全 文 ：第 21 卷　第 1 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2001年　1 月
Vol.21　No.1　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH Jan., 　2001
东北地区野豌豆属植物过氧化物酶同工酶研究
宋志文1　曹　军1　杨　光2
(1.中国科学院沈阳应用生态研究所 , 沈阳　110015)
(2.哈尔滨制药三厂 , 哈尔滨　150010)
摘　要　采用过氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱作为遗传标记 ,结合形态学 、细胞学及
野外居群调查等工作 ,对东北地区野豌豆属植物进行深入研究。结果表明分子资料基本上同形态
学 、细胞学研究取得比较一致的结果 。对一些在分类上有争议的类群提出了处理意见 ,并推测了
该属内一些多倍体的起源方式 。
关键词　过氧化物酶同工酶;野豌豆属;居群
STUDIESON PEROXIDASE ISOZYME OF
VICIA L.IN NORTHEAST CHINA
SONG Zhi-wen1　CAO Jun1　YANG Guang2
(1.I nstitute of Applied Ecology , Academia sinica , shenyang　110015)
(2.Harbin Third Pharmaceutical manufactory ,Harbin　150010)
Abstract　By means of polyacrylamide gel elect rophoresis , peroxidase isozyme of Vicia L.Species
distributed in no rtheast of china was analysed.In conjunction with the w orks of mo rphology , cy tolo-
gy and population investigation the results showed that molecular data w ere in general in agreement
with the studies of mo rphology and cytology .Taxonomic treatments w ere given to some controversial
species and o rigins of some multiploids w ere guessed .
Key words　Peroxidase isoenzyme;Vicia L .;Population
1　引　言
野豌豆属(Vicia)是林奈 1753 年根据模式种
Vicia Sativa 建立的 ,至今全属大约有 150 种 , 主要
分布于北温带和南美 。我国约有 40种 ,南北均产 。
自从该属建立以来 ,国外一些学者先后对其进
行了分类学 、解剖学 、细胞学和花粉学的研究 。进入
六十年代后 ,针对一些有经济价值的种类 ,开展了植
物化学 、植物生物化学 、植物生理学和杂交育种方面
的工作 。国内对野豌豆属植物研究较少 ,主要是一
些经典分类学方面的工作 ,并对个别种类作了核型
分析[ 1～ 3] 。近年来 ,李瑞军等对我国东北地区的该
属植物进行了广泛的野外居群调查和染色体方面的
研究 ,发现该属内存在许多问题 ,很有深入研究的必
要[ 4～ 12] 。
目前 ,同工酶已广泛应用于生物学研究的各个
领域 ,在植物系统发育与进化研究中 ,常用于估计种
内居群间 、居群内基因频率的变化 ,估算种间 、种内
分化程度 ,分析种内亲缘关系等[ 13] 。
本文以过氧化物酶同工酶作为遗传标记 ,通过
聚类分析 ,结合形态学和细胞学研究 ,阐明东北地区
野豌豆属植物的亲缘关系 ,并探讨过氧化物酶同工
酶酶谱在该属内的分类价值。
第一作者简介:宋志文(1966-),男 ,博士研究生 ,工程师。现从事环境生物学方面研究。收稿日期:2000-3-4
