全 文 ：第 20 卷　第 4 期　　　　　　　　木　　本　　植　　物　　研　　究 2000 年　10 月
Vol.20　No.4　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH Oct., 　2000
等离子体浸没 N+注入豌豆种子的生长发育效应初报
杜兰芳1　郁　达1　卢祥云1　吴美萍2　潘重光3
(1.江苏省常熟高等专科学校 , 常熟　215500)
(2.中国纺织大学基础部 , 上海　200051)
(3.上海农学院植物科学系 , 上海　201101)
摘　要　就等离子体浸没离子注入豌豆休眠种子后 ,对其生长发育的遗传学效应进
行了研究 。结果表明 ,经处理后的种子的萌发率明显下降 ,出苗 、生长发育均呈滞后
现象 ,且降低了株高 。20min为半致死剂量。提出等离子体浸设离子注入可以作为
诱变育种的一种经济 、有效的诱变方法 。
关键词　等离子体浸没离子注入;豌豆;生长发育
THE CROWTH EFFECT BY N+ USING A PLASMA
IMERSION ION IMPLANTER OF PEA SEED IMPLANTED
DU Lan-Fang1　YU Da1　LU Xiang-Yun1　WU Mei-Ping2　PAN Chong-Guang3
(1.Dept.of Biology , Changshu College , Chang shu 215500)
(2.Dept.of Basic Science , China Tex tile Univ., Shanghai 200051)
(3.Dept.of Plant Science of Shanghai Ag ricultural Colleg e , Shanghai 201101)
Abstract　The genetic effect on plant g row th by plasma immersion ion implanter af ter
implantation on pea seed w as studied.The results showed the seed treated w as not only
the germination percentage decline but also the plant grow th retardation , and the stem
of a plant w as low.The semilethal dosage w as 20 minutes.Being an economical and
available method plasma immersion ion implantation in mutagenic breeding was pro-
posed.
Key words　Plasma immersion ion implantation;Pea;Grow th
低能离子生物学 ,作为一门新的交叉科学 ,在探索生命过程 、定向改良品种和基因工程
等方面发挥越来越重要的作用 。低能离子生物效应也已为国内外所公认[ 1 , 2] 。本文就另一
种离子注入———等离子体浸没 N+注入休眠豌豆种子后的生长发育期遗传性状进行了初步
第一作者简介:杜兰芳(1949-),女 ,副教授。从事方向:植物遗传学。中国科学院冶金所离子束开放研究实验室资助课题(2310)收稿日期:1999-6-10
探讨 。试图为开发更多的 、较简易的诱变源 ,扩大诱变谱提供点滴可参考的生物学依据。
1　材料和方法
1.1　生物样品
豌豆干种子(Pisum sativum L.)上海农学院提供 。
1.2　试验步骤
1.2.1　等离子体浸没 N+注入　挑选大小均匀 ,综合性状良好的豌豆种子 ,于 1999年 3月
中旬在中国纺织大学等离子体物理研究室进行等离子体浸没 N+注入。注入装置示意图见
参考文献[ 3] 。射频电源的工作频率为 24.7MHz ,振荡功率为 800w 。负高压注入脉冲的幅
度为 50kv ,脉宽约为 2μs ,重复频率为 100Hz。处理时间为 5 、10 、20 、30 、35min ,以未处理作
对照 。
1.2.2　实验室培养 　将各组种子各随机取 50粒用水浸泡 24h 后 ,放在 25℃和光照度
2500Lx(12h/d)的人工气候培养箱内培养 ,每天定时观察 。重复 3次。计算发芽率。
1.2.3　田间栽培 　各组各随机取 30 粒种子于 1999年 3月 24日浸种 24h。次日播种于
