全 文 ：第 22 卷　第 4 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2002 年　10 月
Vol.22　No.4　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH Oct., 　2002
带有白花甜菜染色体片段的栽培甜菜易位系的筛选
韩晓云　康传红　郑天然　郭德栋　王桂芝
(黑龙江大学生命科学学院 , 哈尔滨　150080)
摘　要　本文采用斑点杂交方法 ,对近 100%传递的甜菜单体附加系 M14(2n=19)发生分离的后
代反转系(2n=18)进行研究 ,采用随机引物法标记白花甜菜特异探针 ,对 80株反转系进行杂交实
验 ,结果筛选出 19个 易位系 ,这 19个易位系有待于进一步研究 ,证明是否带有无融合生殖基因 。
关键词　无融合生殖基因;斑点杂交;易位系
SELECTION ON BETA VULGARIS L.TRANSLOCATION LINES WITH
THE FRAGMENTOF CHROMOSOME FROM BETA COROLLIFLORA ZOSS
HAN Xiao-yun　KANG Chuan-hong　ZHENG Tian-ran　GUO De-dong 　WANG Gui-zhi
(Life Science College ,Heilongjiang University ,Harbin 150080)
Abstract　This paper reported the DNA Dot-blo tting analyse on the progenies (2n=18), which
seperated f rom M 14(2n=19), the monosomic addi tion lines of Beta vulgaris w ith high transmission
rate near100%.The probe1054 w as labeled w ith DIG Random Primed DNA Labeling method.Among
total 80 progenies ,19 were proved to be translocation line w ith the fragment of chromosome from Be-
ta corolli f lora .Further study are needed to confirm if these translocation lines have apomix is genes.
Key words　apomixis gene ;dot-blotting ;t ranslocat ion line
　　无融合生殖是指不经过雌雄配子的结合 ,而通
过种子进行的繁殖方式 。其后代遗传上与母体精
确相同 ,是一种自然的克隆。无融合生殖一直备受
生物学家的关注 ,找到无融合生殖基因 ,实现栽培
植物无融合生产 ,具有极其重要的意义 。
Barocka等[ 2]报道甜菜属野生种中存在无融合
生殖现象 。Jassem 等[ 3]证实栽培甜菜与野生种具
有无融合生殖现象的多倍体杂交 ,可以产生具有无
融合生殖的后代类型。郭德栋等[ 4～ 6]通过栽培甜
菜 (Beta vulgaris L.)和 野 生 种 甜 菜
(B.corolli f lora Zoss)种间杂交及回交 ,获得了带
有白花甜菜染色体的单体附加系(VV+1C , 2n=
19), 其中发现了高频传递的特异单体附加系
M14 ,经过四代传递分析 ,平均传递率达 95%以
上 ,被判定其外加白花甜菜染色体带有无融合生殖
基因 。这是首次将无融合生殖基因导入二倍体并
高效表达 ,为克隆无融合生殖基因提供了重要的基
础。高东杰等[ 7 ,8] 报道了 9 个白花甜菜特异重复
序列 ,并使用这些序列为探针 ,进行Sourthern杂交
及 FISH ,将这些单体附加系分类为 11种类型 ,其
中 8个类型是附加整条染色体 ,另外 3种类型是附
加白花甜菜的染色体片段。
此研究为国家 863计划(863-101-04-01-07)资助
第一作者简介:韩晓云 ,女(1970-),讲师 ,主要从事分子生物学及发酵工程方面的教学及研究工作
收稿日期:2001-02-16
常规的克隆基因的方法主要是通过构建重组
图谱来实现 ,对无融合生殖基因不适用 。德国吉尔