2　材料与方法
野外采集成熟植物种子 ,实验室内萌发后 ,砂土
培养幼苗 ,待生出两枚真叶时 ,取幼苗洗净 ,用滤纸
吸去水份 ,置预冷研钵中按 1.5 ～ 2.0ml/g 比例加入
0.05mol/L Tris-Hcl pH8.8 缓冲液 , 研磨 ,经 6 ,
000rpm 离心 15 分钟 , 取上清液 , 加入同体积的
40%蔗糖 ,冰箱-20℃保存备用。聚丙烯酰胺凝胶
电泳采用高 pH 不连续系统 ,浓缩胶浓度 2.5%,分
离胶浓度 7%,电极缓冲液为 Tris-Gly pH8.3 ,点
样量 50ul ,30MA 定电流条件下电泳 6小时 ,电泳完
毕后采用醋酸联苯胺方法染色 。
3　结果与讨论
本实验共分析了东北地区野豌豆属植物 8 种 2
变种 22个居群(见表 1)的过氧化物酶同工酶 ,酶谱
见图 1 ,从结果中可以看出 ,大部分谱带位于酶谱上
方(靠近阴极),其中谱带 A 、B 、C 、D着色较深 ,出现
的频率也较高 。
表 1 用于实验的居群
Table 1 Populations used in experiments
Scentific name
居群编号
No.of population
采集地点
Location
染色体数
2n
倍　　性
Ploidy
V.amoena
山野豌豆
0 11 加格达奇 24 4x
0 12 老黑山 24 4x
0 13 西林吉 24 4x
0 14 齐齐哈尔 24 4x
V .oblongif lora
狭叶山野豌豆 0 15 肇东 24 4x
V.sericea
绢毛野豌豆 0 16 伊胡塔 12 2x
V .cracca
广布山野豌豆
0 21 境泊湖 12 2x
0 22 锡林浩特 12 2x
0 23 西林吉 14 2x
V .japonica
东方野豌豆 0 31 古莲 24 4x
V.venosa
柳叶野豌豆 0 41 太平沟 12 2x
V .ram ulif lora
北野豌豆
0 51 千山 12 2x
0 52 塔源 12 2x
0 53 黄泥河 12 2x
0 54 长白山 24 4x
V .am urensis
黑龙江野豌豆
0 61 西林吉 12 2x
0 62 哈师大校园 12 2x
V .pseudorobus
大叶野豌豆
0 71 西林吉 12 2x
0 72 老黑山 12 2x
V .unijuga
歪头菜
0 81 锡林浩特 12 2x
0 82 加格达奇 12 2x
0 83 哈师大校园 24 4x
　　同工酶是基因表达的产物 ,是分子水平的表现 型。因此同工酶表现型的差异在某种程度上可能反
132 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　21 卷
映了基因型的差异。从基因型差异程度就能显示出
种间或居群间亲缘关系的远近。Vaughan 等(1968)
提出用酶谱相似度系数(Similarity index value)来推
测种间的亲缘关系 ,相似度指数愈高 ,亲缘关系愈
近。
相似度指数 = 相同谱带对数相同谱带对数+不同谱带对数
以22个居群作为 OTU(operational taxomomic
unit ,运算分类单位)对相似度指数采用 UPGMA 法
进行聚类分析 ,树系图见图 2。
图 1　东北地区野豌豆属植物 22个居群过氧化物酶同工酶酶谱模式图
Fig.1 Peroxidase isozyme band patterns of 22 populatings of V icia species distributed in nor theast of china
图 2 野豌豆属植物 22个居群过氧化物酶同工酶酶谱相似性分析树系图(UPGMA 法)
Fig.2 UPGMA cluster analysis using similarity index values based on peroxidase isozyme band patterns for 22 pop-
ulations of Vicia species.