上海农学院农场大棚中。开洼后先浇水再下种 ,盖一层薄土 。株距为 18cm ,行距为 50cm 。
以未处理作对照 。以后每天定时观察。
1.2.4　过氧化物酶同工酶的测定　取培养 80h 、120h的胚芽各 1g(培养方法见 1.2.2),置
低温冰箱中固定 1h 后剪碎 , 放入预先冷却的研钵中 , 各加 2.5m l提取液(Tris5.98g ,
1NHCL48ml ,加水至 100ml ,PH6.7)于 4℃下匀浆 。匀浆液以 12 000×g 0℃下离心 15min。
上清液用作电泳样品及酶活测定。
过氧化物酶活性的测定参照袁朝兴和丁静[ 4]的方法。
同工酶的聚丙烯酰胺圆盘电泳参照文献[ 5] 。用醋酸联苯胺染色法显色[ 5] 。
2　结果与讨论
2.1　人工气候箱的发芽势和发芽率
表 1 离子注入对豌豆种子发芽率 、发芽势的影响
Table 1 Effect of ion implantation on germination capacity of seed
处理时间/ min 0 5 10 20 30 35
发芽势
germination
capacity
绝对值
absolute value
76.7 60.0 46.7＊＊ 26.7＊＊ 43.3＊＊ 3.3＊＊
相当 ck/ %
balance ck
100 78.2 60.9 34.8 56.5 4.3＊＊
发芽率
germination rate
100 93.3 76.7 66.7 50＊＊ 10＊＊
　　注 ＊、＊＊分别表示与对照差异达 0.05 和 0.01 显著水平。下同。
离子注入后 ,各处理组发芽率和发芽势与对照组相比均有明显的降低 ,降低程度与注入
时间有关(表 1)。即最初随离子注入时间的增加 ,发芽率逐渐下降 ,在注入时间 20min 时 ,
发芽率是一个低谷期 ,之后随注入时间增加 ,发芽率又有所回升 。这与注入离子的相对浓度
随注入时间的增加而增加 ,在注入时间为 20min时 ,离子的相对浓度达到最大 ,再后随注入
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时间的增加 ,离子的相对浓度减少[ 3]相吻合 。这结果完全符合低能离子生物学中 ,发芽率
与剂量响应为一条先降后升再降的曲线 ,它既反映了低能离子在生物体中的能量沉积 ,又顾
及了质量沉积的因素[ 2] 。发芽势 、发芽率下降趋势相似 ,这预示等离子体浸没离子注入方
式确实损伤了种子的萌发能力 ,损伤程度与注入时间有关。各处理组与对照比 ,发芽率的差
异小于发芽势 ,说明种子在发芽过程中有滞后现象 。
2.2　田间出苗情况
表 2 田间出苗情况
Table 2 Field sprouting character
处理时间/ min
0 5 10 20 30 35
第 6天出苗率/ %
Six th day s sprouting 40 20 13.3＊ 6.7＊＊ 13.3＊ 3.3＊＊
第 8天出苗率/ %
Eighth day s sprouting 93.3 73.3 70.0 43.3＊＊ 50＊ 6.6＊＊
出苗率/ %
Sprouting rate
93.3 86.7 83.3 50＊ 56.7＊ 10＊＊
成苗率/ %
Survival ra te
93.3 86.7 73.3 50＊ 53.3＊ 7＊＊
相当 ck/ %
Balance ra te
100 92.9 78.6 53.6 57.1 7.5
全苗时间/d
Whole sprouting
8 12 10 10 10 8
田间出苗情况直接反映了离子注入对种子萌发能力影响的程度 。表 2知:第 6天出苗
率各处理组均明显低于对照 ,仅是对照的 50%或更低 。第 8天各处理组出苗率有所提高 ,
但出苗总体呈滞后现象 ,滞后时间为 2 ～ 4天 ,这和发芽率相符。
各处理组成苗率均低于对照 ,随处理时间增加 ,降低的幅度也加大 ,这一点与传统的离
子注入所得结果是一致的 。出苗率与发芽率下降趋势相似 , 20min时是低谷期 ,30min时有
所回升 。出苗率略低于发芽率 ,这是因田间出苗既受离子注入的影响 ,又受生长环境的影
响;也说明田间调查是准确的;同时也说明发芽率在一定程度上反映了各处理组被离子注入
后的损伤程度。20分钟为半致死剂量 。
2.3　生育期情况
2.3.1　开花　开花时间是计算出播种至每株第一朵花开花所需天数 。表 3表明:各处理组
