全 文 ：第 21 卷　第 2 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2001年　4 月
Vol.21　No.2　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH Apr., 　2001
杜仲叶片和叶柄愈伤组织的诱导和植株再生
朱登云　田慧琴　李浚明
(中国农业大学生物学院 北京 , 100094)
摘　要　本实验以 5 ～ 6年生杜仲叶片及叶柄为外植体 ,研究了杜仲愈伤组织诱导及植株再
生的方法 。结果表明:接种于补加 NAA(2.0 ～ 4.0 mg/L)或 BA(1.0 mg/L)+NAA(2.0 ～ 4.0
mg/ L)的 MS 培养基上的叶片和叶柄 ,经 21 ～ 28d培养后 ,脱分化形成绿色或浅绿色致密愈伤组
织 ,频率达到 70%以上。绿色致密愈伤组织在补加 BA(2.25 ～ 2.75 mg/L)+NAA(0.15 mg/L)
的 MS培养基上经过 1 ～ 2次继代之后 ,即出现茎芽分化 ,频率在 15%以上 ,只是其中许多都是畸
形苗 ,正常苗频率较低。此问题尚在研究之中。
选择生长健壮的再生植株 ,切除其基部愈伤组织 ,然后将切口浸泡在 250mg/L 无菌 ABT 生
根粉溶液中3 ～ 5sec ,再插入 1/4强度无激素 MS 培养基中 ,2 ～ 3周后 ,在苗基部长出 1 ～ 3条白色
粗壮的不定根 ,生根频率在 60%以上 。
关键词　杜仲;愈伤组织诱导;植株再生
CALLUS INDUCTION AND PLANT REGENERATION FROM
LEAVES AND PETIOLE IN E .ULMOIDES
ZHU Deng-yun　TIAN Hui-qin　LI Jun-ming
(College of Biological Sciences , China Agricultural University , Beijing 100094)
Abstract　In order to establish somaclones of E.ulmoides , we used as explants leaves and petioles of
5 ～ 6-year-old E.ulmoides and studied the method of callus induction and plant regeneration.
Explants taken from leaves and petioles were cultured on MS medium supplemented w ith 2.0 ～
4.0 mg/ L NAA or 1.0 mg/L BA +2.0 ～ 4.0 mg/L NAA.After 21 ～ 28 days of culture bo th leaves
and petioles dedifferentiated , forming g reen or g reenish compact callus , with induction f requency sur-
passing 70%.Transferred onto MS medium supplemented with 2.25 ～ 2.75 mg/L BA +0.15 mg/
L NAA and cultured for 1 ～ 2 passages , the callus redifferentiated at a frequency of over 15%.The
optimal condit ion fo r redifferentiation needs further study because many shoots w ent abnormal.
To induce rooting , healthy shoots w ere selected.The callus at the based end of the shoot w as cut
of f , and the cut-end was soaked in a sterile ABT rooting-powder solution(250 mg/ L)for 3 ～ 5 sec.
Subsequent ly the t reated shoo t w as t ransplanted into 1/4-st reng th , hormone-free MS medium.After
2～ 3 w eeks , 1 ～ 5 sturdy w hite root(s)appeared f rom the lower end of the shoot.Approximately
60%～ 80%of the shoots roo ted.