大学 Daguang Cai等[ 9] 通过栽培甜菜与具有抗线
虫基因的野生甜菜杂交及回交 ,得到带有野生甜菜
(B.procumbens)染色体片段的易位系(2n=18),
这些易位系具有抗线虫特性 ,因而 ,他们利用野生
种甜菜(B.procombens)的特异卫星序列为探针 ,
成功地从易位系中克隆了甜菜抗线虫基因。
本实验是以白花甜菜特异重复序列为探针 ,对
从 95%以上高频传递的单体附加系中分离出来的
少量二倍体植株进行 DNA 分子杂交 ,目地是筛选
出带有白花甜菜染色体片段的栽培甜菜易位系 ,如
果在这些易位系中能够找到具有无融合生殖特性
的易位系 ,将会大大缩短克隆无融合生殖基因的进
程。
1　材料和方法
1.1　实验材料
实验所用的近 100%传递的带有白花甜菜染
色体的栽培甜菜单体附加系 M14反转系 80 株 ,以
及阳性对照 M14 ,阴性对照栽培甜菜均采自黑龙
江大学生物工程系实验基地 。白花甜菜特异探针
为德国吉尔大学高东杰博士提供。
1.2　实验方法
1.2.1甜菜基因组 DNA的提取
取甜菜幼嫩叶片 1 cm2 左右 ,放入 1.5 mL 离
心管中 ,用磨面尖头玻璃棒研碎 ,加入 0.7 mL 裂
解液混匀 , 于 55℃温育 3 ～ 4 小时 。用等体积的
Tris饱和酚 、酚-氯仿(25:24)及氯仿各抽提一次 ,
最后用 100%无水乙醇沉淀 ,70%乙醇洗一次 ,沉
淀溶于 20μL TE缓冲液。
1.2.2　白花甜菜特异探针的制备和标记
1.2.2.1　探针制备
质粒 DNA 提取按照《 分子克隆实验指南》中
所述方法进行。含有白花甜菜特异探针的重组质
粒pBluescript用限制性内切酶 XbaI ,EcoRI双酶切
2小时 ,酶切片段在 1%琼脂糖凝胶上电泳分离 ,将
目的片段回收并纯化 。酶切及纯化步骤均按照产
品说明书操作。
1.2.2.2　探针的标记与检测
按照 GIG Labelling Kit使用说明书 ,用随机引
物法对探针进行标记 ,标记效率检测按照 DIG De-
tection Kit说明书进行 。
1.2.3　斑点杂交
1.2.3.1 吸印
将提取的甜菜 M14反转系 DNA 以及阳性对
照M14 、阴性对照栽培甜菜 DNA 各取 2 μL 点在
尼龙膜(HybondN+)上 ,80℃烘烤 1 h。
1.2.3.2　杂交
将膜放入杂交袋中 ,加入预热至 68℃的预杂
交液 10 mL ,封口 ,68℃预杂交 1 小时。将杂交袋
剪一小口 ,倒出预杂交液 ,加入含有白花甜菜特异
探针的杂交液 , 65℃杂交 12 ～ 16 h。杂交后膜在
2xSSC中洗 2次 ,再用 1xSSC 洗 2次。
1.2.3.3　显色
显色步骤按照地高辛检测试剂盒说明书 ,先用
封闭液处理 30 分钟 ,再加入抗体溶液处理 30 分
钟 ,漂洗液冲洗后加入显色液于暗处显色 4 ～ 16小
时 ,加入 TE 缓冲液终止反应。
图 1　甜菜基因组 DNA 电泳结果
Fig.1　The result of beet genome DNA
1.DNA 100bp ladder (其分子量从大至小分别为:3000bp ,
2000bp , 1500bp , 1200bp , 1000bp , 900bp , 800bp , 700bp , 600bp ,
500bp ,400bp , 300bp , 200bp, 100bp)2 ～ 7.M14 反转系基因组
DNA
1.DNA 100bp ladder , (Molecular marker :3000bp , 2000bp ,
1500bp , 1200bp , 1000bp , 900bp , 800bp , 700bp, 600bp , 500bp ,
400bp , 300bp, 200bp , 100bp)2～ 7.genome DNA of progenies(2n
=18)f rom M 14
2　结果分析
2.1　基因组 DNA提取结果:
取 DNA 溶液加于 0.8%琼脂糖凝胶上电泳检
测。检测结果见图 1:2 ～ 7 泳道上端有 DNA 条
带 ,用 DNA Gel Analyse分析浓度为 0.2 μg/μL ～
0.5 μg/μL ,在斑点杂交点样时根据浓度不同进行
调整 ,使 DNA的点样量一致 。
2.2　质粒提取结果:
图 2 所示电泳检测结果表明:提取的质粒
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图 2　重组质粒提取结果