各株第一朵花开花所需的平均天数均比对照组长 ,延长 2.7 ～ 11.3 天。除处理 35分钟外 ,
各组与对照比 ,显得变幅很宽 ,极差也增大 ,以处理 20分钟尤为显著 。处理 5 分钟的 ,最早
开花的一株所需天数比对照最早开花的提前 14天 ,而最晚开花的比对照延迟 6 天。处理
20分钟的最晚开花一株比对照相应的延迟 9天 。在相同的生长发育环境下 ,在不同的处理
组中重复出现较广突变谱的这类变异 ,预示等离子体浸没离子注入造成了植物体生理代谢 、
发育过程发生改变。这一点与传统的离子注入结果一样[ 6] 。处理 35分钟因注入剂量过大 ,
极严重抑制了出苗 ,从而减少了开花等生长过程中再次出现的差异。
4294 期　　　　　　杜兰芳等:等离子体浸没 N+注入豌豆种子的生长发育效应初报
表 3 离子注入对第一朵开花时间影响
Table 3 Effect of ion implatation to the first flower
处理时间/ min 0 5 10 20 30 35
第一朵开花所需时间/ d
First flower
48 34＊ 49 40 50 63＊
x(d) 52.7 56.3 58.3 55.4 57.5 64
变动范围/d
Change range
48 ～ 59 34～ 65 49～ 65 40～ 68 50～ 61 63 ～ 65
s 3.75 9.45 4.68 9.2 5.36 1.41
c.v 7.12 16.79 8.03 16.28 9.32 2.20
表 4 离子注入对株高 、分节的影响
Table 4 Effect of ion implatation to the plant high and branch
处理时间/ min 0 5 10 20 30 35
株高 x cm
Plant height
156.33 127.17＊＊ 155.74 144.71＊ 144.07＊ 152
变异范围
Change range
113 ～ 200 62 ～ 172 100～ 189 65～ 184 85～ 182 139 ～ 165
s 24.07 34.83 23.16 32.21 29.46 18.38
c.v 15.4 27.39 14.87 22.26 20.45 12.09
节数 x
Joint numbers
28.7 27.28 28.68 27.29 28.61 30
变异范围
Change range
21 ～ 35 17～ 32 21～ 33 17～ 34 25～ 32 29 ～ 31
s 3.6 4.53 3.35 5.14 2.49 1.41
c.v 12.54 16.61 11.29 18.83 8.67 4.7
2.3.2　株高 、分节 　株高是低能离子生物效应中所注意的形态学指标之一 。它反映了离
子注入影响的程度。在 6月 10日收获时 ,对株高 、分节等性状调查(表 4)表明:各组平均株
高均比对照降低 ,处理 5min中有两株的高度为 62cm ,几乎是对照的一半高 ,所以处理 5min
的平均高度比对照低 29.16cm ,经 t 检验差异极显著 。20min中最矮植株也仅 65cm 。在不
同注入剂量中超矮植株多次重复出现 ,且最高的也均低于对照的 11 ～ 35cm ,所以可排除生
长环境造成之因 ,认为是由于等离子体浸没离子注入使生长受到抑制降低了株高。
各处理组的平均节数均低于对照组 ,这一结果与株高相印证 。各剂量间差异不显著 。
株高的参差不齐 ,生育期和育性变幅宽 ,极差也大 ,这些现象是典型的遗传变异的特
征[ 1] 。
2.3.3　结荚 、籽粒 　表 5可知:离子注入降低了结荚数 ,有效荚数的比例也下降 ,5min因
两株超矮株每株仅结 3荚 ,所以降低了平均数 。但处理 5min的每荚粒数比对照多 0.17 ,
20min的千粒重比对照多 8.9克 ,这样补偿了结荚数下降的不足 。这也许是改良品种的有
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效途径之一。
2.4　离子注入对种苗过氧化物酶同工酶的影响
图 1　过氧化物酶同工酶电泳扫描图
Fig.1 Peroxidanse iso zyme electrophoresis sco anning
离子注入后 ,引起过氧化物酶同工酶的活
性 、数量和迁移率发生明显变化(图 1).且随注
入时间的不同而异 。在阴极端酶带数增多 ,在
阳极端酶带数趋于减少 。注入时间 5min时 ,酶
活性在阴极端显著增强 。注入时间 20min ,阳