1331 期　　　　　　　　　　　　　宋志文等:东北地区野豌豆属植物过氧化物酶同工酶研究
1　种内居群间酶谱变异及其意义
从酶谱上看 ,种内居群间酶谱变化是普遍现象 。
在山野豌豆 、北野豌豆 、黑龙江野豌豆 、广布野豌豆
都存在这种变化 ,说明同种不同居群在遗传本质上
是有区别的 ,表明物种正处于分化阶段。事实上种
是用于生物分类的基本单位 ,但种不是进化单位 ,进
化的基本单位是居群 ,由于种种内在的和外界的因
素的影响 ,每个居群都有着自己独特的进化轨迹 ,因
而形成各自的酶谱式样。尽管存在着复杂的种内酶
谱变化 ,但每个种仍有足够的谱带和其它种相区别 。
从聚类树系图上可以看出 ,种内居群间变异只发生
在较低水平。但也有些居群较特殊 ,如:广布野豌豆
的三个居群 ,北野豌豆的五个居群 。
2　酶谱在野豌豆属的分类价值
经典分类学在研究种的划分时主要借助于形态
和地理分布的资料 ,一般认为和分子进化相比 ,形态
进化不稳定 ,受环境制约 , 因而二者是不平行的 。
Got tlieb(1977)指出酶谱资料具有如下优点:①避免
了趋同进化和性状相关 , ②酶谱简单明确 ,主观性
小 , ③酶谱很少受环境影响 ,不存在加权问题 。
在树系图上跳变值最大处的中点作结合线 , 　
L2=0.6803 ,将其标记在相应位置上 ,结合线将 22
个居群分为 7类:1.大叶野豌豆 2个居群 , 2.东方
野豌豆 1个居群 ,3.黑龙江野豌豆 2 个居群 ,4.广
布野豌豆 3个居群 , 5.山野豌豆复合种 6个居群 ,
6.歪头菜 3 个居群 , 7.柳叶野豌豆复合种 5 个居
群 ,相当于种级水平 ,同时也说明它们是比较自然的
类群 。由 L3=0.8700可将 22个居群聚为 12类:1.
大叶野豌豆 ,2.东方野豌豆 , 3.黑龙江野豌豆 , 4.广
布野豌豆 021 、022居群 , 5.广布野豌豆 023居群 , 6.
山野豌豆复合种 015 居群 , 7.山野豌豆复合种 016
居群 ,8.山野豌豆复合种 011 、012 、013 、014居群 , 9.
歪头菜 3个居群 ,10.柳叶野豌豆 041居群 ,11.北野
豌豆 052居群 , 12.北野豌豆 051 、053 、054居群。由
此得到以下几个结论:
(1)将狭叶野豌豆和绢毛野豌豆处理为 V .
amoena 的种下单位是合适的 。
(2)在广布野豌豆三个居群中 , 023 居群是比
较特殊的一个居群 ,它和另外二个居群的 酶谱距离
为 0.1765 ,细胞学研究表明 023居群染色体数为 2n
=14 ,而另外二个居群 021 、022 染色体数 2n=12;
从形态上看 , 021 、022居群小叶光滑 、呈绿色 、小叶
较宽(2 ～ 6mm), 023 居群植株小叶两面密生柔毛 、
呈灰色 、小叶较狭窄 (1 ～ 3mm)。关于 2n=14 细
胞型分类处理意见不一 ,曾有过种和变种两种分类
方案。从我们的实验结果看 ,支持了将该细胞型处
理为广布野豌豆的一个种下单位。
(3)关于柳叶野豌豆复合种的分类处理意见:
柳叶野豌豆复合种是野豌豆属内叶轴末端不具卷须
的一类 ,不同学者对该复合种处理意见不一。北川
政夫认为 V .venosa (willd)Maxim 应该包括 V .
venosa var.Albi f lora (Turcz.) Max im 和 V .
venosa var.Baicalensis(Turcz.)Maxim 等种下类
群。但在《苏联植物志》(1948)则把前者作为独立
的种处理 ,即北野豌豆 V .vamuli f lora (Maxim.)
