分如几丁质 、脱乙酰壳多糖 、葡聚糖等也
可诱导防御反应[ 20] 。
黑曲霉广泛分布在土壤和空气中 ,可以破坏植
物细胞壁各组分之间的交联和降解细胞壁组分木
聚糖和纤维素 ,导致植物病变 ,甚至植物腐坏[ 14] ,
是引起林业真菌病害的主要病源菌之一 。结果表
明尽管黑曲霉侵染导致细胞死亡 ,而其高温降解的
细胞壁多糖组分处理诱导红豆杉叶发生防御反应 。
因此本文认为从致病菌中分离到的多糖成分等诱
导因子 ,可作为防止林木病害的有效生物农药以提
高林木自身的抗病性 。
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