第一作者简介:朱登云(1962-),男 ,副教授(博士),研究方向是植物传育种。
　收稿日期:1999-11-29
Key words　Eucommia ulmoides Callus induction Plant regeneration
　　杜仲是我国特有的经济林树种 ,树皮和树叶除
可药用外 ,所含的杜仲胶更具有广阔的工业开发前
景[ 1 ,2] 。然而 ,现有杜仲叶的含胶量低(2%～ 3%),
提胶成本高 ,这是制约其大规模应用的瓶颈。因此 ,
通过组织培养对杜仲进行遗传改良(体细胞无性系
变异和遗传转化等)及建立优株无性系 ,具有重要意
义。过去由于对杜仲的综合利用价值认识不足 ,致
使对杜仲的基础研究十分薄弱 ,有关杜仲组织培养
方面的研究 ,迄今只有零星报道[ 3-8] ,而且研究的
重点主要是优株离体繁殖 ,有关杜仲离体叶片和叶
柄培养的研究尚属空白 。本研究的目的 ,在于建立
杜仲叶片 、叶柄愈伤组织诱导和植株再生的培养体
系 ,为今后杜仲的生物技术育种打好基础。
1　材料和方法
1.1　供试材料及外植体消毒
在 7 ～ 8月份将采自 5 ～ 6年生的杜仲树枝上的
嫩叶和叶柄用湿布包裹 ,放入塑料袋中 ,带回实验
室。然后用自来水冲洗 10min ,用 0.1%HgCl2消毒
5 ～ 10min ,再用无菌水冲洗 5次 ,叶片切成约 0.4cm
×0.4cm 的小块 、叶柄切成 0.2cm 的小段 ,用于接
种。
1.2　培养基与培养条件
所用的基本培养基(BM)为 MS 无机盐+B5有
机物 , 并添加酵母浸提物(YE)800mg/L 和蔗糖
30g/L ,用琼脂 7g/L 固化 ,在高温灭菌前将 pH 调至
5.8。
培养条件:培养室温度 25±2℃,光照时间 16h/
d ,光照强度 1000 ～ 1500lx 。
1.3　愈伤组织的诱导
将叶片 、叶柄切成合适大小 ,分别接种于激素水
平和配比不同的愈伤组织诱导培养基中(具体成份
将在“结果与讨论” 部分列出),每处理接种外植体
数 98 ～ 112块 ,定期检查两类外植体在不同培养基
中的愈伤组织诱导频率。
1.4　愈伤组织的分化
经继代增殖的绿色致密愈伤组织转至以不同配
比添加 BA 和 NAA 的 MS 培养基上 ,每 3 ～ 4 周继
代一次 ,并定期统计各处理中愈伤组织的分化频率 。
1.5　再生植株的壮苗 、繁殖与生根
再生植株的壮苗繁殖和生根 ,采用朱登云等报
道[ 9]的方法进行。
2　实验结果
2.1　杜仲叶片和叶柄愈伤组织的诱导
将杜仲叶片接种到愈伤组织诱导培养基(成分
下详)上培养 5 ～ 7d ,叶片开始膨大 ,再经 16 ～ 20d ,
叶片切口周围形成致密的绿色或浅绿色的愈伤组织
(图版说明.a )。杜仲叶片愈伤组织的诱导频率主
要受培养基中激素组成的影响 。
图 1　杜仲叶片愈伤组织的诱导频率主要受培养基中激素组成的影响。
Fig.1 Effect of concentration of BA and NAA in the medium on leaf callus induction frequency of E .ulmoides
图1表明愈伤诱导培养基中 BA和 NAA 的不同配
比对叶片愈伤组织诱导频率的影响。从中可看出:
在无激素或只添加 BA(1 ～ 2 mg/L)的培养基上 ,叶
片仅出现膨胀 ,而不形成愈伤组织 ,即使有个别叶片
切口的边缘形成极小的颗粒状愈伤组织 ,也因这种
愈伤组织状态差而在继代过程中逐渐褐化死亡;就
叶片而言 ,能否脱分化形成愈伤组织 , NAA 起着十
分关键的作用 。单独使用一定浓度的 NAA ,就能使
2072 期　　　　　　　　　　　　　　朱登云等:杜仲叶片和叶柄愈伤组织的诱导和植株再生
叶片脱分化形成愈伤组织;当激素组成为 NAA(2 ～
4 mg/L)或 BA(1.0 mg/L)+NAA(2 ～ 4.0 mg/L)
时 , 叶 片 愈 伤 组 织 的 诱 导 频 率 最 高 , 达
72.5%～ 95.7%。
与叶片相比 ,叶柄愈伤组织发生过程 、初生愈伤
组织状态和对外源激素的要求与叶片相似 ,不同的
只是形成愈伤组织所需的时间短(10 ～ 14d), 频率