Fig.2　Results of isolating Plasmid DNA
1.DNA100bp ladder　2～ 3.为质粒 DNA
1.DNA 100bp ladder 2～ 3.Plasmid DNA
图 3　探针 1054 制备结果
Fig.3　Results of preparing Probe 1054
1.DNA 100bp ladder , 2～ 3.纯化后探针 1054片段
1.DNA 100bp ladder , 2～ 3.Purif ied Probe 1054 f ragment
图 4　探针标记效率的检测结果
Fig.4　The efficency of labeled probe DNA
A.探针 1054标记检测结果, B.DIG 标记试剂盒提供 La-
beled Cont rol , C.Unlabeled Cont rol 。 1 、2 、3 、4 、5 、6 分别为稀释
后 DNA浓度为 1ng , 10pg , 3pg , 1pg , 0.3pg , 0.1pg
A.The ef ficency of labeled probe DNA , B.Labeled control
surplied by DIG labeling ki t.C.Unlabeled cont rol surplied by DIG
labeling ki t.1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 represented for DNA diluted concentra-
tion 1ng , 10pg , 3pg , 1pg , 0.3pg , 0.1pg.
DNA的片段与预计片段长度 3.4Kb相一致 。
2.3　探针制备结果:
图3所示 2 ～ 3泳道在 500bp ～ 600bp 之间有
一DNA片段 ,和白花甜菜特异探针 1054 的长度
(554bp)一致。
2.4　探针标记及检测结果:
从图 4 中可见:探针 1054 与 Labeled Control
和 Unlabeled Control对比 ,其 A3 、A4信号稍强于
B3和 C3 ,因此根据稀释浓度判断探针 1054 的总
标记效率高于 500ng 。
2.5　斑点杂交结果
从图 5可见:阳性对照 M14和探针 1054有信
号出现 ,阴性对照栽培甜菜没有信号 ,和预期一致 。
在 M14反转系中 ,共有 19株呈现阳性信号。其中
A1 、A2 、A5 、B5 、B6 、D1 、D2 、E1 、E3 、E4 呈现较强信
号 ,而A3 、A4 、B2 、B3 、B4 、C5 、D5 、E2 、E5呈现较弱
信号 。重复实验得到相同结果 ,根据实验结果判断
以上 19 株 M14 反转系 带有白花甜菜染色体片
段 ,为易位系 。
图 5　斑点杂交结果
Fig.5　The result of Do t-blotting
A7.阳性对照探针 1054 , B7.阴性对照栽培甜菜 , C 7.阳
性对照 M14 ,其它为 M14反转系
A7.Posi tive control probe 1054 , B7.Negative cont rol Beta
v ulgaris ,C 7.Posi tive control M14 , T he others are the progenies of
M14
3　讨论
本研究选择了 M14反转系 80株进行 DNA杂
交筛选 ,结果有 19株呈现阳性信号 ,经过重复实验
得到相同结果 ,鉴定为易位系或代换系 。在今后的
实验中 ,可以用 FISH 技术 ,将基因片段定位 ,即可
鉴定易位系和代换系。所得结果中 ,杂交信号强弱
有所不同 ,由于探针 1054为散在重复序列 ,分析可
能与易位片段的长短有关。我们还要对筛选出的
易位系进行田间杂交 ,以显性性状为标记 ,如果其
后代与母本保持一致 ,证明易位系中含有无融合生
殖基因 ,从而可以缩短克隆无融合生殖基因的范
围。
4614 期　　　　　　　　　　　韩晓云等:带有白花甜菜染色体片段的栽培甜菜易位系的筛选
参　考　文　献
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462 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　22 卷