极区酶带出现活性高峰 。30 、35min在阴极端
有拖带现象 , 35min尤为显著 。
图 1为电泳图谱光密度扫描图像 。取同一
基线 ———亮度为 0 处 ,对曲线峰值进行自动积
分 ,得到表 6 。
表 5 离子注入对结荚 、籽粒的影响
Table 5 Effect of ion implatation to the fruit character
处理时间/ min 0 5 10 20 30 35
株荚数 x
Pods
15.81 6.33＊＊ 7.58＊＊ 9.18＊＊ 9.93＊ 15
株有效荚数 x
Effective pods
13.78 4.56＊＊ 6.26＊＊ 6.82＊＊ 8.29＊＊ 11
有效荚占总荚 的百分比/ %
Effective pods w hole pods
87.16 72.04 82.59 74.29 83.48 73.33
荚粒数 x
Pod s numbers 3.98 4.15 3.74 3.47 3.8 3.59
千粒重/ g
Kilopod w eight
120.1 100.7 101.7 129.0 122.3 101.9
表 6 过氧化物酶同工酶密度扫描比较
Table 6 Compare in density scanning of peroxidas isozymes
注入时间/mim 0 5 10 20 30 35
灰 度 值
Gray scale
194　573 424　393 288　568 389　383 489　041 565　318
灰度值反映酶的总含量。它既反映了酶带的深浅 ,又反映了酶带的数量 、宽窄等现象。
从表 6可知 ,酶的总量随离子注入时间不同而发生变化 。注入时间 5min时 ,出现一高峰 ,在
10min时有较大的回落 ,而 20min 时又开始回升 ,30 、35min时 ,酶的总量迅速增大 ,并超过
前面各注入剂量 ,这是由于酶带深且拖带现象所致 。
过氧化物酶在植物体内广泛分布 ,参与各种生理活动 ,在不同组织和不同发育期过氧化
物酶同工酶的数量和活性有所不同 ,但在同一组织和同一发育期是相对稳定的 。经离子注
入豌豆种子后 ,种苗的过氧化物酶同工酶表现出明显的差异 ,这种差异反映出离子注入能在
生化水平上所产生的影响 。而离子注入时间 35min时同工酶的重大变化 ,极低的成苗率 ,则
4314 期　　　　　　杜兰芳等:等离子体浸没 N+注入豌豆种子的生长发育效应初报
进一步印证了注入离子与生物分子之间可能存在的质量沉积作用[ 1 ,2] 。
3　讨 　论
3.1　本实验结果初步表明:等离子体浸没离子注入方式 ,使种苗的过氧化物酶同工酶发生
变化;使种子的萌发率下降 ,出苗呈滞后现象 ,并诱发当代产生广泛的变异群体 ,为改良品种
提供了丰富的材料 ,这和传统的离子注入方式一样。但它具有方法简单 、成本低廉等优
点[ 3] 。它不需要特意固定种子的位置 ,而是在真空室内通过激发的等离子体中形成的大量
的正 、负离子从各个方向击向种子表面进行氮离子注入 ,这样离子对种子表面的作用也比较
均匀一致[ 3] 。所以 ,作为一种诱变育种方法 ,必定会有较大的发展前途。
3.2　适宜的诱变剂量与诱变效果密切相关 ,一般多以半致死剂量作为引变敏感性的指标。
本试验虽初步测得了半致死剂量 ,但综合考虑诱变结果 ,处理 5分钟的株高 、开花时间 、荚粒
数等变异(表 1 ～ 5)明显优于半致死剂量 ,而处理 20分钟的千粒重明显高于 5分钟 ,所以哪
一剂量是较佳的诱变剂量还有待初选材料在后代中验证。
参　　考　　文　　献
1.余增亮.低能离子生物学.科学前沿 , 1993 ,(4):36～ 38
2.余增亮 ,霍裕平.离子注入生物学研究述评.安徽农业大学学报 , 1994 , 21(3):221 ～ 224
3.吴美萍 ,何国兴 , 钟华等.等离子体浸没离子注入豌豆种子的表面形态研究.上海农学院学报 , 1997 , 15
(3):182 ～ 185
4.袁朝兴 ,丁静.水分胁迫对棉花叶片中 IAA 含量 、IAA氧化酶和过氧化物酶活性的影响.植物生理学报 ,
1990 , 16(2):179 ～ 184
5.上海植物生理学会编.植物生理学实验手册.上海:上海科学技术出版社 , 1985
6.杨赞林 ,甘斌杰 , 金陵等.离子注入对小麦生长发育的效应.安徽农学院学报 , 1991 , 18(4):282～ 288
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