高。在上述适合的培养基上 ,愈伤组织的诱导频率
均在 90%以上。
2.2　愈伤组织的继代增殖和茎芽分化
把绿色或浅绿色的致密初生愈伤组织转接至激
素组成为 BA(1.0 ～ 2.0 mg/L)+NAA(2.0 mg/ L)
的MS培养基中 ,进行继代增殖 ,效果较好 。若初生
愈伤组织转至只添加一种细胞分裂素而无生长素或
一种生长素而无细胞分裂素的培养基上 ,则愈伤组
织生长缓慢 、状态较差 ,并有少部分愈伤褐化死亡 。
为了诱导愈伤组织的分化 ,在确定以 MS 为基
本培养基后 ,我们对多种细胞分裂素(ZT 、BA 、KT)
和多种生长素(NAA 、IAA 、IBA)以不同浓度和不同
配比构成的大量组合进行筛选 ,结果发现:不同种
类的细胞分裂素和生长素 ,对诱导分化具有明显不
同的效果。在几种细胞分裂素中 ,以 BA 的效果最
好 ,而在几种生长素中 ,又以 NAA 效果为最好;若
将 BA和 NAA搭配使用 ,其诱导愈伤组织分化的效
果为最佳。BA和 NAA诱导分化的有效配比为 BA
(2.25 ～ 2.75 mg/L)+NAA(0.15 mg/L),此时 ,愈
伤组织分化频率在 15%以上(表 1)。然而 ,无论是
杜仲叶片还是叶柄愈伤组织 ,转至分化培养基上后 ,
都需经 1 ～ 2次继代 (每 4周一次)才陆续分化 ,而
且许多为畸形苗或玻璃化苗 ,正常苗的分化频率更
低(图版说明.b )。来源于叶片和叶柄的愈伤组
织 ,其分化潜力和对激素的要求并无明显差异。
　　表 1 不同浓度 BA和 NAA对杜仲叶片愈伤组织分化频率的影响
Table 1 Effect of concentration of BA and NAA in the medium
on redifferentiation frequency of E.ulmoides leaf derived callus
激　素
Phy toho rmones/mg/ L
愈伤组织数
No.of calli
茎芽分化数
No.of redifferentiation
愈伤组织分化频率/ %
Redifferentiation frequency
1.25 BA+0.15 NAA 112 2 1.8
1.75 BA+0.15 NAA 112 6 5.4
2.25 BA+0.15 NAA 112 18 16.1
2.75 BA+0.15 NAA 98 15 15.3
3.25 BA+0.15 NAA 98 9 9.2
1.75 BA+0.30 NAA 98 0 0
2.25 BA+0.30 NAA 98 3 3.1
2.75 BA+0.30 NAA 98 7 8.1
3.25 BA+0.30 NAA 112 9 8.0
图版说明 Explanation of plate
a.杜仲叶片愈伤组织 b.绿色致密愈伤组织分化正常茎芽 c.经壮苗培养后的再生植株 d.再生植株生根
a.Primary callus produced by leaf of E.ulmoods b.A normal regenerant redifferentiated from the green and compact cal-
lus.c.A Healthy plantlet d .Rooting of plantlet
2.3　再生植株的壮苗 、繁殖和生根 刚分化出来的再生植株比较细弱 ,不宜立即生
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根。须首先将其连同基部的小块愈伤组织一并转入
补加 BA(1.0 ～ 1.25 mg/ L)和 IBA(0.2 ～ 0.4 mg/
L)的 MS培养基中。通过调节培养基中 BA或 IBA
的浓度 ,即可达到壮苗 、繁殖的双重目的(图版说
明.c)。
取生长健壮的再生植株 ,切除其基部的愈伤组
织 ,然后将切口一端浸泡 在 250mg/L 的无菌 ABT
生根粉溶液中 3 ～ 5sec ,再插入无机盐浓度减至 1/
4 、蔗糖浓度减半(1.5%)的无激素 MS 培养基中 ,诱
导生根 ,2周后即可见 1 ～ 5条粗壮的不定根(图版
说明.d),生根频率在 60%以上 。若提高培养基中