ohwi。《东北草本植物志》对该观点表示赞同。对柳
叶野豌豆的另一变种 V.venosa var.Baicalensis
Turcz.所提升的贝加尔野豌豆 V .baicalensis(Tur-
cz.)Fedtsh也存在分歧 。《苏联植物志》和《蒙古植
物检索表》都承认贝加尔野豌豆的种级地位 , 《东北
草本植物志》中将其处理为北野豌豆的一个变型 。
野外居群调查和染色体研究表明该复合种由两种细
胞型组成(2n=12 , 2n=24)。二倍体细胞型广布于
东北地区 ,而四倍体仅在长白山高海拔地区发现 。
从个体数目上看 ,柳叶野豌豆数目极少 ,北野豌豆占
优势 ,而长白山高海拔地区的类群 ,居群相当大 ,在
形态上该复合种内叶型和托叶变化极大 ,甚至成连
续状态。过氧化物酶同工酶研究表明长白山类群和
北野豌豆黄泥河居群的酶谱模式完全相同 ,柳叶野
豌豆与北野豌豆(2n=12)之间的酶谱相似度指数为
0.7994 ,高于野豌豆属内其它种间相似度指数 ,从聚
类树系图上可以看出 ,五个居群结合早于结合线
L2 。通过研究我们认为将北野豌豆作为柳叶野豌豆
的一个变种是比较合理的分类方案。原处理为种 、
变种 、变型的贝加尔野豌豆不能成立 ,将其与北野豌
豆归为同一变种。在聚类树系图上 , 似乎应当将
052居群和 051 、053 、054居群分别处理为柳叶野豌
豆的两个变种;在形态上 052 居群和 051 、053 、054
居群并无明显的分化 。这说明居群间同工酶的变异
并不总伴随着形态上的分化。
3　酶谱在野豌豆属植物系统发育与进化研究中的
作用
“由于表型与基因型的不一致 ,使得主要基于形
态学推断的系统发育不一定正确 ,杂交和栽培实验
周期长而不方便 ,同工酶分析使得这一问题容易解
决。”(Got tlieb 1974).通过该属植物过氧化物酶同
工酶的研究对了解该属的系统发育与进化有一定帮
助。
从酶谱上可以看出 ,谱带 A 、B 、C 、D出现于所
有22个居群中 ,谱带 a、b出现频率也较高 ,由此反
134 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　21 卷
映了该属植物的共同起源 。该属是个比较自然的类
群。
在广布野豌豆的三个居群中 , 023 和 021 、022
居群相比 ,具有基本的谱带模式 ,021 、022居群只是
在023 居群谱带基础上分别增加 3条 、4 条谱带 。
由此我们认为 021 、022居群可能是023居群衍生出
来的类群 ,表现在染色体数目上的变化 ,即 n=7※n
=6 ,这和细胞学研究结果相一致。
在树系图上由结合线 L1 处可将 22个居群聚为
三类:1.歪头菜 3个居群 、广布野豌豆 3个居群 、山
野豌豆复合种 6个居群;2.柳叶野豌豆复合种 5 个
居群;3.黑龙江野豌豆 2 个居群 、大叶野豌豆 2 个
居群 、东方野豌豆 1 个居群 。由此初步得到以下几
个设想:
(1)关于东方野豌豆的起源:
细胞学研究认为东方野豌豆是异源多倍体 ,黑
龙江野豌豆可能是其二倍体祖先种之一 ,同工酶研
究支持了这一结论 ,同时发现大叶野豌豆和东方野
豌豆的亲缘关系也较近。
(2)关于山野豌豆的起源;
山野豌豆包括 3各类群 ,山野豌豆(2n=24)、狭
叶山野豌豆(2n=24)、绢毛山野豌豆(2n=12)。根
据外部形态 、地理分布和染色体数 ,李瑞军等认为山
野豌豆复合种的祖先二倍体种向着两个方向演化;
其一是与近缘二倍体种杂交形成异源四倍体 ,其二
是局限地分布在特殊的生态条件下 ,经长时期地适
应自然选择的压力 ,分化出一种新的二倍体细胞型 ,
即绢毛野豌豆。同工酶研究发现这三者亲缘关系密
切。在树系图上 ,山野豌豆和歪头菜 、广布野豌豆聚
为一类 ,三者有比较近的亲缘关系 ,异源四倍体的亲
本可能存在于这些近缘物种中 。
(3)柳叶野豌豆复合种在结合线 L 1 处本身聚
为一类 ,说明该复合种是野豌豆属内比较孤立的一
类 ,没有近缘物种。
以上设想和前人研究的结果不尽相同 ,对此还
须进行更为深入的研究。
参　考　文　献
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