无机离子强度或蔗糖的浓度 ,则不利于生根(表 2)。
表 2　培养基中无机离子强度和蔗糖浓度
对杜仲试管苗生根的影响
Table 2　The influence of strength of inorganic ions
and concentration of sucrose in the medium
on rooting of regenerated shoot
培养基中无机离子强度
Strength of inorg anic ions
in the medium
蔗 糖 浓度% Con-
centration
of sucrose
生 根 频率%
F requency
of shoot
roo ting
MS 3 33.3
1/ 2MS 3 40
1/ 4MS 3 60
1/ 4MS 1.5 78.6
3　讨　论
杜仲是难于进行组织培养的一种木本植物。左
春芬等人[ 8 , 9]最早涉及这方面的研究 ,他们用杜仲
幼嫩树枝为外植体诱导出愈伤组织 ,但未能获得再
生植株。1992年 Tada 和 Nakazaw a 只在杜仲愈伤
组织中检测到杜仲的主要药用成份(松脂醇二葡萄
糖甙),但仍未深化到诱导分化方面的问题[ 10] 。直
至 1995 年 ,裴德清 、王秀松以杜仲无菌苗的下胚轴
和子叶为外植体 ,获得了完整的再生植株[ 11 , 12] 。
现在我们则以叶片和叶柄为外植体 ,初步建立
起愈伤组织诱导和植株再生的培养体系 。我们的研
究表明:无论是叶片还是叶柄 ,都容易脱分化形成愈
伤组织 ,只要条件适宜 ,诱导频率均达 80%以上;愈
伤组织在一定条件下 ,虽可出现器官分化 ,但分化频
率低 ,特别是正常苗的分化频率则更低 ,从育种的角
度来看 ,还需进一步研究 。
参　考　文　献
1.严瑞芳.杜仲胶研究新进展.化学通报 , 1991 ,(1):1 ～ 6
2.严瑞芳.杜仲胶橡胶-塑料材料中的过渡特征.橡胶工
业 , 1992 , 39:620～ 626
3.左春芬 , 侯玉华 , 韩薇拉 , 杜仲组织培养初报 , 中草药 ,
1981 , 11(10):473
4.苏新.杜仲的快速繁殖(简报).中国中药杂志 , 1990 , 15
(10):16 ～ 17.
5.陈丕玲 ,王俊丽.杜仲组织培养植株再生研究初报.见:张
康健主编 ,中国杜仲研究 , 西安:陕西科技出版社 , 1992 ,
55～ 67
6.陈品良 ,金炜 , 郑生智.杜仲下胚轴 、子叶外值体诱导植株
再生.见:张康健主编 , 中国杜仲研究 , 西安:陕西科技出
版社 , 1992
7.张朝成.杜仲芽培养形成完整植株.植物生理通讯 , 1988 ,
(2):59.
8.Chen LiJing Hu TaWei and Huang LiChun.Apro to col to-
w ard multiptication of the medicinal tree Eucommia ulmoides
O liver.In vitro Cell Dev.Bio.～ P lant , 1995 , 31:103 ～ 198
9.朱登云 ,蒋金火 , 裴德清等.由杜仲成熟干种子胚乳培养再
生完整植株.科学通报 , 1997 , 42(5):560～ 561
10.Todo Y.Studies on tissue culture of Eucommia ulmoides O-
liv.～ Propagation of endangered plant and pino resinol ～ di～ o
～ beta～ g lucoside preparation in cell culture(conference ab-
stract).In vitro , 1992 , 28(3):P t.2 , 99A.
11.裴德清杜仲愈伤组织培养和优株离体快速繁殖.中国农
业大学硕士学位论文 , 1995.
12.王秀松 ,胡东波 ,詹庆才.杜仲愈伤组织的诱导及植株再
生的研究.西北林学院学报 , 1994 , 9(4):32～ 35.
2092 期　　　　　　　　　　　　　　朱登云等:杜仲叶片和叶柄愈伤组织的诱导和植株再生